燈盞花素納米晶的制備及質(zhì)量評(píng)價(jià)

劉柳毅 溫璐平 許男徽 李慶國(guó)

摘 要 目的：制備燈盞花素（BRE）納米晶，并對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。方法：采用介質(zhì)研磨法制備BRE納米晶混懸液，以其粒徑和多分散系數(shù)（PDI）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)研磨介質(zhì)的直徑和用量、研磨時(shí)間、穩(wěn)定劑種類和比例、BRE比例進(jìn)行考察，篩選最優(yōu)工藝和處方;以BRE納米晶形態(tài)、色澤、粒徑和PDI為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)加不同種類凍干保護(hù)劑（5%甘露醇、5%葡萄糖、5%乳糖）和不加凍干保護(hù)劑進(jìn)行考察，篩選最優(yōu)凍干保護(hù)劑;采用粒度分析儀、掃描電鏡、X-射線粉末衍射法（XRPD）、差示掃描量熱法（DSC）對(duì)以最優(yōu)工藝和處方所制備的BRE納米晶進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。結(jié)果：BRE納米晶最優(yōu)工藝及處方為氧化鋯珠粒徑0.6 mm、用量450 g，研磨時(shí)間為1 h，穩(wěn)定劑為15%吐溫80，BRE比例為25%，不添加凍干保護(hù)劑。所制得的BRE納米晶為質(zhì)地疏松、色澤均勻的黃色粉末，平均粒徑為（283.10±3.08） nm，平均PDI為0.212±0.021，平均Zeta電位為（-38.48±0.39） mV;其為棒狀晶型，分布均一且晶型穩(wěn)定;20 min內(nèi)累積溶出度為（90.37±1.22）%;在溫度（40±2） ℃、相對(duì)濕度（75±5）%條件下，避光放置3個(gè)月后穩(wěn)定性良好。結(jié)論：BRE納米晶的制備方法簡(jiǎn)單、可行，且所制得的BRE納米晶穩(wěn)定性、溶出度均良好。

關(guān)鍵詞 燈盞花素;納米晶;介質(zhì)研磨法;處方;工藝;質(zhì)量評(píng)價(jià)

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To prepare Breviscapine（BRE） nanocrystals， and to evaluate its quality. METHODS： BRE nanocrystal suspensions were prepared by media milling method. The diameter and amount of grinding beads， grinding time， type and ratio of stabilizer， BRE ratio were investigated to screen the optimal technology and formulation with particle size and polydispersity index （PDI） as evaluation indexes. Using morphology， color， particle size and PDI of BRE nanocrystals as evaluation index， different lyoprotectants （50% mannitol， 5% glucose， 5% lactose） and without lyoprotectant were investigated to screen the optimal lyoprotectant. Particle size analyzer， scanning electron microscope（SEM）， X-Ray diffraction （XRPD）， differential scanning calorimeter （DSC） were used to evaluate the quality of BRE nanocrystals which was prepared with the optimal technology and formulation. RESULTS： The optimal technology and formulation of BRE nanocrystals included that particle size of 0.6 mm zirconia beads with the amount of 450 g， grinding time of 1 h， stabilizer of 15% Tween-80， BRE ratio of 25%， without lyoprotectant. Prepared BRE nanocrystals were yellow powder with loose texture and uniform color. The average particle size of BRE nanocrystals was （283.10±3.08） nm， average PDI was （0.212±0.021） and average Zeta potential was （-38.48±0.39） mV. BRE nanocrystals were rod-like crystals， uniform in distribution and had no change in crystalline state. Accumulative dissolution of BRE nanocrystals were （90.37±1.22）% within 20 min. Under the condition of （40±2） ℃ temperature and （75±5）%? relative humidity， BRE nanocrystals remained stable after being kept away from light for 3 months. CONCLUSIONS： Established preparation method of BRE nanocrystals is simple and feasible. Prepared BRE nanocrystals show good stablility and dissolution.

KEYWORDS? ?Breviscapine; Nanocrystals; Media milling; Formulation; Technology; Quality evaluation

燈盞花素（BRE）是從燈盞花中提取的一類總黃酮，以野黃芩苷（又名燈盞乙素）為主要成分（占95%以上），是治療冠心病、腦血栓等心腦血管疾病的有效成分，廣泛應(yīng)用于臨床[1]。BRE屬于生物藥劑學(xué)第Ⅳ類藥物[2]，其水溶解性較差，在25 ℃水中的平衡溶解度約59 μg/mL[3];在小腸上皮細(xì)胞的滲透性較弱，口服生物利用度較低，例如犬口服BRE的絕對(duì)生物利用度僅為0.4%[4]，從而限制了其在臨床上的應(yīng)用。因此，研究BRE新的給藥系統(tǒng)，解決其生物利用度低的問題，已經(jīng)成為藥劑工作者的研究重點(diǎn)。

納米晶技術(shù)是近年來針對(duì)難溶性藥物開發(fā)的一種新劑型，該技術(shù)以少量表面活性劑或高分子材料作為穩(wěn)定劑，通過降低藥物粒徑至納米級(jí)來增加難溶性藥物的溶出度，從而提高藥物生物利用度[5]。佘佐彥等[6]采用自乳化溶劑擴(kuò)散法制備了BRE納米混懸劑，顯著提高了BRE在大鼠體內(nèi)的生物利用度并延長(zhǎng)了其作用時(shí)間。Yang X等[7]以野黃芩苷苷元作為前體化合物，采用反溶劑沉淀法制備了野黃芩苷苷元納米混懸劑，且在大鼠藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，野黃芩苷苷元納米混懸劑組的達(dá)峰時(shí)間和遲滯時(shí)間相比原料藥組顯著減少。由此可知，將BRE制備成納米制劑是可行的，但是這些研究所采用的方法存在一定局限性，如反溶劑沉淀法多用有機(jī)溶劑溶解藥物，其殘留的溶劑可能會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生副作用，且該方法要求藥物必須在能與水互溶的溶劑中溶解，但BRE不僅水溶性差，在非水介質(zhì)中也難以溶解[8]。介質(zhì)研磨法制備過程簡(jiǎn)單、不需要加入有機(jī)溶劑、適用范圍廣，且所制備的納米藥物的粒徑窄[9]?；诖?，本研究采用介質(zhì)研磨法制備BRE納米晶混懸液，以BRE粒徑和多分散系數(shù)（PDI）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，篩選其最優(yōu)工藝參數(shù)和處方;再經(jīng)冷凍干燥技術(shù)將其固化形成納米晶，并對(duì)其粒徑分布、形態(tài)、溶出度、穩(wěn)定性等進(jìn)行評(píng)價(jià)，以期為BRE納米晶后續(xù)研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Lyo-0.5型真空冷凍干燥機(jī)（上海東富龍科技股份有限公司）;KQ3200B型超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）;ACCELA型高效液相色譜系統(tǒng)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）;Zetasizer 1000 HSA型粒徑分析儀（英國(guó)Malvern公司）;Zeta PALS型粒度儀（美國(guó)Brookhaven儀器公司）;Merlin Compact型場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡（德國(guó)Zeiss公司）;D8Advance型X射線粉末衍射（XRPD）儀（德國(guó)Bruker公司）;DSC-60型差示掃描量熱（DSC）儀（日本Shimadzu公司）;KYC-100B型恒溫培養(yǎng)搖床（上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）;ZRS-8G型智能溶出度試驗(yàn)儀（天津市盛鑫通達(dá)科技有限公司）;立式砂磨機(jī)（沈陽化工研究院）。

1.2 藥品與試劑

BRE原料藥（珠海遠(yuǎn)城醫(yī)藥化工有限公司，批號(hào)：20180301，純度：95.30%）;野黃芩苷對(duì)照品（成都普菲德生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：20180204，純度：≥98%）;吐溫80（天津市福晨化學(xué)試劑廠，批號(hào)：20170822）;乳糖、十二烷基硫酸鈉（SDS）（天津市大茂化學(xué)試劑廠，批號(hào)：20170902、20170812）;泊洛沙姆（德國(guó)BASF公司，批號(hào)：WPCE565D）;聚維酮K30（PVPK30，安徽山河藥用輔料有限公司，批號(hào)：20170924）;葡萄糖（山東瑞泰化工有限公司，批號(hào)：20171124）;甘露醇（北京化學(xué)試劑廠，批號(hào)：20170823）;水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 BRE納米晶混懸液工藝參數(shù)考察

相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，研磨介質(zhì)的粒徑、用量以及研磨時(shí)間對(duì)納米晶制備工藝有一定的影響[10]，因此本研究選擇這幾個(gè)因素考察BRE納米晶混懸液的制備工藝。

2.1.1 研磨珠粒徑的篩選 稱取BRE原料藥7.5 g，置于含有吐溫80（1.125 g）的水溶液（22.5 mL）中，攪拌混懸，再加入不同粒徑（0.6、0.8、1.0、2.0 mm）的氧化鋯珠450 g，研磨1 h，分別制備3批BRE納米晶混懸液。以BRE納米晶混懸液的粒徑、PDI為指標(biāo)，篩選最優(yōu)研磨珠用量。結(jié)果，直徑為0.6 mm的氧化鋯珠所制備的BRE納米晶混懸液的粒徑和PDI較小，因此確定研磨珠粒徑為0.6 mm。研磨珠粒徑的篩選結(jié)果見圖1。

2.1.2 研磨珠用量的篩選 稱取BRE原料藥7.5 g，置于含有吐溫80（1.125 g）的水溶液（22.5 mL）中，攪拌混懸，再加入不同用量（390、420、450、480 g）的氧化鋯珠（粒徑為0.6 mm），研磨1 h，分別制備3批BRE納米晶混懸液。以BRE納米晶混懸液的粒徑、PDI為指標(biāo)，篩選最優(yōu)研磨珠用量。結(jié)果，隨著氧化鋯珠用量的增加，BRE納米晶混懸液的粒徑、PDI逐漸減小;但氧化鋯珠用量增加到一定程度時(shí)，BRE納米晶混懸液的粒徑、PDI反而增加，因此確定氧化鋯珠的用量為450 g。研磨珠用量的篩選結(jié)果見圖2。

2.1.3 研磨時(shí)間的篩選 稱取BRE原料藥7.5 g，置于含有吐溫80（1.125 g）的水溶液（22.5 mL）中，攪拌混懸，加入氧化鋯珠（粒徑為0.6 mm）450 g，分別研磨0.5、0.75、1.0、1.5 h，制備3批BRE納米晶混懸液。以BRE納米晶混懸液的粒徑、PDI為指標(biāo)，篩選最優(yōu)研磨時(shí)間。結(jié)果，隨著研磨時(shí)間的延長(zhǎng)，BRE納米晶混懸液的粒徑、PDI逐漸減小;研磨0.5、0.75、1.0 h時(shí)，BRE納米晶混懸液的粒徑、PDI減小的幅度較大;研磨1.5 h時(shí)，BRE納米晶混懸液粒徑雖然較研磨1.0 h時(shí)的粒徑減小，但減小幅度不大。綜合考慮能耗和時(shí)間，確定研磨時(shí)間為1 h。研磨時(shí)間的篩選結(jié)果見圖3。

2.2 BRE納米晶混懸液的處方考察

相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，將難溶性藥物研磨成納米級(jí)的粒子后，能產(chǎn)生較高的表面能，進(jìn)而導(dǎo)致粒子的粒徑增加，失去納米晶藥物特有的物理、化學(xué)優(yōu)勢(shì)[11]。因此，常使用穩(wěn)定劑包裹在粒子的表面，防止粒子的聚集。常用的穩(wěn)定劑包括表面活性劑和高分子聚合物兩大類。本研究選擇非離子型表面活性劑泊洛沙姆、吐溫80和陰離子型表面活性劑SDS以及高分子聚合物PVPK30作為穩(wěn)定劑進(jìn)行篩選。

2.2.1 穩(wěn)定劑種類和比例的篩選 稱取BRE原料藥7.5 g若干份，分別置于含有8%、12%、15%、18%不同穩(wěn)定劑（泊洛沙姆、吐溫80、SDS、PVPK30）的水溶液（22.5 mL）中，攪拌混懸，加入氧化鋯珠（粒徑為0.6 mm）450 g，研磨1 h，分別制備3批BRE納米晶混懸液。以BRE納米晶混懸液的粒徑、PDI為指標(biāo)，篩選最優(yōu)穩(wěn)定劑種類和比例。另外，為了充分比較穩(wěn)定劑種類和比例對(duì)BRE納米晶混懸液穩(wěn)定性的影響，筆者還考察了將其避光放置7 d后的粒徑、PDI情況。結(jié)果，15% 吐溫80和15% SDS作為穩(wěn)定劑所制得的BRE納米晶混懸液放置0、7 d的粒徑變化不大，穩(wěn)定效果較好;由于SDS在研磨過程中會(huì)產(chǎn)生大量泡沫，影響藥物的回收，因此確定穩(wěn)定劑為15%吐溫80。穩(wěn)定劑種類和比例的篩選結(jié)果見圖4、圖5。

2.2.2 BRE比例的篩選 分別稱取BRE原料藥4.5、6、7.5、9 g（在BRE納米晶混懸液中的比例分別為15%、20%、25%、30%），分別置于含有15% 吐溫80的水溶液（水用量分別為25.5、24.0、22.5、21.0 mL）中，攪拌混懸，加入氧化鋯珠（粒徑為0.6 mm）450 g，研磨1 h，分別制備3批BRE納米晶混懸液。以BRE納米晶混懸液的粒徑、PDI為指標(biāo)，篩選最優(yōu)BRE比例。結(jié)果，隨BRE比例的增加，BRE納米晶混懸液的粒徑和PDI均先逐漸減少后逐漸增大;當(dāng)BRE比例為25%時(shí)，BRE納米晶混懸液的粒徑和PDI最小，因此確定BRE比例為25%。BRE比例的篩選結(jié)果見圖6。

2.2.3 BRE納米晶混懸液的處方工藝驗(yàn)證 取BRE原料藥7.5 g（在BRE納米晶混懸液中的比例為25%），置于含有15% 吐溫80的水溶液（22.5 mL）中，攪拌混懸，加入氧化鋯珠（粒徑為0.6 mm）450 g，研磨1 h，平行制備3批BRE納米晶混懸液，并測(cè)定其粒徑和PDI。結(jié)果，BRE納米晶混懸液的平均粒徑為（278.03±4.85） nm，平均PDI為0.192±0.012。

2.3 BRE納米晶凍干工藝考察

以BRE納米晶凍干前后體積變化不大，凍干后不皺縮、無塌陷，色澤均勻、無花斑，有韌性，輕輕捻磨即成粉狀，加原體積的水可迅速恢復(fù)至凍干前狀態(tài)，且粒徑和PDI與混懸液狀態(tài)所測(cè)結(jié)果無顯著性差異為其凍干工藝合格的篩選標(biāo)準(zhǔn)[12]。

2.3.1 凍干保護(hù)劑種類的篩選 取“2.2.3”項(xiàng)下制得的BRE納米晶混懸液15 mL，分別加入凍干保護(hù)劑5%甘露醇、5%葡萄糖、5%乳糖各0.75 g，同時(shí)考察不加入凍干劑的情況（不需振搖），振搖使其溶解均勻，分裝于25 mL西林瓶中，于-40 ℃條件下預(yù)凍5 h后，加熱升溫至-20 ℃，維持此溫度20 h后，加熱升溫至20 ℃，并維持此溫度5 h，即得BRE納米晶。觀察所制BRE納米晶的外觀，并取適量以水溶解后，測(cè)定其粒徑和PDI。平行試驗(yàn)3次，以篩選凍干保護(hù)劑種類。結(jié)果，加入凍干保護(hù)劑和不加凍干保護(hù)劑對(duì)BRE粒徑和PDI的影響差異不大，因此，選擇不加凍干保護(hù)劑。凍干保護(hù)劑的篩選結(jié)果見表1。

2.3.2 BRE納米晶凍干工藝驗(yàn)證 取“2.2.3”項(xiàng)下制得的BRE納米晶混懸液15 mL，分裝于25 mL西林瓶中，按“2.3.1”項(xiàng)下“于-40 ℃條件下預(yù)凍5 h后……并維持此溫度5 h”的步驟操作，平行制備3批BRE納米晶。觀察所制BRE納米晶的外觀，并取適量水溶解后，測(cè)定其粒徑和PDI。結(jié)果，BRE納米晶混懸液凍干后不皺縮、無塌陷，色澤均勻、無花斑，平均粒徑為（283.09±3.51）nm，平均PDI為0.212±0.017。

2.4 BRE納米晶中野黃芩苷含量測(cè)定方法的建立

2.4.1 色譜條件 色譜柱為Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動(dòng)相為甲醇-0.1%甲酸水溶液（60 ∶ 40，? ?V/V）;檢測(cè)波長(zhǎng)為335 nm;流速為900 mL/min;柱溫為35 ℃;進(jìn)樣量為10 μL。

2.4.2 野黃芩苷對(duì)照品溶液制備 精密稱取野黃芩苷對(duì)照品10 mg于25 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，制成質(zhì)量濃度為400 μg/mL的對(duì)照品貯備液;精密吸取750? μL對(duì)照品貯備液于5 mL量瓶中，加甲醇制成質(zhì)量濃度為60 μg/mL的野黃芩苷對(duì)照品溶液。

2.4.3 供試品溶液制備 精密稱取“2.3.2”項(xiàng)下制備的BRE納米晶15 mg（相當(dāng)于含BRE 10 mg），參照2015年版《中國(guó)藥典》（四部）中溶出度測(cè)定第三法（小杯法）[13]，以200 mL水作為溶出介質(zhì)，設(shè)置水溫為（37±0.5） ℃、轉(zhuǎn)速為35 r/min，于投樣后60 min取樣3 mL，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4.4 空白輔料溶液 按“2.2.3”項(xiàng)下處方比例和方法制備無BRE的空白輔料混懸溶液，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備無BRE的空白納米晶，再按“2.4.3”項(xiàng)下方法制備空白輔料溶液。

2.4.5 專屬性考察 取上述野黃芩苷對(duì)照品溶液、供試品溶液、空白輔料溶液，按照“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。結(jié)果，野黃芩苷的峰形對(duì)稱，且空白輔料對(duì)其色譜峰無干擾，表明方法專屬性良好。色譜圖見圖7。

2.4.6 線性關(guān)系考察 分別精密量取“2.4.2”項(xiàng)下野黃芩苷對(duì)照品貯備液0.06、0.125、0.25、0.75、1.00、1.25 mL至5 mL量瓶中，加甲醇稀釋制成質(zhì)量濃度分別為4.8、10、20、60、80、100 μg/mL的系列線性溶液，用0.45 μm微孔濾膜濾過后，取續(xù)濾液，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積。以野黃芩苷質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x，? ? ?μg/mL）、峰面積為縱坐標(biāo)（y）進(jìn)行回歸分析，得回歸方程為y=21 485x-25 461（r=0.999 6），表明野黃芩苷質(zhì)量濃度線性范圍為4.8～100 μg/mL。

2.4.7 檢測(cè)限與定量限考察 取“2.4.6”項(xiàng)下制備的質(zhì)量濃度為4.8 μg/mL的野黃芩苷對(duì)照品溶液適量，用甲醇倍比稀釋，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，以信噪比3 ∶ 1、10 ∶ 1分別計(jì)算檢測(cè)限和定量限。結(jié)果，野黃芩苷的檢測(cè)限為0.066 8 μg/mL，定量限為0.131 5 μg/mL。

2.4.8 精密度試驗(yàn) 取“2.4.6”項(xiàng)下制備的質(zhì)量濃度為60 μg/mL野黃芩苷對(duì)照品溶液適量，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果，野黃芩苷峰面積的RSD為1.49%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.4.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.4.3”項(xiàng)下供試品溶液適量，于室溫放置0、2、4、6、8 h后，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積。結(jié)果，野黃芩苷峰面積的RSD為0.71%（n=5），表明供試品溶液在室溫放置8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.10 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知野黃芩苷含量的BRE納米晶3 mg，置于100 mL量瓶中，分別精密加入野黃芩苷對(duì)照品貯備液5 mL，加水稀釋至刻度，然后用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液，平行制備6份，再按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果，野黃芩苷的平均加樣回收率為100.15%（RSD=1.83%，n=6），表明方法準(zhǔn)確度良好。加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果見表2。

2.5 BRE納米晶的質(zhì)量評(píng)價(jià)

2.5.1 粒徑和PDI的測(cè)定 取“2.3.2”項(xiàng)下制備的BRE納米晶樣品適量，加水溶解，采用粒度儀測(cè)定其粒徑、PDI，平行測(cè)定3次。結(jié)果，BRE納米晶的平均粒徑為（283.10±3.08） nm，平均PDI為0.212±0.021，且粒徑分布較窄、呈正態(tài)分布，詳見圖8。

2.5.2 Zeta電位測(cè)定 取“2.3.2”項(xiàng)下制備的BRE納米晶樣品適量，加水溶解，采用粒度儀測(cè)定其Zeta電位，平行測(cè)定3次。結(jié)果，BRE納米晶的平均Zeta電位為（-38.48±0.39） mV。

2.5.3 掃描電鏡觀察 取適量BRE原料藥和“2.3.2”項(xiàng)下制備的BRE納米晶預(yù)先進(jìn)行真空噴金處理，再采用掃描電鏡觀察兩者的表面和晶體結(jié)構(gòu)。結(jié)果，BRE原料藥主要以針狀結(jié)構(gòu)存在，BRE納米晶主要以棒狀結(jié)構(gòu)存在，詳見圖9。

2.5.4 DSC分析 分別取“2.3.2”項(xiàng)下制備的BRE納米晶、吐溫80、BRE原料藥各5 mg，進(jìn)行DSC分析。設(shè)置氣氛為干燥空氣，溫度范圍為30～350 ℃，升溫速率為10 ℃/min，三氧化二鋁為參比物。結(jié)果，BRE原料藥在136.96、210.79 ℃處有吸熱峰，在213.6 ℃處有放熱峰;吐溫80的DSC曲線沒有吸熱、放熱峰，表明其為無定形狀態(tài);BRE納米晶在131.83、198.55 ℃處有吸熱峰，在202.27 ℃處有放熱峰，表明BRE納米晶仍以晶體形式存在，且晶體形態(tài)沒有發(fā)生改變，詳見圖10。根據(jù)Vant Hoff方程可知，當(dāng)物質(zhì)中有微量雜質(zhì)存在時(shí)，其熔點(diǎn)會(huì)降低、熔距會(huì)變寬[14]，而本研究所制備的BRE納米晶表面由于吸附有吐溫80，所以其吸熱、放熱峰均提前，熔距變寬。

2.5.5 XRPD分析 分別取BRE原料藥和“2.3.2”項(xiàng)下制備的BRE納米晶適量，進(jìn)行XRPD分析。選擇Cu靶，設(shè)置管壓為40 kV、管流為40 mA、掃描速度為4°/min、 2 θ角掃描范圍為5°～40°。結(jié)果，BRE原料藥在10.10°、14.85°、15.93°、25.61°、26.86°有較強(qiáng)的衍射峰，BRE納米晶在對(duì)應(yīng)位置也有較強(qiáng)的衍射峰出現(xiàn)，表明BRE納米晶和原料藥具有相同的晶體形態(tài)，且無新的晶型出現(xiàn)，詳見圖11。由此可知，介質(zhì)研磨和冷凍干燥過程并未改變BRE的晶體形態(tài)。

2.5.6 BRE納米晶體外溶出度測(cè)定 參考2015年版《中國(guó)藥典》（四部）中溶出度測(cè)定第三法（小杯法）[13]進(jìn)行溶出度試驗(yàn)。精密稱取“2.3.2”項(xiàng)下制備的BRE納米晶、BRE物理混合物[稱取BRE原料藥7.5 g置于含有15%吐溫80的水溶液（22.5 mL）中，攪拌混懸，不進(jìn)行研磨，再按“2.3.2”項(xiàng)下凍干方法操作，即得]、BRE原料藥適量（均相當(dāng)于含野黃芩苷約10 mg），各3份，設(shè)置溶出介質(zhì)為200 mL水、水溫為（37±0.5） ℃、轉(zhuǎn)速為35 r/min。分別于投樣后1、3、5、10、20、30、45、60 min時(shí)取樣3 mL，取樣后迅速補(bǔ)足3 mL水。取樣溶液用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算野黃芩苷的質(zhì)量濃度，再計(jì)算累積溶出度[Yn=（cn×V1+c1×V2+c2×V2+…+cn-1×V2）÷M×100%，其中Yn為第n時(shí)間點(diǎn)的累積溶出度，cn為所取樣品測(cè)定的野黃芩苷質(zhì)量濃度，V1為溶出介質(zhì)總體積，V2為每次取樣后所補(bǔ)充的體積，M為樣品中野黃芩苷總含量]，并繪制BRE累積溶出度-時(shí)間曲線，詳見圖12。結(jié)果，5 min內(nèi)BRE納米晶的累積溶出度約為84%，而BRE原料藥和物理混合物的累積溶出度均未達(dá)到40%;20 min內(nèi)BRE納米晶的累積溶出度約為90.37%，是BRE原料藥和物理混合物的1.6倍左右，說明將BRE制備成納米晶可顯著改善其溶出度。

2.5.7 BRE納米晶加速穩(wěn)定性考察 取3批“2.3.2”項(xiàng)下制備的BRE納米晶，于溫度為（40±2） ℃、相對(duì)濕度為（75±5）%的條件下，避光放置3個(gè)月，然后測(cè)定其粒徑、PDI和Zeta電位，并按“2.5.6”項(xiàng)下方法測(cè)定其累積溶出度。結(jié)果，BRE納米晶放置3個(gè)月后其粒徑、PDI、Zeta電位、累積溶出度均未有明顯改變，表明其穩(wěn)定性較好。BRE納米晶加速穩(wěn)定性考察結(jié)果見表3，放置3個(gè)月后的溶出曲線見圖12。

3 討論

本課題組在進(jìn)行BRE納米晶制備工藝考察時(shí)發(fā)現(xiàn)，BRE的粒徑隨著氧化鋯珠用量的增加而減小，但增加到一定程度后，BRE的粒徑反而增加。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，適宜的研磨時(shí)間能使藥物顆粒被充分碰撞、剪切成小粒徑藥物粒子，并讓穩(wěn)定劑均勻吸附在納米顆粒表面，但過長(zhǎng)的研磨時(shí)間可能導(dǎo)致納米粒子之間相互連接生長(zhǎng)，且由于機(jī)器持續(xù)產(chǎn)熱，會(huì)導(dǎo)致藥物不穩(wěn)定，進(jìn)而使藥物粒子的粒徑和PDI重新增加[14]。

本研究采用DSC法和XRPD法對(duì)BRE納米晶和原料藥進(jìn)行晶型分析，以分析介質(zhì)研磨和凍干處理對(duì)藥物晶型的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BRE納米晶和原料藥的吸/放熱峰和衍射峰的峰位沒有發(fā)生變化，表明介質(zhì)研磨和凍干處理并未改變BRE的晶型。但是BRE納米晶衍射峰的相對(duì)強(qiáng)度較其原料藥有所降低，推測(cè)其原因可能與藥物粒徑減小有關(guān)，即BRE經(jīng)介質(zhì)研磨處理后，其納米晶體分子排列緊密程度降低;另外，BRE粒子表面被輔料包裹，也可能導(dǎo)致衍射峰強(qiáng)度相對(duì)于原料藥較弱[15-16]。

本研究所制備的BRE納米晶平均粒徑為（283.10±3.08） nm，平均PDI為0.212±0.021，平均Zeta電位為 （-38.48±0.39） mV。與BRE原料藥比較，BRE納米晶具有良好的溶出度;而且在溫度（40±2） ℃、相對(duì)濕度（75±5）%條件下避光放置3個(gè)月后，其外觀、分散性、粒徑分布、累積溶出度并未發(fā)生明顯改變。這說明所制備的BRE納米晶的溶出度和穩(wěn)定性均良好。

綜上所述，BRE納米晶的制備方法簡(jiǎn)單、可行，且所制得的BRE納米晶穩(wěn)定性、溶出度均良好。

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（收稿日期：2020-03-19 修回日期：2020-05-22）

（編輯：唐曉蓮）