龍膽苦苷對(duì)人胰腺癌細(xì)胞PANC-1凋亡及IL-6/JAK2/STAT3信號(hào)通路的影響

孟松 周耀柱 馬永超 徐松濤 金少舉

摘 要 目的：研究龍膽苦苷對(duì)人胰腺癌細(xì)胞PANC-1凋亡的影響，并從白細(xì)胞介素6（IL-6）/Janus激酶2（JAK2）/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）信號(hào)通路角度研究其作用機(jī)制。方法：以PANC-1細(xì)胞為研究模型，采用MTT法測(cè)定0（陰性對(duì)照）、2、4、8、16、32、64、128 mg/L龍膽苦苷作用于細(xì)胞72 h后的增殖抑制率，并計(jì)算其半數(shù)抑制濃度（IC50）。分別將細(xì)胞分為陰性對(duì)照組、吉西他濱組（陽性對(duì)照，4 mg/L）和龍膽苦苷低、中、高濃度組（15、30、60 mg/L）。分別于培養(yǎng)1、3、5、7 d后，采用臺(tái)盼藍(lán)拒染法進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)，考察各組細(xì)胞的生長情況;培養(yǎng)72 h后，采用克隆形成試驗(yàn)考察細(xì)胞的克隆形成率，采用Hoechst 33258染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法和Western blotting法分別測(cè)定細(xì)胞中IL-6、JAK2、STAT3 mRNA及其蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：4～28 mg/L龍膽苦苷均可顯著抑制細(xì)胞的增殖（P<0.05或P<0.01），并具有一定的濃度依賴性趨勢(shì)，IC50為9.54 mg/L。與陰性對(duì)照組比較，吉西他濱組和龍膽苦苷中、高濃度組活細(xì)胞計(jì)數(shù)（作用3、5、7 d）和細(xì)胞中IL-6、JAK2、STAT3 mRNA及其蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01），細(xì)胞凋亡率均顯著升高（P<0.01）;吉西他濱組和龍膽苦苷高濃度組細(xì)胞的克隆形成率均顯著降低（P<0.01）。與吉西他濱組比較，龍膽苦苷高濃度組細(xì)胞中上述指標(biāo)水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論：30、60 mg/L龍膽苦苷可顯著抑制PANC-1細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)其凋亡，60 mg/L龍膽苦苷的作用與吉西他濱相當(dāng);其作用機(jī)制可能與抑制細(xì)胞中IL-6/JAK2/STAT3信號(hào)通路的激活有關(guān)。

關(guān)鍵詞 龍膽苦苷;人胰腺癌細(xì)胞PANC-1;凋亡;白細(xì)胞介素6;Janus激酶2;信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3;機(jī)制

ABSTRACT OBJECTIVE：To study the effects of gentiopicroside on the apoptosis of human pancreatic cancer cells PANC-1，and to explore its mechanism from the perspective of IL-6/JAK2/STAT3 signaling pathway. METHODS：Using PANC-1 cells as model，the proliferation inhibition rate of cells was tested by MTT assay after treated with 0 （negative contro），2，4，8，16，32，64，128 mg/L gentiopicroside for 72 h and IC50 were calculated. The cells were divided into negative control group，gemcitabine group （positive control， 4 mg/L） and gentiopicroside low-concentration，medium-concentration and high-concentration groups （15，30， 60 mg/L）. After cultured for 1，3，5，7 d，Trypan blue exclusion staining was used to count the survival cell，and the growth of cells was investigated. After cultured for 72 h，colony formation assay was used to observe colony formation rate of cells; the apoptotic rate of cells was detected by Hoechst 33258 staining; the mRNA and protein expressions of IL-6，JAK2，STAT3 in cells were detected by RT-PCR and Western blotting assay. RESULTS：4-28 mg/L gentiopicroside could inhibit the proliferation of cells （P<0.05 or P<0.01）， in concentration dependent trend; IC50 was 9.54 mg/L. Compared with negative control group， survival cell count （cultured from 3，5，7 d），mRNA and protein expressions of IL-6，JAK2 and STAT3 in cells were decreased significantly in gemcitabine group，gentiopicroside medium-concentration and high-concentration groups （P<0.05 or P<0.01）， while the apoptotic rate was increased significantly （P<0.01）. The colony formation rate of cells were decreased significantly in gemcitabine group and gentiopicroside high-concentration group （P<0.01）. Compared with gemcitabine group，there was no statistical significance in above indexes of gentiopicroside high- concentration group （P>0.05）. CONCLUSIONS：30，60 mg/L gentiopicroside could inhibit the proliferation and induce apoptosis of? PANC-1 cells，and 60 mg/L gentiopicroside is similar to gemcitabine in the effects. Its mechanism may be related to inhibiting the activation of IL-6/JAK2/STAT3 signaling pathway.

KEYWORDS Gentiopicroside; Human pancreatic cancer cells PANC-1; Apoptosis;IL-6; JAK2; STAT3; Mechanism

胰腺癌（Pancreatic cancer）是臨床上常見的消化系統(tǒng)腫瘤，具有起病隱匿、早期診斷困難、預(yù)后差及病死率高等特點(diǎn)，惡性程度極高[1-2]。胰腺癌發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前認(rèn)為炎癥反應(yīng)與其發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)，加速了疾病的進(jìn)程[3-4]。白細(xì)胞介素6（IL-6）/Janus激酶2（JAK2）/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）信號(hào)通路是目前發(fā)現(xiàn)的重要的炎癥信號(hào)通路之一，參與了機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)、血管生成及細(xì)胞的增殖分化等多種生理病理過程，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及侵襲等生物學(xué)行為密切相關(guān)，且其表達(dá)異常對(duì)腫瘤的預(yù)后有重要指導(dǎo)意義[5-6]。因此，抑制和調(diào)控IL-6/JAK2/STAT3信號(hào)通路有助于腫瘤的防治及改善預(yù)后，同時(shí)其也是篩選抗腫瘤藥物的重要靶點(diǎn)之一[7-8]。龍膽苦苷（Gentiopicroside）是從秦艽、龍膽草等龍膽科龍膽屬植物中提取的一種環(huán)烯醚萜苷類單體化合物，具有抗炎、抗氧化應(yīng)激、抗風(fēng)濕及抗肝損傷等藥理作用[9];亦有報(bào)道指出，龍膽苦苷具有抑制卵巢癌、肝癌及肺癌等腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移等作用[10-12]，但龍膽苦苷對(duì)胰腺癌的影響尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。基于此，本文通過研究龍膽苦苷對(duì)胰腺癌細(xì)胞PANC-1增殖、凋亡的影響，同時(shí)檢測(cè)IL-6/JAK2/STAT3信號(hào)通路相關(guān)因子表達(dá)水平的變化，初步探討其抗胰腺癌的作用及機(jī)制，旨在為深入研究龍膽苦苷抗腫瘤藥理作用提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

CKX53型熒光倒置顯微鏡[奧林巴斯（中國）有限公司];ST-360型酶標(biāo)儀（上?？迫A生物工程股份有限公司）;Forma 系列3水套式CO2培養(yǎng)箱[賽默飛世爾科技（中國）有限公司];SJ-CJ-2FD型超凈工作臺(tái)[蘇潔醫(yī)療器械（蘇州）有限公司];GelDoc XR+型凝膠成像儀、Mini-PROTEAN? Tetra Cell型小型垂直電泳槽、小型Trans-Blot轉(zhuǎn)印槽、S1000TM 96 Deep Well 型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）儀[伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司];AE224型電子天平（上海恒平科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

龍膽苦苷標(biāo)準(zhǔn)品[南京澤朗生物科技有限公司，批號(hào)：20180526，純度：≥98%;臨用時(shí)用含0.1%二甲基亞砜（DMSO）的培養(yǎng)基配制為相應(yīng)藥液];胎牛血清（美國HyClone公司，批號(hào)：20180415）;Beyozol總RNA抽提試劑、BeyoRTTM Ⅲ cDNA第一鏈合成試劑盒、Easy-LoadTM PCR Master Mix（Blue，2×）、瓊脂糖（碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：R0011、D7178S、D7251、ST004L）;Giemsa染色液（南京建成生物工程研究所，批號(hào)：180215）;Hoechst 33258染色液、NP-40裂解液、二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度測(cè)定試劑盒、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠配制試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司，批號(hào)：AR1169、AR0107、AR0197、AR0138）;兔抗IL-6、JAK2、STAT3多克隆抗體以及辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白G（H+L） 二抗（美國 Affinity Biosciences公司，批號(hào)：DF6087、AF6022、AF6294、A0001）;DMEM高糖培養(yǎng)基（北京索萊寶科技有限公司）;其余試劑均為分析純，水為超純水。PCR試驗(yàn)所需引物由蘇州金唯智生物科技有限公司設(shè)計(jì)與合成。

1.3 細(xì)胞

人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與處理

將PANC-1細(xì)胞置于含12%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，于5%CO2、飽和濕度、37 ℃條件CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（培養(yǎng)條件下同），每2～3 天更換1次培養(yǎng)液，當(dāng)細(xì)胞長滿至培養(yǎng)瓶80%～95%時(shí)進(jìn)行傳代。待細(xì)胞生長至對(duì)數(shù)生長期（3～4代細(xì)胞）時(shí)進(jìn)行相關(guān)試驗(yàn)，每項(xiàng)試驗(yàn)均重復(fù)3次。

2.2 龍膽苦苷對(duì)PANC-1細(xì)胞增殖的影響考察

采用MTT法進(jìn)行測(cè)定。收集對(duì)數(shù)生長期PANC-1細(xì)胞，以0.25%胰酶消化后制成密度為5×103個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，按200 μL/孔的細(xì)胞密度接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁后，分別加入終質(zhì)量濃度為0（陰性對(duì)照）、2、4、8、16、32、64、128 mg/L的含龍膽苦苷培養(yǎng)基，每個(gè)質(zhì)量濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)72 h后，加入0.5% MTT溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng)。小心吸棄培養(yǎng)孔內(nèi)上清液，然后加入DMSO 150 μL，于水平搖床上振蕩15 min使結(jié)晶物充分溶解，最后用酶標(biāo)儀于490 nm波長處測(cè)定各孔吸光度（OD）值，OD值越高，則細(xì)胞活性越高。按照公式計(jì)算龍膽苦苷對(duì)PANC-1細(xì)胞的增殖抑制率：增殖抑制率（%）=（1-試驗(yàn)孔OD值/陰性對(duì)照孔OD值）×100%。應(yīng)用Graphpad Prism 5.0軟件計(jì)算半數(shù)抑制濃度（IC50）。

2.3 龍膽苦苷對(duì)PANC-1細(xì)胞生長的影響考察

采用臺(tái)盼藍(lán)拒染法進(jìn)行測(cè)定。收集對(duì)數(shù)生長期PANC-1細(xì)胞，以0.25%胰酶消化后制成密度為1×104? ?個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，按100 μL/孔的細(xì)胞密度接種于96孔板中。將細(xì)胞分為陰性對(duì)照組、陽性對(duì)照組和龍膽苦苷低、中、高濃度組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞貼壁后，陰性對(duì)照組細(xì)胞加入100 μL常規(guī)培養(yǎng)液，陽性對(duì)照組細(xì)胞加入終質(zhì)量濃度為4 mg/L的含吉西他濱培養(yǎng)基[13]，龍膽苦苷低、中、高濃度組細(xì)胞分別加入終質(zhì)量濃度為15、30、60 mg/L的含龍膽苦苷培養(yǎng)基。于給藥培養(yǎng)第1、3、5、7 天，分別收集細(xì)胞并制成懸液，與0.4%臺(tái)盼藍(lán)溶液以9 ∶ 1（V/V）的比例混合均勻，在3 min內(nèi)，用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)（顯微鏡下觀察，死細(xì)胞被染成淡藍(lán)色，而活細(xì)胞拒染）。

2.4 龍膽苦苷對(duì)PANC-1細(xì)胞克隆形成的影響考察

采用克隆形成試驗(yàn)進(jìn)行測(cè)定。收集對(duì)數(shù)生長期PANC-1細(xì)胞，以0.25%胰酶消化后制成細(xì)胞懸液，按500個(gè)/皿接種于60 mm培養(yǎng)皿中，按“2.3”項(xiàng)下方法分組、給藥，培養(yǎng)72 h。吸棄培養(yǎng)皿中培養(yǎng)液，更換為無藥新鮮培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)，直至每個(gè)培養(yǎng)皿中均出現(xiàn)50個(gè)以上克隆即終止試驗(yàn)。將培養(yǎng)皿中培養(yǎng)基小心倒棄，以磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗細(xì)胞3 min×2～3次，甲醇固定20 min，再用Giemsa溶液染色15 min，然后置于倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)大于50個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)。按照公式計(jì)算克隆形成率：克隆形成率（%）=克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%。

2.5 龍膽苦苷對(duì)PANC-1細(xì)胞凋亡的影響考察

采用Hoechst 33258熒光染色法進(jìn)行測(cè)定。收集對(duì)數(shù)生長期PANC-1細(xì)胞，以0.25%胰酶消化后制成密度為2×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，以2 mL/孔接種于6孔板中，按“2.3”項(xiàng)下方法分組、給藥，培養(yǎng)72 h。吸棄培養(yǎng)液，用無菌PBS溶液漂洗細(xì)胞3 min×2～3次，用4%多聚甲醛溶液固定30 min，然后加入Hoechst 33258染色液（5? ? ? ?μg/mL），室溫下避光染色15 min，再在超凈工作臺(tái)中風(fēng)干后，于熒光倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡情況（正常細(xì)胞核染為均勻藍(lán)色，凋亡細(xì)胞核固縮、呈強(qiáng)藍(lán)色致密濃染）。按照公式計(jì)算細(xì)胞凋亡率：細(xì)胞凋亡率（%）=凋亡細(xì)胞數(shù)/（凋亡細(xì)胞數(shù)+正常細(xì)胞數(shù)）×100%。

2.6 龍膽苦苷對(duì)PANC-1細(xì)胞中IL-6、JAK2和STAT3 mRNA表達(dá)的影響考察

采用逆轉(zhuǎn)錄（RT）-PCR法進(jìn)行測(cè)定。收集對(duì)數(shù)生長期PANC-1細(xì)胞，以0.25%胰酶消化后制成細(xì)胞懸液，按2×105個(gè)/孔接種于6孔板中，然后按“2.3”項(xiàng)下方法分組、給藥，培養(yǎng)72 h。吸棄培養(yǎng)液，收集細(xì)胞，用Beyozol試劑提取細(xì)胞總RNA[取2 μL總RNA樣品，于260、280 nm波長下分別檢測(cè)RNA樣品的吸光度（A），A260/A280值介于1.8～2.0之間，表明樣品純度較高]。將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增試驗(yàn)。反應(yīng)體系（25 μL）：cDNA模板5 μL，上、下游引物各1 μL，2× Master Mix 12.5 μL，ddH2O 5.5 μL。擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性45 s，57 ℃退火75 s，72 ℃延伸90 s，共30個(gè)循環(huán);最后以72 ℃充分延伸10 min，結(jié)束反應(yīng)。取5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠（2%）電泳，凝膠成像儀下拍照成像，用Quantity One 4.6.2軟件分析條帶光密度值。以目的基因條帶光密度值與內(nèi)參（β-actin）條帶光密度值的比值表示目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。待測(cè)基因引物序列及產(chǎn)物擴(kuò)增長度見表1。

2.7 龍膽苦苷對(duì)細(xì)胞中IL-6、JAK2和STAT3蛋白表達(dá)的影響考察

采用Western blotting法進(jìn)行測(cè)定。按“2.6”項(xiàng)下方法接種、分組、給藥，培養(yǎng)72 h。收集細(xì)胞于1.5 mL離心管中，加入1 mL RIPA蛋白裂解液于冰上充分裂解30 min，提取細(xì)胞總蛋白，按BCA試劑盒方法測(cè)定各樣本蛋白濃度并調(diào)整一致。然后將蛋白在95 ℃水中加熱5 min變性，80 V電壓下行SDS-PAGE電泳，300 mA恒流下將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上;室溫下用5.0%脫脂奶粉封閉1 h，然后分別加入IL-6（1 ∶ 1 000）、JAK2（1 ∶ 1 000）、STAT3（1 ∶ 1 000）、β-actin（1 ∶ 1 000）一抗，4 ℃孵育過夜;用TBST緩沖液漂洗3 min×3次，加入二抗（1 ∶ 2 000），室溫孵育1 h;然后加入化學(xué)發(fā)光（ECL）顯色液，于凝膠成像儀下顯影拍照，用Quantity One 4.6.2軟件分析條帶灰度值。以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參（β- actin）條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以x±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 龍膽苦苷對(duì)PANC-1細(xì)胞增殖的影響

與陰性對(duì)照比較，4、8、16、32、64、128 mg/L龍膽苦苷作用72 h后細(xì)胞的OD值均顯著降低（P<0.05或P<0.01），表明其可不同程度地抑制細(xì)胞的增殖，并且具有濃度依賴性趨勢(shì)。龍膽苦苷對(duì)PANC-1細(xì)胞的IC50為9.54 mg/L。結(jié)果見表2。

3.2 龍膽苦苷對(duì)PANC-1細(xì)胞生長的影響

在培養(yǎng)1 d后，各組的活細(xì)胞計(jì)數(shù)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與陰性對(duì)照組比較，在培養(yǎng)3、5、7 d后，吉西他濱組和龍膽苦苷中、高濃度組活細(xì)胞計(jì)數(shù)均明顯減少（P<0.05或P<0.01）。與吉西他濱組比較，龍膽苦苷中濃度組在培養(yǎng)3 d后的活細(xì)胞計(jì)數(shù)以及龍膽苦苷高濃度組在培養(yǎng)3、5、7 d后的活細(xì)胞計(jì)數(shù)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果見表3。

3.3 龍膽苦苷對(duì)PANC-1細(xì)胞克隆形成的影響

與陰性對(duì)照組比較，吉西他濱組和龍膽苦苷高濃度組細(xì)胞的克隆形成數(shù)顯著減少（P<0.01），克隆形成率顯著降低（P<0.01）。與吉西他濱組比較，龍膽苦苷高濃度組細(xì)胞的克隆形成數(shù)和克隆形成率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果見圖1、表4。

3.4 龍膽苦苷對(duì)PANC-1細(xì)胞凋亡的影響

與陰性對(duì)照組比較，吉西他濱組和龍膽苦苷中、高濃度組細(xì)胞凋亡率顯著升高（P<0.01）。與吉西他濱組比較，龍膽苦苷高濃度組細(xì)胞凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果見圖2、表5。

3.5 龍膽苦苷對(duì)PANC-1細(xì)胞中IL-6、JAK2、STAT3 mRNA表達(dá)水平的影響

與陰性對(duì)照組比較，吉西他濱組和龍膽苦苷中、高濃度組細(xì)胞中IL-6、JAK2、STAT3 mRNA表達(dá)水平顯著降低（P<0.01）。與吉西他濱組比較，龍膽苦苷高濃度組細(xì)胞中IL-6、JAK2、STAT3 mRNA表達(dá)水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果見圖3、表6。

3.6 龍膽苦苷對(duì)PANC-1細(xì)胞中IL-6、JAK2、STAT3蛋白表達(dá)水平的影響

與陰性對(duì)照組比較，吉西他濱組和龍膽苦苷中、高濃度組細(xì)胞中IL-6、JAK2、STAT3蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.05或P<0.01）。與吉西他濱組比較，龍膽苦苷高濃度組細(xì)胞中IL-6、JAK2、STAT3蛋白表達(dá)水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果見圖4、表7。

4 討論

炎癥信號(hào)通路IL-6/JAK2/STAT3在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[14]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，胰腺癌患者腫瘤組織中IL-6、JAK2、STAT3等的表達(dá)異常升高，且與腫瘤的惡性程度及預(yù)后不良呈正相關(guān)[15]。其中，IL-6是目前研究較多且功能廣泛的細(xì)胞因子之一，其參與了炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)控、細(xì)胞分化及增殖等生理病理過程，其表達(dá)升高可促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、遷移及侵襲等生物學(xué)行為，也是判斷惡性腫瘤預(yù)后的重要指標(biāo)之一[16]。IL-6與其靶細(xì)胞上相應(yīng)的IL-6受體結(jié)合后，激活細(xì)胞膜表面的糖蛋白130（GP130），從而激活與GP130關(guān)聯(lián)的JAK，促進(jìn)受體蛋白酪氨酸激酶活化，并與STAT3結(jié)合，使STAT3發(fā)生磷酸化激活后，誘導(dǎo)核因子? κB（NF-κB）從NF-κB/NF-κB抑制蛋白（IκB）復(fù)合體上解離為游離的磷酸化狀態(tài)，然后通過核膜進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，與其相應(yīng)的DNA反應(yīng)元件結(jié)合，調(diào)控炎癥、凋亡或增殖相關(guān)因子的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡，參與到腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲等生物學(xué)行為中[17-20]。因此，采取有效治療措施下調(diào)IL-6/JAK2/STAT3信號(hào)通路的表達(dá)有助于腫瘤的防治。本研究發(fā)現(xiàn)，30、60 mg/L龍膽苦苷可顯著抑制PANC-1細(xì)胞的增殖、生長和克隆形成，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，下調(diào)細(xì)胞中IL-6、JAK2、STAT3 mRNA及其蛋白表達(dá)，并且60 mg/L龍膽苦苷的作用與4 mg/L吉西他濱的作用相近（吉西他濱是臨床上治療胰腺癌的基礎(chǔ)化療藥物[21]，故在本研究中將其設(shè)為陽性對(duì)照）。

綜上所述，龍膽苦苷對(duì)人胰腺癌細(xì)胞PANC-1具有抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡的作用，其機(jī)制可能與抑制IL-6/ JAK2/STAT3信號(hào)通路的激活有關(guān)，但其更多的作用機(jī)制后續(xù)需進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

[ 1 ] ABBASSI R，SCHMID RM. Evolving treatment paradi- gms for pancreatic cancer[J]. Visc Med，2019，35（6）：362-372.

[ 2 ] 劉夢(mèng)奇，吉順榮，徐曉武，等. 2019年胰腺癌研究及診療新進(jìn)展[J].中國癌癥雜志，2020，30（1）：1-10.

[ 3 ] WANG Y，YANG G，YOU L，et al. Role of the micro- biome in occurrence，development and treatment of pancreatic cancer[J]. Mol Cancer，2019，18（1）：173-186.

[ 4 ] STONE ML，BEATTY GL. Cellular determinants and therapeutic implications of inflammation in pancreatic cancer[J]. Pharmacol Ther，2019，201（9）：202-213.

[ 5 ] ZHANG X，LU H，HONG W，et al. Tyrphostin B42 atte- nuates trichostatin A-mediated resistance in pancreatic cancer cells by antagonizing IL-6/JAK2/STAT3 signaling[J]. Oncol Rep，2018，39（4）：1892-1900.

[ 6 ] LIU X，WANG J，WANG H，et al. REG3A accelerates pancreatic cancer cell growth under IL-6-associated inflammatory condition：involvement of a REG3A-JAK2/STAT3 positive feedback loop[J]. Cancer Lett，2015，362（1）：45-60.

[ 7 ] ZHAO H，GUO Y，LI S，et al. A novel anti-cancer agent icaritin suppresses hepatocellular carcinoma initiation and malignant growth through the IL-6/JAK2/STAT3 pathway[J]. Oncotarget，2015，6（31）：31927-31943.

[ 8 ] 劉建民，黃良文，朱旭紅，等. 3種活血化瘀中藥復(fù)方含藥血清對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞JAK/STAT信號(hào)通路的影響[J].中國藥房，2017，28（16）：2176-2179.

[ 9 ] 謝小倩，李賀，王亞樂，等.龍膽苦苷對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠的抗炎作用[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2020，26（6）：58- 63.

[10] XIE X，LI H，WANG Y，et al. Therapeutic effects of gen- tiopicroside on adjuvant-induced arthritis by inhibiting? ?inflammation and oxidative stress in rats[J]. Int Immu-? ?nopharmacol，2019. DOI：10.1016/j.intimp.2019.105840.

[11] 王美靈，張雷明，郝妍斐，等.龍膽苦苷對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的保護(hù)作用及其機(jī)制[J].中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，2019，33（9）：721.

[12] LI X，YANG C，SHEN H. Gentiopicroside exerts convincing antitumor effects in human ovarian carcinoma cells （SKOV3） by inducing cell cycle arrest，mitochondrial? mediated apoptosis and inhibition of cell migration[J]. J Buon，2019，24（1）：280-284.

[13] 梁春麗，王崢，李炳，等.姜黃素對(duì)人胰腺癌PANC-1細(xì)胞甲基化轉(zhuǎn)移酶表達(dá)影響的體外研究[J].上海中醫(yī)藥雜志，2015，49（10）：77-79、97.

[14] KIM JH，CHOI HS，KIM SL，et al. The PAK1-Stat3 signaling pathway activates IL-6 gene transcription and human breast cancer stem cell formation[J]. Cancers：Basel，2019，11（10）：1527-1546.

[15] RAZIDLO GL，BURTON KM，MCNIVEN MA.Interleukin-6 promotes pancreatic cancer cell migration by rapidly activating the small GTPase CDC42[J]. J Biol Chem，2018，293（28）：11143-11153.

[16] 陳濤，曾永鴻.腫瘤微環(huán)境中異常表達(dá)的白介素6對(duì)腫瘤進(jìn)程的影響[J].解剖學(xué)雜志，2016，39（4）：501-503.

[17] 任為，牟宜雙，許可，等.迷迭香酸通過誘導(dǎo)凋亡及抑制NF-κB信號(hào)通路發(fā)揮抗肝癌作用的機(jī)制研究[J].中藥藥理與臨床，2016，32（2）：31-35.

[18] 張曼澤，李峰生，王思念，等. IL-6通過JAK2/STAT3信號(hào)通路促進(jìn)CD133-肺腺癌細(xì)胞（A549）獲得干性特征[J].軍事醫(yī)學(xué)，2018，42（9）：678-683.

[19] LIU Z，CHEN T，LU X，et al. Overexpression of variant PNPLA3 gene at I148M position causes malignant transformation of hepatocytes via IL-6-JAK2/STAT3 pathway in low dose free fatty acid exposure：a laboratory investigation in vitro and in vivo[J]. Am J Transl Res，2016，8（3）：1319-1338.

[20] 李雷雷，郭彬，郭佳培，等.腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞通過JAK2/STAT3途徑調(diào)控肝癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2017，44（13）：2406-2410.

[21] 彭夢(mèng)媛，邱峰，黃丹，等.姜黃素對(duì)胰腺癌SW1990細(xì)胞耐吉西他濱的逆轉(zhuǎn)作用及機(jī)制研究[J].中國藥房，2019，30（9）：1192-1197.

（收稿日期：2020-02-24 修回日期：2020-06-12）

（編輯：林 靜）