單寧酶固液發(fā)酵對比試驗

劉會 周瑞琪 金偉

摘要 ? ?通過對比單寧酶的液體發(fā)酵和固體發(fā)酵發(fā)現(xiàn)，固體發(fā)酵方式潛力較大、成本低、產(chǎn)率高，且充分利用了農(nóng)林業(yè)廢棄物資源，有利于環(huán)境和能源的可持續(xù)發(fā)展。

關鍵詞 ? ?單寧酶;固體發(fā)酵;液體發(fā)酵;農(nóng)林廢棄物

中圖分類號 ? ?TQ925 ? ? ? ?文獻標識碼 ? ?A

文章編號 ? 1007-5739（2020）15-0228-02 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）

Abstract ? ?By comparing the liquid fermentation and solid fermentation of tanninase， it was found that solid fermentation had great potential， low cost and high yield， and made full use of agricultural and forestry waste resources， which was conducive to the sustainable development of the environment and energy.

Key words ? ?tannase; solid fermentation; liquid fermentation; agricultural and forestry waste

單寧酶可用于處理茶飲料“冷后渾”、啤酒沉淀、果汁果酒變質(zhì)等問題，廣泛應用于食品、飲料、制革、化妝、醫(yī)藥等行業(yè)[1-2]，近年來還用于醫(yī)藥中間體——沒食子酸和相關精細化學品的制備[3-4]。

單寧酶的發(fā)酵生產(chǎn)有液體發(fā)酵和固體發(fā)酵2種方式。液體發(fā)酵是傳統(tǒng)的微生物發(fā)酵方法，具有均一性好、工藝易控制等優(yōu)點;固體發(fā)酵也有其特有的優(yōu)勢，比如培養(yǎng)基成本低、設備和技術較簡單、能耗低等。本文對2種發(fā)酵生產(chǎn)單寧酶的工藝進行全面的比較，以期為現(xiàn)代發(fā)酵工藝研究提供參考。

1 ? ?材料與方法

1.1 ? ?試驗材料

供試菌株：黑曲霉TmF3，由中科院強磁場與離子束物理生物學重點實驗室誘變獲得。

產(chǎn)孢培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖12 g/L，CaCO3 10 g/L，用改良Mandels營養(yǎng)鹽液配制[5]。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基：秈米粉25 g/L，單寧酸10 g/L，CaCO3 2.5 g/L，（NH4）2SO4 5.0 g/L，KH2PO4 1.5 g/L，MgSO4 0.15 g/L。

固體發(fā)酵培養(yǎng)基：250 mL三角瓶中加入稻殼4.4 g、麩皮0.5 g和五倍子粉1.0 g，液固比2∶1，營養(yǎng)鹽溶液組成為（NH4）2SO4 21 g/L，MgSO4·7H2O 1.0 g/L，NaCl 1.0 g/L。

1.2 ? ?試驗方法

1.2.1 ? ?孢子懸浮液配制。從產(chǎn)孢培養(yǎng)基上刮取黑曲霉孢子制成孢子懸液。

1.2.2 ? ?液體發(fā)酵。取1 mL孢子懸液（約含5.3×107個孢子）接種于含40 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，30 ℃、200 r/min培養(yǎng)12 h。取2 mL種子液接種于含50 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，30 ℃、180 r/min培養(yǎng)80 h。發(fā)酵完成后，濾紙過濾分離發(fā)酵液和菌絲體。菌絲體用蒸餾水過濾清洗至無水溶性雜質(zhì)殘留。稱取部分濕菌體，按40∶1的比例加入檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（pH值5.0），對菌絲體進行超聲破碎，超聲條件為：功率600 W，工作時間1 s，間隙時間2 s，工作總時間9 min。破碎完成后用濾紙過濾，留取過濾液。發(fā)酵液用透過分子量為8 000～14 000的透析膜在4 ℃條件下過夜透析，以除去沒食子酸。再稱取部分濕菌體，于110 ℃烘箱內(nèi)烘干至恒重，即得干菌體，稱重。

1.2.3 ? ?固體發(fā)酵。每個250 mL三角瓶接種1 mL孢子懸浮液（約5.3×107個孢子），攪拌均勻，30 ℃靜置發(fā)酵4 d。發(fā)酵完成后，按10∶1比例加入檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液（pH值5.0），攪拌均勻，180 r/min振蕩浸提1 h，提出粗酶液。

1.2.4 ? ?單寧酶活力測定。測定方法采用比色法[6]。

2 ? ?結(jié)果與分析

2.1 ? ?發(fā)酵培養(yǎng)基成分比較

250 mL三角瓶發(fā)酵中，固體發(fā)酵培養(yǎng)基包含6.17 g固體成分，固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基成分大多為天然原料，如稻殼、麩皮為農(nóng)產(chǎn)品加工廢棄物，五倍子粉由林產(chǎn)品粗加工制得，這些天然原料不僅價格便宜且營養(yǎng)成分豐富，不需額外添加微量元素，只需添加少量的大量元素和無機氮源。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基包含2.21 g固體成分，明顯低于固體發(fā)酵培養(yǎng)基，但其除了秈米粉為天然原料外，其余成分均為化學試劑，加上種子培養(yǎng)基成分共有13種之多，成分復雜、價格高。另外，液體發(fā)酵培養(yǎng)基用水量是固體發(fā)酵培養(yǎng)基的4倍多。因此，若用于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)，固體發(fā)酵成本將遠低于液體發(fā)酵。

2.2 ? ?發(fā)酵過程比較

液體發(fā)酵生產(chǎn)單寧酶需要進行包括種子培養(yǎng)在內(nèi)的二級發(fā)酵，培養(yǎng)過程較復雜，對發(fā)酵控制系統(tǒng)的精度要求很高，而且要求環(huán)境和發(fā)酵容器有較高的潔凈度。另外，誘導物單寧酸對黑曲霉菌體的生長抑制作用十分明顯，其含量最高只占培養(yǎng)基組分的2%。

固體發(fā)酵則直接孢子接種，無須種子發(fā)酵，且為靜置培養(yǎng)，發(fā)酵過程較為簡單。另外，可能由于固體發(fā)酵方式更接近于微生物的自然生長環(huán)境，黑曲霉在固體發(fā)酵中生長更旺盛，對環(huán)境中不良因子的耐受力更強，比如更抗雜菌污染，對單寧酸耐受可高達15%等。

2.3 ? ?單寧酶提取工藝比較

液體發(fā)酵生產(chǎn)的單寧酶，包括胞內(nèi)和胞外2個部分，因而菌體和發(fā)酵液都需要進行提取，而且菌體還需要進行破碎，才能釋放胞內(nèi)的單寧酶;而固體發(fā)酵生產(chǎn)的單寧酶幾乎全部在胞外，胞內(nèi)幾乎沒有。因此，若用固體發(fā)酵生產(chǎn)單寧酶，其提純工序會更簡單、效率更高、成本也會降低;而且有報道稱，胞外單寧酶與胞內(nèi)單寧酶的結(jié)構(gòu)不同，固體發(fā)酵生產(chǎn)的單寧酶結(jié)構(gòu)均一性要優(yōu)于液體發(fā)酵。

2.4 ? ?固液體發(fā)酵單寧酶總活力比較

液體發(fā)酵結(jié)束后，250 mL三角瓶內(nèi)干菌體含量約為1.18 g，發(fā)酵液約為38 mL，胞內(nèi)單寧酶活力為44 U/g、胞外約為1.56 U/mL，每個搖瓶生產(chǎn)的單寧酶總活力為111.2 U;固體發(fā)酵完成后，每克固體基質(zhì)產(chǎn)生的單寧酶活力平均為115 U，每個搖瓶生產(chǎn)的單寧酶總活力為709.5 U（是液體發(fā)酵的6.38倍）。根據(jù)2種發(fā)酵方式中每個三角瓶所含的干物質(zhì)量，可計算出每克干物質(zhì)固體發(fā)酵生產(chǎn)單寧酶的效率是液體發(fā)酵的2.3倍。

3 ? ?結(jié)論與討論

通過單寧酶液體發(fā)酵和固體發(fā)酵的對比研究發(fā)現(xiàn)，固體發(fā)酵方法能顯著提高胞外單寧酶的產(chǎn)量，且生產(chǎn)成本遠低于液體發(fā)酵。綜合比較2種發(fā)酵方式所用培養(yǎng)基、發(fā)酵過程、酶的提取方法和酶總活力等可發(fā)現(xiàn)，黑曲霉固體發(fā)酵生產(chǎn)單寧酶潛力較大，而液體發(fā)酵胞內(nèi)單寧酶豐富，可以根據(jù)實際需要采取不同的發(fā)酵方式。此外，固體發(fā)酵充分利用了人類生產(chǎn)生活中產(chǎn)生的大量農(nóng)林業(yè)廢棄物，有利于環(huán)境和能源的可持續(xù)發(fā)展。

4 ? ?參考文獻

[1] 保玉心，黃永光，李盛，等.單寧酶的性質(zhì)與應用研究進展[J].釀酒，2007，34（5）：53-57.

[2] 李夢迪.黑曲霉單寧酶TahA在茶飲料品質(zhì)提升中的作用[D].天津：天津科技大學，2018.

[3] 錢高青，杜冰心，汪竹群，等.微生物單寧酶及其生物技術進展[J].農(nóng)產(chǎn)品加工，2018（22）：61-64.

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