內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌262AG6抑菌物質(zhì)的初步探究

樊麗娟，郭 海，楊成德，金夢軍，李文平

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，蘭州 730070)

解淀粉芽孢桿菌Bacillusamyloliquefaciens是目前生防細(xì)菌中研究較多的一類，因其生長速度快、營養(yǎng)需求簡單，能夠產(chǎn)生具有耐熱、耐旱、抗紫外線和有機(jī)溶劑功能的內(nèi)生孢子，是篩選生防菌比較理想的對象[1-2]，其抑菌范圍廣泛，包括根部病害、葉部病害和采后病害等[3-4]。該菌的主要生防機(jī)制包括分泌拮抗物質(zhì)和誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性等，其中分泌拮抗物質(zhì)如脂肽類抗生素和揮發(fā)性物質(zhì)等，可顯著抑制病原微生物的活性，抑制病害的發(fā)生[5-6]，目前已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)之一。解淀粉芽孢桿菌在生長過程中可以向胞外分泌細(xì)菌素、幾丁質(zhì)酶、β-1,3-葡聚糖酶、表面活性素(Surfactins)、豐原素(也稱芬薺素Fengycins或Plipastatins)和伊枯草菌素(Iturins)等[7-9]，均具有較好的抑菌作用[10-14]，如幾丁質(zhì)酶或β-1,3-葡聚糖酶對水稻紋枯病菌R.solani菌絲有消解作用，且二者聯(lián)合使用會增強(qiáng)降解真菌細(xì)胞壁的功能，有效抑制15種主要的病原真菌[11]；解淀粉芽胞桿菌Lx-11通過表面活性素抑制條斑病菌[13]；芬薺素作用于病原菌細(xì)胞壁的類脂層，破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和透性，從而對多種植物病原真菌[14]，尤其是絲狀真菌具有較強(qiáng)的抑制作用。這些代謝產(chǎn)物種類豐富、廣譜抑菌、抗逆性強(qiáng)，可應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、食品工業(yè)和環(huán)境保護(hù)等[9]。

262AG6是分離自東祁連山高寒草地矮生蒿草(Kobresiahumilis)的一株內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌，前期研究發(fā)現(xiàn)，該菌株具有較強(qiáng)的廣譜抑菌活性，對多種病原真菌具有抑菌作用[15]。其發(fā)酵粗提液對馬鈴薯炭疽病菌、馬鈴薯枯萎病菌、馬鈴薯壞疽病菌、馬鈴薯立枯絲核病菌、番茄早疫病菌、小麥根腐病菌、孜然根腐病菌和黃瓜枯萎病菌等病原真菌的抑制率均在58%以上。但是，該菌株通過產(chǎn)生哪些代謝產(chǎn)物發(fā)揮抑菌作用并不明確。因此，本研究對解淀粉芽孢桿菌262AG6的抑菌活性物質(zhì)的溶劑進(jìn)行篩選和萃取，并通過氣相-質(zhì)譜聯(lián)用儀對萃取的物質(zhì)進(jìn)行GC-MS分析，以期明確主要的抑菌物質(zhì)種類，為明確該菌的生物防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試菌株 供試拮抗細(xì)菌：東祁連山高寒草地矮生嵩草內(nèi)生細(xì)菌262AG6；供試病原真菌：馬鈴薯炭疽病菌(Colletotrichumcoccodes)；均由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院病理學(xué)實驗室提供。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 PDA：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15～18 g、水1 000 mL，pH 7；NA：牛肉膏3 g、蛋白胨5 g、葡萄糖8 g、瓊脂10～ 12 g、水1 000 mL、pH 7；BPY：牛肉膏5.0 g、蛋白胨10 g、酵母膏5 g、葡萄糖5 g、NaCl 5 g、水 1 000 mL，pH 7；培養(yǎng)基NA用于活化菌株， BPY為產(chǎn)抑菌物質(zhì)最適培養(yǎng)基，PDA培養(yǎng)基用于病原真菌的培養(yǎng)和對峙試驗。

1.1.3 試驗儀器 NSKY-211B型恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海蘇坤實業(yè)有限公司；RV8型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，VC10真空控制器，MVP10basic型真空泵，艾卡儀器設(shè)備有限公司；DLK-2007快速低溫冷卻循環(huán)機(jī),寧波新芝生物科技股份有限公司；GC-MS3200型氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，北京東西分析儀器有限公司等。

1.2 方 法

1.2.1 抑菌能力測定 采用平板對峙法[16]測定抑菌功能。將供試病原真菌馬鈴薯炭疽病菌活化后，打取0.6 cm菌餅，并置于PDA平板中心，距菌餅25 mm處用十字交叉法接種262AG6菌餅4塊，以接種無菌水為對照(CK)，每個處理重復(fù)3次，待對照組長滿平板(7～10 d)后，測量處理組及對照菌落直徑，并計算抑菌率。

抑菌率[16]=[(CK真菌直徑-試驗組真菌直徑)/(CK真菌直徑-原菌餅直徑)]×100%

1.2.2 抑菌能力穩(wěn)定性測定 將供試生防菌262AG6于NA平板上連續(xù)轉(zhuǎn)接菌10次(每隔 2 d轉(zhuǎn)接1次)，利用平板對峙法進(jìn)行馬鈴薯炭疽病菌抑菌能力測定，每個處理重復(fù)3次。

1.2.3 溫度對抑菌活性物質(zhì)穩(wěn)定性的影響 取發(fā)酵濾液(以下發(fā)酵濾液均稱粗提液)20 mL置于50 mL離心管中，分別于50、60、70、80、90、100和121 ℃條件下進(jìn)行高溫處理，除121 ℃條件下進(jìn)行高溫滅菌30 min外，其他處理均為水浴60 min，待各處理粗提液冷卻后，以馬鈴薯炭疽病菌為指示菌，未經(jīng)處理的粗提液和無菌水為對照，參照“1.2.1”的方法測定抑菌活性，每處理重復(fù)3次。

1.2.4 紫外線對抑菌活性物質(zhì)穩(wěn)定性的影響 將20 mL粗提液分別置于滅菌后的培養(yǎng)皿中，于紫外燈下分別照射0、3、6、9和12 h后取出，以無菌水為對照，其他同“1.2.3”。

1.2.5 pH對抑菌活性物質(zhì)穩(wěn)定性的影響 取20 mL低溫保存的備用粗提液，用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH將粗提液分別調(diào)整pH為3、4、5、6、7、8、9、10、11和12，4 ℃冰箱中靜置24 h后將各處理pH回調(diào)至中性(pH=7)，以未經(jīng)處理的粗提液和無菌水為對照，其他同“1.2.3”。

1.2.6 有機(jī)溶劑對抑菌活性物質(zhì)穩(wěn)定性的影響 分別將乙酸乙酯、氯仿、丙酮和石油醚與粗提液按體積比1∶1比例于搖瓶中振蕩混合，1 h后移入分液漏斗中靜置分層，待混合液出現(xiàn)明顯分層且分層液面無氣泡時，收集剩余粗提液，以上步驟重復(fù)3次，以未經(jīng)處理的粗提液為對照，其他同“1.2.3”。

1.2.7 抑菌活性物質(zhì)種類分析 發(fā)酵粗提液的處理：將發(fā)酵粗提液分別與乙酸乙酯和氯仿按體積比1∶1比例混合后置于4 ℃恒溫振蕩器中，180 r/min振蕩1h，移入分液漏斗中靜置分層，待混合液分層且分層液面無氣泡時，收集有機(jī)相，以上步驟重復(fù)3次，合并3次萃取所得有機(jī)相，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將萃取粗提液的有機(jī)相旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到膏狀物質(zhì)，4 ℃低溫保存。

有機(jī)溶劑萃取物質(zhì)抑菌活性測定：分別將 0.01 g乙酸乙酯和氯仿萃取蒸干物溶解于1 mL氯仿中，用0.22 μm孔徑的針式濾器于無菌條件下過濾3次，取200 μL均勻涂布于PDA培養(yǎng)基平板上，于平板中央接種直徑為6 mm的馬鈴薯炭疽病菌餅，以涂布200 μL氯仿和無菌水的PDA平板為對照，每處理重復(fù)3次，待對照組真菌長滿平板后(8 d)測量菌落直徑，參照 “1.2.1”的方法測定抑菌率。

萃取濃縮物的GC-MS分析：用適量氯仿分別溶解乙酸乙酯和氯仿萃取蒸干物，使用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀分析，對氣質(zhì)圖譜進(jìn)行分析解譜，確定萃取濃縮物的成分和結(jié)構(gòu)。

氣相色譜條件為石英毛細(xì)管柱(0.25 mm×50 m)；載氣：氦氣，純度≥99.999%，流速1.0 mL/min；進(jìn)樣模式：分流進(jìn)樣，分流比：20∶1；進(jìn)樣量：1 μL；進(jìn)樣口溫度：270 ℃；升溫程序：初始溫度60 ℃，以10 ℃/min速率升至280 ℃，保持 1 min，以10 ℃/min速率升至290 ℃；質(zhì)譜條件為離子源溫度：230 ℃；電離電壓：70 eV；四級桿溫度：150 ℃，保持5 min；掃描模式：全掃描；掃描范圍：50～650m/z。

數(shù)據(jù)分析：用美國國家科學(xué)技術(shù)研究所的NIST 質(zhì)譜庫08版(NIST08.L)對采集所得質(zhì)譜圖進(jìn)行匹配，根據(jù)匹配度對化合物進(jìn)行定性分析，用峰面積歸一化法計算樣品中各成分的相對百分含量，通過Cas#在MOLBASE網(wǎng)站的化合物百科數(shù)據(jù)庫中查詢各化合物的相關(guān)信息。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對抑菌活性物質(zhì)穩(wěn)定性影響

當(dāng)溫度為50～90 ℃時，262AG6粗提液的抑菌活性與對照無顯著性差異(P<0.05)，抑菌率均在77%以上，而經(jīng)過100 ℃和121 ℃的高溫處理后抑菌活性明顯下降，分別下降6.13%和 25.95%，表明菌株粗提液抑菌活性在90 ℃以下(含90 ℃)穩(wěn)定性良好，高于90 ℃對其活性產(chǎn)生較大影響(圖1)。

標(biāo)不同小寫字母者表示差異顯著(P<0.05),下同

2.2 紫外線對抑菌活性物質(zhì)穩(wěn)定性的影響

粗提液經(jīng)紫外線處理，對馬鈴薯炭疽病菌的抑制效果略有下降，但差異不顯著(P<0.05)，且抑菌率菌均在76%以上，說明紫外線對菌株粗提液抑菌活性無顯著影響(圖2)。

2.3 pH對抑菌活性物質(zhì)穩(wěn)定性的影響

當(dāng)pH為6～10時，粗提液對馬鈴薯炭疽病菌的抑制效果與對照差異不顯著(P>0.05)，pH≤5或pH≥11的條件下，抑菌活性顯著下降，pH為3時顯著下降22.09%(P<0.05)，抑菌率僅為56.48%(圖3)，表明在強(qiáng)酸性環(huán)境下，抑菌活性物質(zhì)穩(wěn)定性較差。

2.4 有機(jī)溶劑對抑菌活性物質(zhì)穩(wěn)定性的影響

發(fā)酵粗提液經(jīng)有機(jī)溶劑萃取后對馬鈴薯炭疽病菌的抑制效果有不同程度下降，其中經(jīng)乙酸乙酯和氯仿萃取后的粗提液抑菌活性相比對照下降較為顯著(P<0.05)，表明菌株粗提液中部分抑菌物質(zhì)分別被乙酸乙酯和氯仿萃取到有機(jī)相中(圖4)。

圖2 不同紫外線時長下抑菌活性物質(zhì)的穩(wěn)定性Fig.2 Stability of substances with antibacterial active under different UV exposure time

圖3 不同pH下抑菌活性物質(zhì)的穩(wěn)定性Fig.3 Stability of substances with antibacterial active at different pH

圖4 不同有機(jī)溶劑中抑菌活性物質(zhì)的穩(wěn)定性Fig.4 Stability of substances with antibacterial active in different organic solvents

2.5 有機(jī)溶劑萃取物的抑菌活性

以氯仿為溶劑，溶解兩種萃取物進(jìn)行抑菌試驗，由表1可得，氯仿萃取物對馬鈴薯炭疽病菌的抑制效果較好，抑菌率達(dá)64.48%，乙酸乙酯萃取物抑菌效果次之，為44.74%，表明抑菌物質(zhì)被氯仿和乙酸乙酯萃取。

表1 有機(jī)溶劑萃取物質(zhì)對馬鈴薯炭疽病菌的抑制效果Table 1 Organic solvent extracts against the Colletotrichum coccodes

2.6 乙酸乙酯萃取物GC-MS分析

菌株粗提液乙酸乙酯萃取物經(jīng)GC-MS分析，通過美國國家科學(xué)技術(shù)研究所的NIST 質(zhì)譜庫08版(NIST08.L)進(jìn)行匹配后發(fā)現(xiàn)，從8.162 min開始出現(xiàn)吸收峰，到25.820 min吸收峰基本結(jié)束，共有17個吸收峰(圖5，表2)，包括5類17種化合物，其中烷烴類物質(zhì)最多，占乙酸乙酯萃取物總含量82.65%，此外還存在一些酮類、苯酚、酯類、醛類、環(huán)二肽物質(zhì)，如煙酮(8.162 min)、 3,5-二甲氧基苯酚(9.602 min)、鄰苯二甲酸單(2-乙基己基)酯(19.456 min)、3-甲氧基-4-羥基苯甲醛(10.966 min)和Cyclo(leucylprolyl) (9.873 min)；在以上的17個峰對應(yīng)的化合物與NIST08.L中的化合物進(jìn)行匹配，確定菌株262AG6乙酸乙酯萃取物中至少含有Butyl isobutyl phthalate、Eicosane、Heneicosane、Docosane、Tricosane、Tetracosane、Pentacosane、Phthalicacid,mono-(2-ethylhexyl) ester、Hexacosane、Octacosane、Nonacosane11種化合物 (表2)。

2.7 氯仿萃取物GC-MS分析

氯仿萃取物的GC-MS分析結(jié)合NIST 質(zhì)譜庫08版(NIST08.L)進(jìn)行匹配，物質(zhì)從13.648 min開始有吸收峰出現(xiàn)，到23.661 min吸收峰結(jié)束，共有22個吸收峰(圖6，表3)，包括7類化合物，其中鄰苯二甲酸單(2-乙基己基)酯(21.991 min)含量最高，為19.055%在以上的22個峰對應(yīng)的化合物與NIST08.L中的化合物匹配度較高的化合物(85%以上)基本可以確定其化學(xué)結(jié)構(gòu)，最終確定262AG6發(fā)粗提液乙酸乙酯萃取物中至少含有Pyrrolo[1,2-a]pyrazine-1,4-dione,hexahydro-、Cyclo(leucylprolyl)、E-icosane、Tricosane、Bis(2-ethylhexyl) adipate、Pyrrolo[1,2-a]pyrazine-1,4-dione,h-exahydro-3-(phenylmethyl)-、Pentacosane、Phthalic acid和mono-(2-ethylhexyl)est-er8種化合物(表3)。

圖5 262AG6發(fā)酵粗提液乙酸乙酯萃取物GC-MS分析離子圖Fig.5 GC-MS ion analysis diagram of ethyl acetate extract from 262AG6 fermentation liquid extraction

表2 乙酸乙酯萃取物GC-MS分析主要成分Table 2 Main ingredients analysis of extract material from ethyl acetate with method of GC-MS

圖6 262AG6發(fā)酵粗提液氯仿萃取物GC-MS分析離子圖Fig.6 GC-MS ion analysis diagram of chloroform extract from 262AG6 fermentation liquid extraction

3 討論與結(jié)論

解淀粉芽孢桿菌主要在非核糖體肽合成酶和聚酮合酶的作用下合成脂肽類和聚酮類物質(zhì)，能夠抑制植物病原菌生長，并可作為根圍細(xì)菌促進(jìn)植物生長，因此關(guān)于其抑菌促生成分的研究已成為生物防治領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一[17-18]。利用細(xì)菌產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)作用于植物促生、抗性增強(qiáng)和病害防控等方面的研究也越來越受到人們的重視，這些天然的、非化學(xué)合成化合物的開發(fā)和利用逐步受到關(guān)注。解淀粉芽孢桿菌具有廣譜抑菌活性，可以產(chǎn)生多種揮發(fā)性抑菌物質(zhì)，主要包括醇類、醛類、烷烴類、呋喃類、酯類和酮類等化合物[19-20]，如解淀粉芽孢桿菌PPCB004能夠產(chǎn)生抑制青霉菌的羥基丁酮?dú)怏w[21]及防治多種采后病害、維護(hù)果實品質(zhì)的甲基環(huán)丙烯氣體[22]；解淀粉芽孢桿菌NJN-6產(chǎn)生的2-癸酮等11種揮發(fā)性有機(jī)物(VOCs)[23]，解淀粉芽孢桿菌BEB17產(chǎn)生的 2-Pentadecanone,6,10,14-trimethyl-等酮類物質(zhì)以及Caryophyllene、Squalene等烯烴類有機(jī)物[24]，都可以有效抑制香蕉枯萎病菌菌絲生長及孢子萌發(fā)。Fernando等[25]從油菜和大豆的內(nèi)生細(xì)菌中分離鑒定得到醛類、醇類、酮類和硫化物等揮發(fā)性物質(zhì)，能夠抑制菌絲生長或菌核形成；郝象瑢等[26]報道解淀粉芽孢桿菌LJ02產(chǎn)生的揮發(fā)性氣體中獲得2類單體化合物(4-乙基苯酚和2-丙基環(huán)己酮) 對腐皮殼菌、草莓灰霉病菌、棗漿胞病菌都具有良好的抑制作用。本研究中，262AG6的乙酸乙酯和氯仿萃取物中含有煙酮、2-羥基-3,5,5-三甲基環(huán)己-1-烯-1-酮、四甲基環(huán)丁烷1,3-二酮等酮類化合物，其中兩種萃取物中都含有煙酮，在氯仿萃取物中含有2-羥基-3,5,5-三甲基環(huán)己-1-烯-1-酮,它與煙酮是同分異構(gòu)體，與煙酮可以互相轉(zhuǎn)化。煙酮耐酸、耐熱,性質(zhì)穩(wěn)定,無毒,有明顯的防霉作用[27]，說明其對霉菌具有抑菌功能。王茹華等[28]報道香草醛在濃度為0.1 mmol/L時抑制黃萎菌孢子萌發(fā)，其余濃度能促進(jìn)茄子種子萌發(fā)和幼苗生長；本研究中，在解淀粉芽孢桿菌262AG6乙酸乙酯萃取物中測得含有3-甲氧基-4-羥基苯甲醛(又稱香蘭素、香草醛)，其可能具有潛在的抑菌促生功能。因此，這些酮類、醛類化合物可能是該菌株主要的抑菌組分。

表3 氯仿萃取物GC-MS分析主要成分Table 3 Main ingredients analysis of extract material from chloroform withmethod of GC-MS

柴慶凱等[29]認(rèn)為，木質(zhì)素與酚類物質(zhì)是解淀粉芽孢桿菌LJ02抵抗真菌病害的主要物質(zhì)，如其發(fā)酵液(LJ02FB)處理葉片和根部，可誘導(dǎo)PR-9基因極顯著上調(diào)，進(jìn)而過氧化物酶(POD)產(chǎn)生催化酚類物質(zhì)合成，抑制灰霉菌的侵染；郝象瑢等[26]報道解淀粉芽孢桿菌LJ02對腐皮殼菌具有良好抑制作用的單體化合物中含有4-乙基苯酚，而本研究中，在乙酸乙酯萃取物中有3,5-二甲氧基苯酚和3-苯基苯酚，其可能是解淀粉芽孢桿菌262AG6的抑菌組分之一。

Gowrishankar等[30]報道菌株MMS-50產(chǎn)生的環(huán)二肽(L-亮氨酰-L-脯氨酰)對變形鏈球菌的致齲性質(zhì)具有抑制作用，可以作為新型的和可選擇的抗齲齒劑；Gowrishankar等[31]報道海洋解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)生的環(huán)二肽(L-亮氨酰-L-脯氨酰)能抑制單核球增多性李斯特菌生物膜的形成和毒性作用，能控制由單核球增多性李斯特菌引起的相關(guān)感染。本研究中，在乙酸乙酯萃取物中含有環(huán)(脯氨酰亮氨酰)Cyclo(leucylprolyl)，是結(jié)構(gòu)最簡單的環(huán)肽化合物，具有抗菌、抗癌、抗病毒、受體拮抗劑、酶抑制劑、保護(hù)神經(jīng)元改善腦功能等明顯的生理活性和藥理活性；Yan等[32]報道Achromobacter xylosoxidans菌株產(chǎn)生抑菌物質(zhì)Cyclo(leucylprolyl)，其中 cyclo(L-leucyl-L-prolyl) 環(huán)(L-亮氨酰-L-脯氨酰)(大于6.0 mg/mL)能夠抑制真菌生長。本試驗中解淀粉芽孢桿菌262AG6的次級代謝產(chǎn)物Cyclo(leucylprolyl)可能是該菌株的主要抑菌組分之一。

解淀粉芽孢桿菌262AG6的氯仿萃取物中含有DL-3-(3,4-二羥苯基)丙氨酸(16.438 min)，其上游產(chǎn)品可以是香蘭素[28]、D-酪氨酸、L-酪氨酸[33]，其下游產(chǎn)品為左旋多巴[34]，是一種抗震顫麻痹藥；上游產(chǎn)品香蘭素可能是抑菌物質(zhì)，D-酪氨酸、DL-酪氨酸又可以促進(jìn)植物生長，說明該代謝產(chǎn)物與其抑菌促生作用有關(guān)。

綜上所述，本研究從內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌262AG6發(fā)酵液中檢測到10類29種單體化合物，其中有些代謝產(chǎn)物具體或潛在具有防病促生作用，但該菌株的次級代謝產(chǎn)物的具體抑菌機(jī)理亦尚不明確，還需進(jìn)一步研究與探索。