腹外側(cè)中腦導(dǎo)水管灰質(zhì)多巴胺受體參與丙泊酚麻醉的作用研究

張 益，楊銀銀，熊以強(qiáng)，蒲 青，趙燕飛，劉程曦

0 引 言

盡管全身麻醉藥已在臨床中廣泛運(yùn)用，但具體作用機(jī)制仍是未解之謎。近年的研究發(fā)現(xiàn)，全身麻醉與自然睡眠之間有較多相似之處，大腦中的睡眠覺醒通路同樣也參與了全身麻醉的過程[1-3]。中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)是具有復(fù)雜功能的腦干核團(tuán)，其中腹外側(cè)中腦導(dǎo)水管灰質(zhì)(ventrolateral periaqueductal gray，vlPAG)在疼痛調(diào)節(jié)、防御行為、焦慮以及恐懼等行為等過程中發(fā)揮著重要的作用[4-6]。最新的研究發(fā)現(xiàn)，vlPAG是快速動(dòng)眼(rapid eyes movement，REM)睡眠的重要調(diào)節(jié)腦區(qū)，通過特異性毀損或拮抗vlPAG的GABA能神經(jīng)元可明顯增加小鼠的REM睡眠時(shí)間，反之激活vlPAG的GABA能神經(jīng)元幾乎可以完全消除REM睡眠[7-8]。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)[9]，特異性毀損vlPAG的多巴胺神經(jīng)元縮短丙泊酚麻醉的誘導(dǎo)時(shí)間，同時(shí)延長(zhǎng)其蘇醒時(shí)間，說明了vlPAG在全身麻醉過程中扮演著重要的角色。vlPAG中各類神經(jīng)元上均表達(dá)有豐富的多巴胺受體，可調(diào)節(jié)相應(yīng)神經(jīng)元的活性[10]，而vlPAG多巴胺能受體在全身麻醉中的作用目前仍未見報(bào)道，因此，本研究利用光纖鈣信號(hào)記錄、微注射和在體腦電記錄觀察vlPAG中多巴胺D1和D2受體在丙泊酚麻醉誘導(dǎo)和蘇醒過程中的作用，并由此探究丙泊酚的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物雄性SD大鼠60只，體重250～350 g,購(gòu)于長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(湘)2019-0011。飼養(yǎng)于貴州省麻醉與器官保護(hù)基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室SPF級(jí)動(dòng)物房。大鼠飼養(yǎng)于溫度為22～25 ℃，相對(duì)濕度為 40%～60%，安靜、通風(fēng)及空氣過濾系統(tǒng)良好的SPF環(huán)境中飼養(yǎng)，維持 12h/12h晝夜節(jié)律。

1.2主要儀器和試劑實(shí)驗(yàn)藥物 1% 丙泊酚(Fresenius Kabi，國(guó)藥準(zhǔn)字 J20160089)、SKF-82958C(Sigma，C130-100MG)、SCH-23390(Sigma，D054-25MG)、喹吡羅鹽酸(Sigma，Q102-100MG)、舒必利(Sigma，S8010-100G)、戊巴比妥(Merck，P11011)。

1.3光纖鈣信號(hào)記錄模型及實(shí)驗(yàn)

1.3.1 隨機(jī)數(shù)字表法選取10只大鼠，大鼠經(jīng)腹腔注射10%戊巴比妥(45 mg/kg)麻醉后，將其固定于腦立體定位儀，暴露顱骨并調(diào)平，參照第6版大鼠腦圖譜定位儀于vlPAG(注射坐標(biāo)：Bregma后7.5 mm，左右側(cè)旁開0.6 mm，深度5.4 mm)注射病毒。以150 nL/min的速度吸取病毒(rAAV-hSyn-Gcamp6s-WPRE-pA)，以50 nL/min的速度注射 300 nL病毒到目的位點(diǎn)，注射針原位停留10 min。完成注射后將光纖陶瓷插芯放置在注射位點(diǎn)上方200 μm處并固定。完成后單籠飼養(yǎng)4周，待病毒轉(zhuǎn)染。

1.3.2光纖鈣信號(hào)記錄實(shí)驗(yàn)首先1.5% 異氟醚吸入麻醉下行大鼠尾靜脈穿刺置管，置管成功后將大鼠置于誘導(dǎo)箱內(nèi)。待大鼠蘇醒并自由活動(dòng)1h后開始光纖鈣信號(hào)記錄。記錄跳線與大鼠頭部的陶瓷插芯連接后，記錄大鼠穩(wěn)定清醒狀態(tài)的鈣信號(hào)10 min，然后以11 mg/kg的劑量尾靜脈單次注射丙泊酚，標(biāo)記大鼠翻正反射消失(loss of right reflex，LORR)和翻正反射恢復(fù)(recovery of right reflex，RORR)，待大鼠翻正反射恢復(fù)后繼續(xù)記錄10 min。嚙齒動(dòng)物翻正反射的恢復(fù)及消失可以代表其麻醉意識(shí)的消失及恢復(fù)，因此本實(shí)驗(yàn)采用了LORR以及RORR作為判斷大鼠麻醉誘導(dǎo)及蘇醒的指標(biāo)。

光纖鈣信號(hào)記錄的數(shù)據(jù)采用Matlab 2016a進(jìn)行分析。以記錄神經(jīng)元鈣信號(hào)熒光強(qiáng)度F和基線熒光強(qiáng)度F0的差值為分子，以基線熒光強(qiáng)度F0的值為分母，以ΔF/F[ΔF/F = (F-F0)/F0]反應(yīng)丙泊酚引起的vlPAG神經(jīng)元的熒光強(qiáng)度變化。麻醉誘導(dǎo)期間分析LORR時(shí)間點(diǎn)前后100s內(nèi)vlPAG神經(jīng)元在活性變化(清醒基線(-100～-50 s)、誘導(dǎo)期(-50～0 s)、麻醉早期(0～50 s)和麻醉期(50～100 s)。蘇醒誘導(dǎo)期間分析RORR時(shí)間點(diǎn)前后100s內(nèi)vlPAG神經(jīng)元在活性變化(麻醉基線(-100～-50 s)、復(fù)蘇期(-50～0 s)、蘇醒早期(0～50 s)和蘇醒后期(50～100 s)。

1.4微注射模型及實(shí)驗(yàn)

1.4.1 微注射模型建立按上述鈣信號(hào)建模方法麻醉固定老鼠，于vlPAG埋置微注射雙管套針，于前額葉(坐標(biāo)：Bregma向前3.7 mm，右側(cè)旁開2 mm，深度1.5 mm)埋置腦電記錄電極，配置牙科水泥將套管針和電極固定于顱骨表面。待術(shù)后恢復(fù) 7 d，觀察無(wú)行為學(xué)異常后進(jìn)行行為和腦電實(shí)驗(yàn)。

1.4.2行為及腦電記錄將vlPAG微注射模型大鼠隨機(jī)數(shù)字表法分為5組：D1R激動(dòng)劑組、D1R拮抗劑組、D2R激動(dòng)劑組、D2R拮抗劑組和對(duì)照組，每組10只。按異氟醚麻醉下尾靜脈置管，待大鼠蘇醒，自由活動(dòng)1 h后拔出導(dǎo)管芯并連接微注射內(nèi)管。誘導(dǎo)期記錄：麻醉前10 min，5組大鼠以100 mL/min的速度注射分別給予1 μL的 SKF-82958C、SCH-23390、喹吡羅鹽酸、舒必利和等滲鹽水后，尾靜脈以60 mg/(kg·h)速度泵注丙泊酚，記錄從泵注開始至翻正反射完全消失時(shí)間。蘇醒期記錄：誘導(dǎo)期記錄后所有模型恢復(fù)3 d，以11 mg/kg劑量尾靜脈單次注射丙泊酚，此后以50 mg/(kg·h)丙泊酚維持麻醉20 min，微注射相應(yīng)藥物后停止泵注丙泊酚，記錄大鼠翻正反射記錄恢復(fù)時(shí)間及全程記錄皮層腦電。

1.4.3腦電分析皮層EEG數(shù)據(jù)經(jīng)Sipke2軟件濾波處理后分為 δ 波(1～4 Hz)、θ波(4～8 Hz)、α波(8～12 Hz)、β波(12～25 Hz)以及γ波(25～60 Hz)5個(gè)頻段，分別比較在丙泊酚麻醉期間各組微注射給藥前后各個(gè)頻段波頻率值的差異。

1.5組織學(xué)驗(yàn)證所有大鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，4%多聚甲醛溶液灌流固定組織，冰凍切片機(jī)切片(30 μm)。鈣信號(hào)實(shí)驗(yàn)組大鼠于顯微鏡下觀察，驗(yàn)證病毒注射及光纖埋置位置。微注射組經(jīng)伊紅染色后于體式顯微鏡下，觀察微注射套管位置。參考第六版大鼠腦立體定位圖譜，定位不正確以及有異常組織損傷的數(shù)據(jù)予以剔除并補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1微注射行為學(xué)和腦電結(jié)果與對(duì)照組相比，vlPAG微注射D1R激動(dòng)劑組延長(zhǎng)了丙泊酚麻醉的誘導(dǎo)時(shí)間，縮短了蘇醒時(shí)間(P<0.05)。而D1R拮抗劑組則減少誘導(dǎo)時(shí)間，并延長(zhǎng)蘇醒時(shí)間(P<0.05); 但vlPAG微注射D2R激動(dòng)劑和拮抗劑對(duì)丙泊酚麻醉誘導(dǎo)和蘇醒時(shí)間均無(wú)明顯影響(P>0.05),見表1。

表 1 微注射D1R激動(dòng)劑/拮抗劑和D2R激動(dòng)劑/拮抗劑對(duì)大鼠丙泊酚麻醉LORR和RORR的影響

2.2光纖鈣信號(hào)記錄在丙泊酚誘導(dǎo)翻正反射消失過程中，vlPAG神經(jīng)元的鈣信號(hào)較清醒基線明顯降低(P<0.05)。在丙泊酚麻醉蘇醒期間，與麻醉基線相比，vlPAG神經(jīng)元的鈣信號(hào)在復(fù)蘇期、蘇醒早期和蘇醒后期鈣信號(hào)顯著增加(P<0.05),見圖1。

a、b：分別為L(zhǎng)ORR時(shí)變化線圖和統(tǒng)計(jì)圖； c、d：分別為RORR時(shí)變化線圖和統(tǒng)計(jì)圖

與給藥前相比，D1R激動(dòng)劑組大鼠δ頻段的能量明顯降低(P<0.05)；D1R抑制劑組δ頻段的能量顯著增加(P<0.05)，同時(shí)β頻段的能量明顯增高(P<0.05)。給予D2R激動(dòng)/拮抗劑對(duì)皮層腦電各頻段均未產(chǎn)生明顯的影響(P>0.05)。見表2。

表 2 丙泊酚麻醉下vlPAG微注射前后各組腦電結(jié)果比較

3 討 論

光纖鈣信號(hào)記錄是通過測(cè)定神經(jīng)元鈣離子瞬變時(shí)產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度來(lái)反映局部區(qū)域的神經(jīng)元活動(dòng)強(qiáng)度，是記錄活體動(dòng)物大腦深部結(jié)構(gòu)神經(jīng)元活動(dòng)最靈敏、最簡(jiǎn)便的方法之一[11]。通過光纖鈣信號(hào)技術(shù)，我們發(fā)現(xiàn)在丙泊酚誘導(dǎo)全身麻醉的過程中，vlPAG神經(jīng)元的活性被顯著抑制；在麻醉的蘇醒階段，vlPAG神經(jīng)元又被顯著激活，該結(jié)果說明vlPAG神經(jīng)元的活性與麻醉效應(yīng)之間存在明顯的關(guān)聯(lián)性。有研究表明，清醒時(shí)vlPAG神經(jīng)元的c-fos表達(dá)量明顯高于睡眠時(shí)期，提示vlPAG神經(jīng)元活動(dòng)可隨意識(shí)狀態(tài)的改變而變化[12-13]。這與我們觀察到的結(jié)果相似。同時(shí)，我們前期研究也發(fā)現(xiàn)丙泊酚可以增加vlPAG神經(jīng)元的抑制性突觸后電流，使膜電位去極化，從而抑制vlPAG區(qū)域神經(jīng)元活性[9]。這說明vlPAG神經(jīng)元的活動(dòng)受到了丙泊酚麻醉的調(diào)控。

為進(jìn)一步研究vlPAG在丙泊酚麻醉中作用，我們采用微注射和腦電結(jié)合的方式探討其具體作用機(jī)制。結(jié)果顯示: vlPAG內(nèi)微注射D1受體激動(dòng)/拮抗劑，可以改變丙泊酚麻醉的誘導(dǎo)和蘇醒時(shí)間，并且引起腦電改變；D2受體的激動(dòng)劑或拮抗劑對(duì)丙泊酚麻醉均無(wú)明顯作用，這表明vlPAG的D1受體參與調(diào)控丙泊酚麻醉。Solt等[14]之前的研究發(fā)現(xiàn)，大鼠靜脈注射多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體拮抗劑哌醋甲酯可加速異氟醚麻醉的蘇醒，同時(shí)腦電圖顯示δ頻段能量減少，提示了腦內(nèi)多巴胺能系統(tǒng)參與了全身麻醉的蘇醒過程。進(jìn)一步的研究顯示，靜脈注射D1 受體激動(dòng)劑也可以減短異氟醚麻醉后的蘇醒時(shí)間并引起從持續(xù)異氟醚麻醉中的覺醒，且這一作用可被D1受體特異性的拮抗劑所逆轉(zhuǎn)，但D2受體激動(dòng)/拮抗劑則不影響異氟醚麻醉[15]。在烏拉坦麻醉中激活VTA引起的前額葉皮層由慢波睡眠到覺醒腦電，但前額葉皮層微注射D1受體拮抗劑SCH23390可以逆轉(zhuǎn)激活VTA引起的皮層腦電改變[16]。這些與我們的結(jié)果相似，說明了D1受體可特異性地調(diào)控全身麻醉覺醒。

本研究也存在一些局限性。首先，在光纖鈣信號(hào)記錄中，當(dāng)動(dòng)物處于清醒或蘇醒后狀態(tài)時(shí)，由于動(dòng)物自由活動(dòng)以及樣本量相對(duì)較小，獲得的鈣信號(hào)個(gè)體間差異較大。此外，vlPAG包含多種類型神經(jīng)元，如GABA能神經(jīng)元，谷氨酸能神經(jīng)元以及多巴胺能神經(jīng)元等，多巴胺受體在這些神經(jīng)元上都有不同程度的表達(dá)，哪種神經(jīng)元上的D1受體在丙泊酚全身麻醉中發(fā)揮著最重要的作用，仍需要將各類神經(jīng)元進(jìn)行分類探討。

綜上所述，腹外側(cè)中腦導(dǎo)水管灰質(zhì)神經(jīng)元活性受到在丙泊酚麻醉的調(diào)控，而激活或抑制其神經(jīng)元上表達(dá)的D1受體可對(duì)全身麻醉的誘導(dǎo)和蘇醒過程產(chǎn)生調(diào)控作用。