肉牛支原體病原分離鑒定及藥物敏感性試驗

楊 莉， 姜玲玲， 張 濤， 吳位珩*， 徐景峨， 余 波， 劉 鏡， 楊茂生， 孫啟躍， 馮明祥， 劉 和， 鄒茂華

(1.貴州省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所，貴州 貴陽 550005；2.貴州省關嶺自治縣畜牧服務中心，貴州 關嶺 561300；3.思南畜牧技術推廣站，貴州 銅仁 565100；4.黔西縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，貴州 黔西 551500)

牛支原體是危害養(yǎng)牛業(yè)的一種重要的致病性病原，無細胞壁，介于細胞和病毒之間。致病性支原體除能導致牛肺炎、乳腺炎、關節(jié)炎外，還導致眼結(jié)膜炎、耳炎、生殖道炎癥與不孕等多種疾病[1]。1961年，美國人Hale[2]首次從患乳腺炎的牛乳中分離得到牛支原體，該病原在世界范圍內(nèi)普遍存在。自2008年以來，我國大部分省(地區(qū))從外地引入肉牛爆發(fā)了以壞死性肺炎為主要特征的“傳染性牛支原體肺炎”疫情，多數(shù)牛在運輸?shù)侥康牡睾?～2周發(fā)病，發(fā)病率為20%～100%，病死率高達10%～50%，給我國肉牛養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失[3]。隨著貴州扶貧攻堅的開展，肉牛引進量不斷增大，帶來了一系列流行病的感染、發(fā)生，肉牛運輸綜合征最為突出，而牛支原體病是引起牛運輸綜合征的主要病因，給貴州省養(yǎng)牛業(yè)造成巨大經(jīng)濟的損失，為此項目組對牛支原體病在貴州省的流行情況進行調(diào)查，并對牛支原體病原進行分離鑒定、生物學特性、分子診斷及藥物敏感性研究。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 試驗樣本 無菌采集疑似感染牛支原體病牛的鼻拭子和病死牛肺。

1.1.2 參考菌株 牛支原體菌株由華中農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院惠贈。

1.1.3 引 物 引物序列為：上引物，5′-ACGTGACTACTTCACCCTGAT-3′；下引物，5′-TAGACCGACTATTTCACCTTC-3′，由寶生物工程(大連)有限公司合成。

1.1.4 生化試劑 PPLO肉湯培養(yǎng)基、PPLO固體培養(yǎng)基(青島高科技工業(yè)園，海博生物技術有限公司)；特級馬血清、酵母粉、精氨酸(北京索萊寶科技有限公司)；Lab-Aid 820核酸提取Mini試劑盒(廈門致善生物科技股份有限公司)；Goldview核酸染料、蛋白酶K、十二烷基硫酸鈉、EDTA、Tris-HCL、瓊脂糖、DL2000Marker、2×TaqPCRMasterMix(10 mmol/L Tris-HCl、50 mmol/L KCl、1.5 mmol/L MgCl2、0.05 U Poymerase/μL)、去離子水(天根生化科技[北京]有限公司)；細菌微量生化鑒定管(青島高科技工業(yè)園，海博生物技術有限公司)；藥敏試紙(杭州濱和微生物試劑有限公司)。

1.1.5 主要儀器 石蠟切片機(Leica RM2125，德國)；高通量快速研磨儀(海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司)；Lab-Aid 820核酸提取儀(廈門百維信生物科技有限公司)；電子天平(美國奧豪斯AR2140)；高速冷凍離心機(美國賽麥飛SORVALL：LEGEND MICRO 21R)；梯度PCR擴增儀、電泳儀、紫外透射儀、凝膠成像儀(德國BIOMETRA)；紫外分光光度計：北京普析(TU-1810SPC)。

1.2 方 法

1.2.1 樣本采集 2018年采自黔西縣牛場患病牛的鼻拭子和死亡牛肺。無菌采集疑似牛支原體肺炎病死牛肺，或采用棉簽采集疑似牛支原體肺炎鼻涕(鼻拭子)，用冷藏箱帶到實驗室，冷藏備用。

1.2.2 組織樣本固定 將病死牛肺用生理鹽水清洗后，置10%的甲醛溶液中固定，待進行組織病理切片的制備。

1.2.3 病原分離培養(yǎng) 鼻拭子分離培養(yǎng)：取1 mL生理鹽水將鼻拭子浸潤，盡量將藥棉棒上的鼻涕清洗在試管里，棄去藥棉棒，采用孔徑為0.45 μm濾膜過濾上述溶液后接種于PPLO肉湯培養(yǎng)基中，5% CO2、37 ℃恒溫分別培養(yǎng)24，48，72 h，觀察培養(yǎng)基的顏色及培養(yǎng)液絮狀物的變化情況，如果由紅變黃，有絮狀物出現(xiàn)，轉(zhuǎn)接于PPLO固體培養(yǎng)基中，5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h以上，同時取1 mL培養(yǎng)液置于1.5 mL的離心管中，以備提取病原菌DNA。

病死牛肺分離培養(yǎng)：采用生理鹽水將采集到的牛肺沖洗，將肺置于平皿中，用手術剪刀取中間沒有污染部分，進行組織研磨，采用孔徑為0.45 μm濾膜過濾后接種于PPLO肉湯培養(yǎng)基中，5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)24，48，72 h，觀察培養(yǎng)基的顏色及培養(yǎng)液絮狀物的變化情況，如果由紅變黃，有絮狀物出現(xiàn)，可轉(zhuǎn)接于PPLO固體培養(yǎng)基中，5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h以上，同時取1 mL培養(yǎng)液置于1.5 mL離心管中，以備提取病原菌DNA。

1.2.4 組織病理切片制備 將置10%的甲醛溶液中固定1周的肺、組織，進行酒精脫水和二甲苯透明，脫水時間從低濃度到高濃度(見表1)，接著讓石蠟充分滲入到肺組織中，使組織結(jié)實，有利于連續(xù)切片。然后進行常規(guī)切片，染色，并在顯微鏡下觀察，記錄組織結(jié)構(gòu)變化。

表1 肺組織脫水步驟

1.2.5 生化反應試驗 按常規(guī)操作將分離的16株菌株(HZ株、25025株、J89310、J7、J9、J23、J31、J39、J40、J41、W25、W28、W44、W69、W77、W88)，接種于細菌微量生化鑒定管中(購自青島海博生物技術有限公司)，5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)48～72 h，觀察結(jié)果并記錄。

1.2.6 PCR檢測與鑒定 組織樣本肺DNA提?。喝颖痉紊僭S，采用高通量快速研磨儀研磨，加入900 μL生理鹽水，反復凍融3次，然后5 000 r/min離心5 min，取700～900 μL上清液，加入20 μL蛋白酶K，100 μL 10% SDS液，55 ℃水浴箱中加熱30 min至組織消化完全，取出冷卻。采用核酸提取Mini試劑盒提取所需DNA模板。

樣本鼻拭子DNA提?。河? mL ddH2O將鼻拭子完全浸潤，盡量將藥棉棒上的鼻涕清洗在試管里，棄去藥棉棒，將試管里的溶液全部移入1.5 mL的離心管中，10 000 r/min離心2 min，棄上清，收集沉淀。采用核酸提取Mini試劑盒提取所需DNA模板。

分離培養(yǎng)菌株DNA提取：取培養(yǎng)菌液1 500 μL于2 mL的離心管中，10 000 r/min離心2 min，棄上清，收集沉淀。采用核酸提取Mini試劑盒提取所需DNA模板。

PCR擴增條件：采用提取的DNA摸板，利用合成的引物在PCR酶的作用下進行擴增。反應體系和條件：PCR酶為10 μL，支原體標準菌株DNA模板2 μL，樣本DNA模板2 μL，上下引物各1 μL，加入ddH2O至25 μL，在Tgradient96擴增儀下進行如此循環(huán)：94 ℃變性5 min，94 ℃ 30 s，52℃ 30 s，72 ℃ 90 s，30個循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。反應結(jié)束后將擴增產(chǎn)物取5 μL進行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

PCR產(chǎn)物鑒定：牛肺炎支原體的PCR擴增片段經(jīng)膠回收，送上海生工寶生物工程有限公司測序，并將測序結(jié)果在NCBI中進行病原菌的鑒定和同源性的比對。

1.2.7 藥物敏感性試驗 分別將分離到的菌株采用消毒過的藥棉棒，蘸取100 μL菌液，均勻地涂布于PPLO固體培養(yǎng)基上，再將藥敏試紙置于均勻涂布有菌液的固體培養(yǎng)基上，每個培養(yǎng)基一般放置7～9張藥敏試紙，然后5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)1～2 d，觀察并記錄抑菌圈直徑的大小，并判斷藥物的敏感性。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)病牛臨床癥狀

發(fā)病牛臨床癥狀主要表現(xiàn)為體溫升高、精神沉郁、食欲減退、被毛粗亂、咳嗽、氣喘、流黏性或膿性鼻液、拉稀、血便、關節(jié)炎、結(jié)膜炎、極度消瘦，甚至衰竭死亡。解剖后死亡牛肺部有干酪樣壞死灶或化膿性壞死灶，胸腔內(nèi)有大量纖維性滲出液或膿性液體，有些出現(xiàn)肺與胸腔粘連，以及消化道潰瘍等。

2.2 病原菌的分離培養(yǎng)結(jié)果

2018年6月，項目組自黔西隔離場采集引進能繁母牛疑似病牛鼻拭子樣本163份，死亡牛肺樣本1份，檢測出60份牛支原體陽性樣本，分離培養(yǎng)出18株形態(tài)特征和生長特性與牛支原體相符的菌株。分離的菌在PPLO液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h后，液體PPLO培養(yǎng)液開始變色；分離傳代培養(yǎng)時，液體變色時間縮短，只需要24 h就可由紅變黃。在PPLO固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)72 h后，可見針頭大小不一的菌落(圖1)，在普通光學顯微鏡下可看到菌落呈圓形，邊緣整齊，具有典型的“油煎蛋”狀菌落(圖2)。

圖1 PPLO固體培養(yǎng)基上針頭大小不一的菌落

圖2 顯微攝影下典型的“油煎蛋狀”形態(tài)(40×)

2.3 組織病理切片結(jié)果

?；贾гw肺炎后，往往并發(fā)其他病原菌感染，使病牛病情加重，甚至造成死亡，因此不僅僅肺部發(fā)生病理變化，其他器官也隨著病情的變化發(fā)生病變，具體的病理變化由圖3(a-1和a-2)肺組織病理切片結(jié)果可見，肺間質(zhì)動脈血管充血、肺間質(zhì)水腫變寬，呈灰白色；肺間質(zhì)纖維增生，有實質(zhì)性病變；肺泡上皮細胞變性壞死；肺泡內(nèi)有大量粘液。由圖3(b-1和b-2)肝組織病理切片結(jié)果可見，肝小葉中央靜脈瘀血，間質(zhì)中央動脈充血，肝上皮細胞脂肪變性和顆粒變性；間質(zhì)中炎癥細胞增生。由圖3(c-1和c-2)淋巴組織病理切片結(jié)果可見，牛淋巴結(jié)皮質(zhì)和髓質(zhì)結(jié)構(gòu)不清，髓質(zhì)間水腫，淋巴小結(jié)的生發(fā)中心淋巴細胞活化，淋巴細胞增生。由圖3(d)的心組織病理切片結(jié)果可見，牛心肌顆粒變性，肌纖維之間水腫。由圖3(e)脾組織病理切片可見，牛脾臟白髓內(nèi)淋巴小結(jié)活化，淋巴細胞增生，紅髓內(nèi)淋巴細胞增生，脾索之間水腫。

注：a-1和a-2為肺組織；b-1和b-2為肝組織；c-1和c-2為淋巴組織；d為心組織；e為脾組織。

2.4 生化試驗結(jié)果

常規(guī)操作將分離的菌株接種于細菌微量生化鑒定管中，由結(jié)果(表2)可知：所有菌株對酚紅葡萄糖肉湯、七葉苷呈陽性反應，對明膠、L-精氨酸雙水解酶、尿素酶呈陰性反應；HZ、J23和W44葡萄糖發(fā)酵管為陽性，其余菌株呈陰性反應；菌株25025、J41和W69甘露醇反應呈陽性，其余菌株為陰性反應。

表2 牛支原體生化反應試驗

2.5 樣本及分離菌株的PCR檢測結(jié)果

對2018年采自牛場樣本163份牛鼻拭子和肺進行PCR檢測，同時進行細菌學分離培養(yǎng)。結(jié)果共檢測出陽性樣本60份，且與細菌學檢驗結(jié)果一致如圖4所示。同時將PCR擴增片段經(jīng)膠回收，送上海生工寶生物工程有限公司測序，并將測序結(jié)果在NCBI中進行病原菌的鑒定和同源性的比對。結(jié)果表明，擴增片段為牛支原體的特異性條帶，同源性的比對結(jié)果為93.02%～100%。

2.6 藥物敏感性試驗結(jié)果

通過將藥敏試紙置于均勻涂布有菌液的固體培養(yǎng)基上，經(jīng)5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)1～2 d，觀察并記錄抑菌圈直徑的大小，結(jié)果如表3所示。

注：M為Marker DL2000；1為陰性對照；2為標準陽性；3～21為被檢出的陽性樣本。

表3 藥物抑菌圈直徑大小的記錄 mm

3 結(jié)論與討論

牛支原體病在國外是一個常見病，但是在我國一直沒有引起足夠重視。國內(nèi)牛群發(fā)病基本上按照牛胸膜肺炎疫情進行防治，誤判病情而忽略了基本的防護常識，按照牛胸膜肺炎進行藥物治療，無法有效地保護發(fā)病牛群，不僅僅造成藥物浪費，同時造成發(fā)病牛死亡,帶來巨大經(jīng)濟損失。據(jù)報道[4]，臨床健康犢牛購入24 h后，鼻腔中可檢出牛支原體，但大部分牛7 d后經(jīng)鼻腔可檢牛支原體。金云云等[5]研究認為，多數(shù)牛在運達目的地后2周左右發(fā)病，不良環(huán)境下如途中遭雨淋等，牛可在運達目的地后第2天即發(fā)病。感染牛支原體的?？蓴y帶病原體數(shù)月甚至數(shù)年而成為一個傳染源，主要傳播途徑是通過飛沫呼吸道傳播，近距離接觸、吮吸乳汁或生殖道接觸等也可傳播牛支原體。

隨著扶貧工作的深入開展，養(yǎng)牛產(chǎn)業(yè)成為了貴州省多地脫貧攻堅的主導產(chǎn)業(yè)及重要抓手。肉牛引進量不斷增大，帶來了一系列流行病發(fā)生和感染問題，肉牛支原體病就是主要疾病。因而筆者對牛支原體病在貴州省的發(fā)生、流行情況進行了調(diào)查，并對牛支原體病原進行了分離鑒定、生物學特性、分子診斷和藥物敏感性等方面的研究工作。研究表明：牛支原體在分類上屬于支原體屬，該病原具有體型微小、基因組成分微量等顯著特點[6]。支原體的培養(yǎng)基除基礎營養(yǎng)物質(zhì)外，尚需要豐富的血清蛋白、膽固醇和酵母浸液，血清主要提供膽固醇、脂肪酸和蛋白質(zhì)，酵母浸液提供核苷前體、維生素及刺激生長的某些成分，牛支原體在pH 7.0～8.0范圍內(nèi)生長良好，在一定的CO2(5%～10%)環(huán)境、濕度(60%～80%)、溫度(36～37 ℃)條件下生長較好，培養(yǎng)2～3 d，在低倍鏡下觀察瓊脂培養(yǎng)基上長出“煎蛋樣”菌落。?；贾гw肺炎后，往往并發(fā)或繼發(fā)其他病原菌感染，而使病牛病情加重，因此不僅僅肺部發(fā)生病理變化，其他器官也隨著病情的變化發(fā)生病變，甚至造成死亡。牛支原體既不分解葡萄糖、甘露醇、尿素酶、明膠，也不水解精氨酸，酚紅葡萄糖肉湯呈陽性反應，接種菌株后，放置37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)基由紅色變?yōu)辄S色，七葉苷生化反應為陽性，符合牛支原體的生化特征。分離菌株的PCR檢測及測序結(jié)果表明：擴增片段為牛支原體的特異性條帶，在NCBI同源性的比對結(jié)果為93.02%～100%，這說明牛支原體是牛場重要的病原菌之一。由于引起呼吸道疾病的病因復雜，有必要進一步對其他病原菌(如病毒、細菌等)進行調(diào)查，以便更加全面地了解牛場的混合感染情況。抗生素治療是控制和治療牛支原體病的主要手段。由于支原體結(jié)構(gòu)和功能的特點使其對β-內(nèi)酰胺類抗菌藥和磺胺類藥物具有內(nèi)在的抗性，但是對影響蛋白質(zhì)或核酸合成的抗生素敏感[7]。近年來，牛支原體耐藥的報道逐漸增多，從比利時、德國和意大利3個國家分離的牛支原體對替米考星、泰樂菌素等常用藥具有嚴重的耐藥性[8]。張利等[9]研究表明，牛支原體對恩諾沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星等藥物的抵抗性增強。馬艷君等[10]研究表明，牛支原體對恩諾沙星和頭孢噻呋有耐藥。本試驗對分離的支原體進行了藥物敏感性試驗，結(jié)果表明對氟苯尼考、諾氟沙星、新霉素、頭孢派酮、氧氟沙星高度敏感；對卡拉霉素、呋喃妥英、呋喃唑酮、連霉素中度敏感；對頭孢曲松、強力霉素、頭孢噻肟、四環(huán)素、甲氧嘧啶低度敏感；對利福平、頭孢西丁、氨芐西林、青霉素G、林可霉素、頭孢呋辛、阿莫西林、頭孢唑林不敏感。這一結(jié)果對牛場支原體疾病的發(fā)生、流行及防治起到了積極的指導作用。