引經(jīng)藥柴胡對姜黃素在大鼠體內(nèi)組織分布的影響

李 嬌 阮志國 李 江 付 鵬 李曉梅 榮慧瑩 侯安國,2*

1.云南中醫(yī)藥大學(xué),云南 昆明 650500；2.云南省高校外用給藥系統(tǒng)與制劑技術(shù)研究重點(diǎn)實驗室，云南 昆明 650500

姜黃素(Curcumin，Cur)是從姜科姜黃屬植物的根莖中提取的一種天然多酚類化合物，具有廣泛的藥理活性、抗癌譜廣且毒副作用小[1-2]，可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，抑制其生長、增殖、轉(zhuǎn)移和血管生長等[3]。柴胡始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，來源于[4]傘形科植物柴胡(BupleurumchinenseDC)或狹葉柴胡(BupleurumscorzonerifoliumWilld)的干燥根(本研究所用柴胡為前者)。其味苦，性微寒，歸肝膽經(jīng)，是公認(rèn)的肝經(jīng)引經(jīng)藥[5-6]。柴胡作為引經(jīng)藥使用在很多中藥古方中可以見到，如《太平惠民合劑局方》中的逍遙散、《醫(yī)方集解》中的龍膽瀉肝湯，用柴胡舒利肝膽，并能引諸藥歸肝膽經(jīng)[6]?，F(xiàn)代中醫(yī)臨床在辨證論治的基礎(chǔ)上選用引經(jīng)藥也取得了很大成效，郭利華應(yīng)用不同中藥引經(jīng)藥治療腫瘤，效果良好[7]；石氏傷科在治療骨傷疾患時非常注重引經(jīng)藥的應(yīng)用，胸脅部使用肝經(jīng)引經(jīng)藥柴胡、香附藥對，上肢選用桂枝，下肢選用牛膝等[8]。

本研究以姜黃素為模型藥物，將姜黃素與引經(jīng)藥柴胡合用，通過柴胡對姜黃素在大鼠體內(nèi)分布的影響研究，驗證引經(jīng)藥可“引藥入病所”的靶向增效作用。同時將中醫(yī)藥引經(jīng)理論與藥物作用相結(jié)合，在此基礎(chǔ)上應(yīng)用現(xiàn)代藥學(xué)理論來對柴胡的引經(jīng)作用進(jìn)行研究，為柴胡輔助肝靶向制劑給藥提供新的思路。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260 高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；HSC-12A氮吹儀(天津市恒奧科技發(fā)展有限公司)；TGL-16G高速臺式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；XK96-A快速混勻器(姜堰市新康醫(yī)療器械有限公司)；BT25S分析天平(賽多利斯儀器有限公司)。

1.2 藥物與試劑 姜黃素對照品(純度：98.7%，批號：110823-201706)，尼群地平對照品(純度：99.4%，批號：100585-201705)均來自中國食品藥品檢定研究院；姜黃素(純度≥98%，批號：DST181126—043，成都德思特生物技術(shù)有限公司)甲醇、乙腈為色譜純，其它試劑均為分析純。

1.3 實驗動物 SPF級SD雄性大鼠，體重(220±20)g，購于湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司，動物合格證：SCXK(湘)2016-0002。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse-C18(5 μm，4.6×250 mm)；柱溫：40 ℃；流動相：1%冰乙酸∶乙腈(48∶52)；檢測波長426 nm；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 藥液、對照品溶液的制備

2.2.1 藥液制備 ①柴胡提取液的制備：用水加熱回流提取(10倍水加熱回流3次，每次30 min)，并分別調(diào)整藥物濃度為每mL含生藥0.05 g、0.1 g和0.2 g。

②姜黃素混懸液的制備：按大鼠體重稱取姜黃素，加入適量純凈水，攪拌均勻即得。

③姜黃素與柴胡混合液的制備：按大鼠體重稱取姜黃素，加入適量柴胡提取液，攪拌均勻即得。

2.2.2 姜黃素對照品儲備液和內(nèi)標(biāo)溶液的制備 精密稱取姜黃素對照品于棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成濃度為1.004 mg/mL的姜黃素對照品儲備溶液。精密稱取內(nèi)標(biāo)尼群地平對照品于容量瓶中，加甲醇定容，制成含尼群地平對照品7.50 mg/mL的溶液，4 ℃密封保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 樣品處理方法

2.3.1 組織勻漿的制備 大鼠禁食12 h，自由飲水，在固定時間點(diǎn)處死大鼠，迅速取出肝、心、脾、肺、腎組織，用生理鹽水洗凈各組織表面的殘血，濾紙吸干，精密稱取各組織臟器1 g，剪碎，加入0.7 mL生理鹽水進(jìn)行組織勻漿，再加入適量生理鹽水使其體積為3 mL。

2.3.2 組織樣品的處理 精密吸組織勻漿液500 μL，精密加入內(nèi)標(biāo)溶液20 μL，混勻后加入乙腈3 mL，渦旋3 min，6000 r/min離心10 min，取上清液2.5 mL水浴(40±0.5)℃氮?dú)饬飨麓蹈?，?00 μL甲醇復(fù)溶，渦旋3 min，0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性試驗 分別制備大鼠空白肝、心、脾、肺、腎組織空白勻漿液，含姜黃素對照品的各組織勻漿液，按照“2.3.2”項下方法處理按“2.1”項下條件進(jìn)行檢測。在上述色譜條件下，內(nèi)源性雜質(zhì)與姜黃素和內(nèi)標(biāo)分離良好，不干擾待測物的測定，表明該方法的專屬性好。如圖1所示。

2.4.2 線性關(guān)系考察 精密量取“2.2.2”項下姜黃素對照品儲備液適量，加入到各空白組織勻漿液中，制成姜黃素質(zhì)量濃度為0.100、0.502、1.004、5.020、10.040、15.060 μg/mL的質(zhì)控樣品，按“2.3.2”項下進(jìn)行處理，記錄色譜圖，以姜黃素和內(nèi)標(biāo)的峰面積比值為縱坐標(biāo)，姜黃素質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，作標(biāo)準(zhǔn)曲線(回歸方程見表1)。以姜黃素峰信噪比為3時樣品濃度為最低檢測限，測得其最低檢測限為0.100 μg/mL。

1-姜黃素 2-內(nèi)標(biāo)A.空白肝 B.空白肝加對照品 C.空白心 D.空白心加對照品 E.空白脾 F.空白脾加對照品 G.空白肺 H.空白肺加對照品 I.空白腎 J.空白腎加對照品圖1 姜黃素HPLC圖譜

表1 姜黃素的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

2.4.3 回收率試驗 精密量取“2.2.2”項下姜黃素對照品儲備液適量，加入到各空白組織勻漿液中，制成姜黃素低、中、高三個質(zhì)量濃度(0.151、5.020、12.200 μg/mL)的質(zhì)控樣品，按“2.4”項下方法操作，進(jìn)樣，檢測并記錄姜黃素峰面積(As)與內(nèi)標(biāo)的峰面積(Ai)的比值W1，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算樣品的含量，將樣品的實測質(zhì)量濃度與理論質(zhì)量濃度進(jìn)行比較，計算方法回收率。另精密移取低、中、高3個濃度的姜黃素對照品溶液，加入20 μL內(nèi)標(biāo)，渦旋3 min混勻，水浴(40±0.5)℃氮?dú)饬飨麓蹈珊蠹?00 μL甲醇復(fù)溶，渦旋3 min，0.22 μm微孔濾膜濾過進(jìn)樣測定，記錄姜黃素峰面積(As)與內(nèi)標(biāo)的峰面積(Ai)的比值W2，W1/W2得萃取回收率。結(jié)果表明，姜黃素的方法回收率和萃取回收率的RSD均≤7.36%，符合生物樣品定量分析的相關(guān)要求。見表2。

表2 姜黃素回收率試驗結(jié)果 (n=5)

2.4.4 精密度試驗 按“2.4.3”項下方法制備姜黃素低、中、高三個質(zhì)量濃度(0.151、5.020、12.200 μg/mL)的質(zhì)控樣品，按照“2.3.2”和“2.1”項下試驗，在同一天內(nèi)不同時間測定5次，進(jìn)行日內(nèi)精密度考察，在相同條件下每隔1 d測定一次，連續(xù)測定3 d，進(jìn)行日間精密度考察。結(jié)果顯示，各組織勻漿的日內(nèi)與日間精密度相關(guān)RSD均≤5.84 %，符合生物樣品中方法學(xué)的要求。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗 按“2.4.3”項下方法制備姜黃素低、中、高三個質(zhì)量濃度(0.151、5.020、12.200 μg/mL)的質(zhì)控樣品，考察室溫放置12 h，-20 ℃反復(fù)凍融3次，-80 ℃放置兩周條件下樣品的穩(wěn)定性。在穩(wěn)定性實驗中不同條件下樣品溶液中姜黃素含量的RSD均≤9.41 %，結(jié)果表明含姜黃素的血漿和組織樣品在室溫放置12 h，-20 ℃反復(fù)凍融3次，-80 ℃放置兩周的條件下具有良好的穩(wěn)定性。

2.5 組織分布學(xué)研究[9-10]

2.5.1 大鼠給藥及取材 取雄性SD大鼠20只適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)分為4組，分別為姜黃素(500 mg/kg)單用組，以及姜黃素(500 mg/kg)分別與高、中、低劑量柴胡(0.51 mg/kg、1.02 mg/kg、2.04 mg/kg)合用組，每組5只，隔夜禁食不禁水，采用大鼠分別灌服姜黃素、姜黃素與柴胡混合液。給藥后分別于0、5、15、30、45 min處死，迅速取出肝、心、脾、肺、腎，用生理鹽水洗凈各組織表面的殘血，濾紙吸干，稱重，同“2.3”項下處理，制備待測樣品，按“2.1”項下進(jìn)樣測定分析。

2.5.2 藥物組織分布圖 姜黃素聯(lián)合低劑量、中劑量柴胡組口服給藥后，姜黃素在肝臟、脾臟中的分布都比較多，15 min時姜黃素聯(lián)合低劑量組藥物在肝臟中分布最多。姜黃素聯(lián)合低劑量柴胡組大鼠姜黃素質(zhì)量分?jǐn)?shù)在肝臟中最高，其次是脾臟，在肺臟中最低。其大鼠肝臟、脾臟、腎臟組織中姜黃素質(zhì)量濃度均高于另外三組。姜黃素給藥后經(jīng)體循環(huán)快速富集于肝臟和脾臟，而在其他組織中分布較少。如圖2所示。

圖2 組織分布圖

2.5.3 靶向性評價[8,10-11]為了更好的評價引經(jīng)藥柴胡對姜黃素在大鼠體內(nèi)組織分布的影響，引入以下參數(shù)：峰濃度比(Ce)、總靶向系數(shù)(Te)、藥物分布效率(Rte)和相對攝取率(Re)。

Ce=(Cmax)m /(Cmax)s

Te=AUC(各個)/AUC(總和)

Rte=(Te)m/(Te)s

Re=(AUCi)m/(AUCi)s

注：m、s分別表示姜黃素與柴胡合用組和姜黃素單用組

其中，Te表示某組織藥物占所測各臟器中總藥量的百分比；兩種制劑在某組織中的藥物分布效率可用Rte表示，Rte>1，表示藥物對組織臟器的選擇性強(qiáng)，即靶向性強(qiáng)；Re表示在某一器官或組織內(nèi)兩種不同制劑的藥物分布情況，Re>1表示在該器官或組織有靶向增強(qiáng)作用，越大增強(qiáng)效果越好，<1則表示無靶向增強(qiáng)作用。具體結(jié)果見表3。

從表3可以看出，姜黃素聯(lián)合低、中劑量柴胡組與姜黃素單用組相比，姜黃素在肝、脾、腎組織藥物濃度較高，其中在肝臟中藥物濃度顯著增加。此外，姜黃素聯(lián)合低劑量柴胡組和姜黃素聯(lián)合中劑量柴胡組姜黃素在大鼠肝臟和脾臟中AUC分別是姜黃素單用組的1.3、1.4、1.1、1.1倍。靶向性相關(guān)結(jié)果表明，當(dāng)姜黃素和低劑量、中劑量的柴胡合用時，肝靶向作用明顯，峰濃度比分別為1.94、1.47，相對攝取率分別為1.29、1.10，而與高劑量的柴胡合用時則無靶向性。同樣，姜黃素與高、中、低劑量的柴胡合用都具有較強(qiáng)的脾臟引經(jīng)作用。此外，姜黃素與中劑量的柴胡合用時，姜黃素在心臟、肺臟、腎臟的選擇性比與低劑量的柴胡合用時的強(qiáng)。

表3 灌胃給予姜黃素和姜黃素聯(lián)合柴胡后姜黃素在大鼠組織中的靶向性

3 討論

低劑量的柴胡與姜黃素合用可增加姜黃素在肝臟、脾臟的分布，中劑量的柴胡與姜黃素合用可增加姜黃素在肝臟、心臟、脾臟、腎臟的分布，而高劑量的柴胡與姜黃素合用后除了脾臟，其它臟器的藥物分布均減少。以峰濃度比、總靶向系數(shù)、藥物分布為評價指標(biāo)，低劑量柴胡組肝靶向效果最好，表明柴胡的肝靶向性與其劑量存在一定的關(guān)聯(lián)性。

引經(jīng)藥的應(yīng)用是中醫(yī)方劑配伍的一大特色，其作用是使藥物有效成分靶向集中于特定的部位，從而提高療效，其應(yīng)用在臨床上頗具意義[12-16]。本研究中，姜黃素配伍引經(jīng)藥柴胡后，大鼠的肝、心、脾、肺、腎組織藥物濃度均有一定的增加。其中在肝臟中藥物濃度顯著增加，說明了柴胡的引經(jīng)作用與其改變藥物體內(nèi)分布直接相關(guān)。本研究將中醫(yī)藥引經(jīng)理論與藥代動力學(xué)研究方法結(jié)合，探討了引經(jīng)藥柴胡對姜黃素在大鼠體內(nèi)分布的影響，結(jié)果表明，柴胡對姜黃素在大鼠體內(nèi)具有引藥入肝經(jīng)的作用。同時本研究也為柴胡引經(jīng)的有效性提供了依據(jù)，同時為柴胡輔助肝靶向制劑給藥提供新的思路。