山慈菇含藥血清對人乳腺癌SK-BR-3細胞增殖、凋亡以及遷移能力影響的實驗研究

陳思 邢曉靜

摘要：目的 觀察山慈菇含藥血清對人乳腺SK-BR-3細胞增殖、凋亡以及遷移能力的影響。方法 選用20只SD雌性大鼠，2月齡，體重（200±20）g，使用隨機數(shù)字表法將大鼠隨機分為實驗組和空白對照組，每組10只，實驗組大鼠按0.01 mL/g灌胃山慈菇濃煎劑，對照組大鼠給予等體積的生理鹽水，每日灌胃1次，連續(xù)6d，末次灌胃后，腹主動脈取血，制作含藥血清;同時培育人乳腺癌SK-BR-3細胞。使用MTT法檢測人乳腺癌SK-BR-3細胞增殖情況、熒光顯微鏡觀察SK-BR-3凋亡情況以及劃痕試驗檢測SK-BR-3細胞遷移情況。結(jié)果 與對照組比較，實驗組能夠明顯抑制人乳腺癌SK-BR-3細胞的增殖、誘導細胞凋亡以及延緩人乳腺癌SK-BR-3細胞向劃痕中央聚集。結(jié)論 山慈菇含藥血清能夠有效抑制人乳腺癌SK-BR-3細胞活性，并加速細胞凋亡以及延緩細胞的遷移能力。

關鍵詞：山慈菇含藥血清;人乳腺癌SK-BR-3細胞;細胞凋亡;細胞遷移

【Abstract】Objective：To observe the effects of Iphigenia indica Kunth drug serum on the proliferation，apoptosis and migration ability of human breast SK-BR-3 cells. Methods：20 SD female rats of 2 months old and weighing （200 ± 20）g were randomly divided into an experimental group and a blank control group by using a random number table method，10 rats per group. The rats in the experimental group were administered with Iphigenia indica Kunth decoction and the rats in the control group were given the same volume of physiological saline once a day for 6 days. In the last time，the abdominal aorta was taken for blood to make drug serum. At the same time human breast cancer SK-BR-3 cells were bred. MTT method was used to detect the proliferation of the human breast cancer SK-BR-3 cells. SK-BR-3 apoptosis was observed by using a fluorescence microscope，and SK-BR-3 cell migration was detected by a scratch test. Results：Compared with the control group，the experimental group can significantly inhibit the proliferation of the human breast cancer SK-BR-3 cells，induce cell apoptosis and delay the accumulation of the human breast cancer SK-BR-3 cells toward the center of the scratch. Conclusion：Iphigenia indica Kunth drug serum can effectively inhibit human breast cancer SK-BR-3 cell activity，accelerate cell apoptosis and delay cell migration.

【Key words】Iphigenia indica Kunth drug serum，human breast cancer SK-BR-3 cells，cell apoptosis，cell migration

乳腺癌是常見的女性疾病之一，近年來其發(fā)病率呈逐年上升趨勢。隨著醫(yī)學技術的發(fā)展，手術、化療及放療等治療手段不斷提高，雖然總體5年內(nèi)的生存率得到明顯提升，但是死亡人數(shù)依然居高不下，嚴重威脅著女性的健康安全[1]。同時靶向藥物雖然能夠延長患者的生存時間，但是整體治療效果不能夠達到預期，并且其毒副作用往往降低患者的生存質(zhì)量[2]?，F(xiàn)代中藥藥理研究發(fā)現(xiàn)山慈菇中藥能夠明顯抑制腫瘤細胞的增殖、分裂，降低腫瘤的復發(fā)率和轉(zhuǎn)移，并且毒副作用小，能夠更好的改善患者的生存質(zhì)量[3]。

山慈菇始載于《本草拾遺》，性甘、涼、微辛，具有清熱解毒、消癰散結(jié)之功，在腫瘤的治療領域應用廣泛，能夠通過干預腫瘤細胞的增殖、分裂、遷徙以及心血管的生成，從而達到治療腫瘤的作用[4]。本實驗通過觀察山慈菇含藥血清對乳腺癌SK-BR-3腫瘤細胞的影響作用，探討其干預乳腺癌細胞增殖、凋亡以及遷移能力的作用機制。

1 實驗材料

1.1 實驗藥物及動物的制備 選用20只SD雌性大鼠，2月齡，體重（200±20）g，使用隨機數(shù)字表法將大鼠隨機分為實驗組和空白對照組，每組10只。

細胞培養(yǎng)：人乳腺癌SK-BR-3細胞為貼壁生長，將細胞放置于含有10%特級牛血清、1%青鏈霉素雙抗的DMEM細胞培養(yǎng)液中，SK-BR-3細胞繁殖到80%融合時，使用消化液將貼壁生長的細胞進行傳代。隨機選擇對數(shù)期的SK-BR-3細胞放在CO2培育箱中，每隔24h進行換液傳代[5]。

藥物制備：100 g山慈菇第1次加入8倍量的水煎煮30 min，第2次加入4倍量的水煎煮20 min，合并濾液，進行過濾，然后將濾液濃縮至1.21 g生藥/mL。

2 實驗方法

2.1 實驗動物給藥 根據(jù)成人每日臨床劑量30 g，按大鼠等效劑量相當于人的6.3倍計算，且大鼠胃容量為0.875mL/100 g[6]。山慈菇組大鼠給藥劑量為：山慈菇濃煎劑0.01 mL·（g·d）;對照組大鼠給予等體積的生理鹽水，每日灌胃1次，連續(xù)6d。

2.2 實驗取材 取材當天，禁食水，在大鼠末次給藥2h后，以0.015mL/g劑量的水合氯醛進行腹腔注射，麻醉大鼠，用無抗凝劑的真空采血管從大鼠腹主動脈取血，靜置2 h，3000 r/min 離心10 min，取上層血清，置于56℃水浴中滅活30 min，最后，使用過濾器濾過血清進行除菌，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 實驗檢測方法

2.3.1 MTT法檢測人乳腺癌細胞SK-BR-3細胞生長增殖情況 將人乳腺癌SK-BR-3細胞以1乘10*5/mL接種于96孔板上，每孔100 uL置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，吸除原培養(yǎng)液，實驗組予以藥物干預，全部置于培養(yǎng)箱中48 h，用4℃生理鹽水洗2次，加0.5 mg /mL MTT溶液100 μL，避光，孵育4 h，加入150 μL DMSO，繼續(xù)避光，并搖床搖勻15 min后上機檢測，分析乳腺癌SK-BR-3細胞抑制率[7]。

2.3.2 熒光顯微鏡觀察山慈菇含藥血清作用前后對SK-BR-3凋亡情況的影響 取對數(shù)生長期人乳腺癌SK-BR-3細胞，以1乘10*5/mL密度接種于6孔板中，每孔2 mL，待細胞貼壁24 h后吸出原培養(yǎng)液，每孔加入2 mL質(zhì)量濃度不同的含藥血清作為實驗組，每組設立兩個復孔;同時以加入等量培養(yǎng)基的乳腺癌 SK-BR-3細胞作為對照組。放置于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h，吸除原培養(yǎng)液，加入預冷的磷酸鹽緩沖溶液（Phosphate Buffer Saline，PBS）洗2遍，再加入4%甲醛固定20 min，繼續(xù)以PBS洗滌2 min，待其晾干，加入0.1%TritonX-100處理3次（每次10 min），間隔PBS洗滌10 min，再將生理鹽水配成的0.05 mg /mLDAPI染液進行染色，常溫下避光20 min，吸出染料后PBS洗滌2次。最后，在熒光顯微鏡下觀察SK-BR-3細胞的細胞核的形態(tài)[8]。

2.3.3 劃痕試驗檢測乳腺癌SK-BR-3細胞遷移情況 將對數(shù)生長期的乳腺癌SK-BR-3細胞接種于每孔2 mL的6孔板中，細胞密度為5×10*4/mL，培養(yǎng)24h，用200 μL無菌槍頭依次在每個孔底劃“十”字劃痕，生理鹽水洗2遍，拍照記錄后分別加入含藥血清作為實驗組，并設立對照組，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。最后，于顯微鏡下觀察劃痕愈合度，拍照記錄分析細胞的遷移情況[9]。

3 實驗結(jié)果

3.1 MTT法檢測人乳腺癌SK-BR-3細胞生長增殖情況結(jié)果 不同濃度的山慈菇含藥血清（0%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%）處理人乳腺癌細胞SK-BR-3細胞48h，SK-BR-3細胞的生長增殖情況分別為（0.860±0.063）%、（0.747±0.064）%、（0.484±0.039）%、（0.149±0.055）%、（0.128±0.029）%、（0.111±0.008）%、（0.104±0.019）%、（0.101±0.023）%、（0.100±0.019）%（見圖1）。與對照組比較，山慈菇含藥血清濃度在10%時，對SK-BR-3細胞增殖無明顯的抑制作用（P>0.05），當濃度達到20%時，能夠明顯的抑制對SK-BR-3細胞的增殖（P<0.05），隨著濃度的增加，對SK-BR-3細胞的增殖作用約強。

3.2 熒光顯微鏡觀察山慈菇含藥血清作用前后SK-BR-3凋亡情況結(jié)果 由熒光結(jié)果可知（圖2），對照組圖片表現(xiàn)為均勻的淡藍色熒光反應，實驗組熒光圖片為山慈菇含藥血清誘導后的SK-BR-3細胞，呈現(xiàn)出典型的細胞凋亡特征，如核碎裂、核染色質(zhì)濃縮聚集以及藍白色熒光等。因此實驗組SK-BR-3凋亡情況較對照組明顯，所以山慈菇含藥血清能夠明顯誘導SK-BR-3細胞凋亡。

3.3 劃痕試驗檢測乳腺癌SK-BR-3細胞遷移情況結(jié)果 劃痕試驗檢測乳腺癌SK-BR-3細胞遷移情況結(jié)果顯示：對照組SK-BR-3細胞24h后向劃痕中間聚集，而山慈菇含藥血清圖片中有明顯更少的SK-BR-3細胞向中央聚集。由此可知，山慈菇含藥血清能夠明顯的抑制乳腺癌SK-BR-3細胞的遷徙能力。

4 討論

乳腺癌是一種風險極高的癌癥，可能通過轉(zhuǎn)移和復發(fā)危及患者的生命安全，并且發(fā)病率呈逐年上升趨勢，所以乳腺癌的發(fā)病機制越來越受到醫(yī)學界的關注。

乳腺癌屬于中醫(yī)學中“乳巖”范疇，多為本虛標實之證，陽氣不足，沖任失調(diào)，抑制痰飲、瘀血等實邪，互結(jié)于乳絡，治當以活血化痰散結(jié)之法[9]?，F(xiàn)代醫(yī)學認為乳腺細胞的異常增殖和凋亡可能是導致乳腺癌發(fā)病的重要機制之一，如何調(diào)控乳腺細胞的異常增殖和凋亡是解決乳腺癌的關鍵。細胞凋亡是在細胞基因的調(diào)控下，引起細胞自主凋亡的過程[10]。

目前的治療手段依舊以手術和放療、化療為主，其創(chuàng)傷性和化療藥物帶來的副作用巨大。由于患者對腫瘤的認識不足，當發(fā)現(xiàn)乳腺癌時，往往為疾病的晚期，通常會錯過本病的最佳治療時間，在臨床治療中常加大化療藥物的劑量，從而達到抑制腫瘤細胞增殖的目的，但由于藥物劑量的增大，毒副作用亦明顯，而且長期使用使腫瘤細胞產(chǎn)生耐藥性，后期治療效果不佳。因此患者希望尋求一種溫和的治療方式，提高生命質(zhì)量，探索新的治療藥物也能成為醫(yī)學界的最關注的熱點。山慈菇化痰散結(jié)，常用于乳巖的治療，而現(xiàn)代藥理亦表明山慈菇具有抗腫瘤、抗血管活性等作用，特別是在抗腫瘤中的作用受到重視，認為山慈菇能夠通過抑制乳腺腫瘤細胞的增殖、誘導其凋亡、延緩其遷移能力，從而達到治療乳腺癌的作用[11]。

相關細胞實驗表明，藥物抗腫瘤的作用機制主要為抑制腫瘤細胞增殖、誘導腫瘤細胞凋亡以及逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞行為等方面[12]。本實驗結(jié)果顯示，山慈菇含藥血清干預乳腺癌細胞后，能夠明顯抑制乳腺癌SK-BR-3細胞的活性，抑制腫瘤細胞的生長，并且在藥物濃度為20%時作用顯著，隨著濃度的增加，其抑制作用越強，表現(xiàn)為濃度依賴性。在熒光實驗中實驗組中SK-BR-3細胞經(jīng)山慈菇含藥血清誘導，出現(xiàn)明顯的細胞凋亡;在劃痕實驗中，實驗組腫瘤細胞和對照組比較，向中央遷移明顯較少，表明山慈菇含藥血清能夠明顯延緩腫瘤細胞的遷徙，從而逆轉(zhuǎn)其行為。綜上所述，山慈菇含藥血清可能通過抑制腫瘤SK-BR-3細胞的增殖、誘導SK-BR-3細胞的凋亡以及延緩SK-BR-3的遷移，從而達到治療乳腺癌的目的，但是其具體的分子機制仍未明確，需要進一步的實驗證明。

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