基于全基因組RNA測序探索糖尿病周圍神經(jīng)病變的發(fā)病機(jī)制

劉旖

【摘要】目的 通過對GEO數(shù)據(jù)庫的糖尿病周圍神經(jīng)病變（DPN）、糖尿病（DM）和正常人的血液全基因組RNA 數(shù)據(jù)集富集分析，探討DPN的發(fā)病機(jī)制。方法 對GSE95849芯片的數(shù)據(jù)進(jìn)行GSEA分析。結(jié)果 與正常組相比，DPN中有12637個基因高表達(dá)，9200個基因在DM中高表達(dá)，DPN相比起DM有13630（67.6% ）個基因表達(dá)上調(diào);有32個基因集參與了DPN的發(fā)生，4個基因集涉及DM的發(fā)病。結(jié)論 NF-kB信號通路、轉(zhuǎn)化生長因子-β信號、未折疊蛋白反應(yīng)、P53、缺氧因子可能與DPN的發(fā)病有關(guān)，而β細(xì)胞、KRAS蛋白信號可能涉及DM的發(fā)生。

【關(guān)鍵詞】DPN;GEO;GSEA

糖尿?。―M）已成為全球第七大死因。DM會導(dǎo)致100多種并發(fā)癥。臨床發(fā)現(xiàn)[1]，30%～40%的DM患者至少會發(fā)生一種并發(fā)癥。DM并發(fā)癥包括心血管病變，神經(jīng)病變，視網(wǎng)膜病和腎病等。其中，神經(jīng)病變可累及中樞神經(jīng)及周圍神經(jīng)，后者尤為常見。研究顯示[2]，1型DM患者（T1DM）的神經(jīng)病變率為66%，2型DM（T2DM）為59%。糖尿病周圍神經(jīng)病變（DPN）已經(jīng)成為最嚴(yán)重的DM并發(fā)癥。

慢性高血糖是引發(fā)DPN的主要因素。實驗證明[3]T1DM患者在治療血糖后DPN發(fā)病率降低。也有研究發(fā)現(xiàn)[4]血糖控制良好的T2DM依然發(fā)展為DPN。說明高血糖是引起DPN的關(guān)鍵因素，但只從宏觀角度去控制血糖不足以改善DPN，需要更多地從基因表達(dá)的微觀途徑探討。研究DPN的功能表達(dá)譜有助于開展精準(zhǔn)治療。而全基因組表達(dá)組學(xué)分析能為DPN的分子機(jī)制提供新的見解。

本研究利用GEO數(shù)據(jù)庫里的女性DPN、DM和健康者的全基因組表達(dá)數(shù)據(jù)開展GSEA富集分析，分析基因表達(dá)差異，探討DPN的功能通路，為DPN的精準(zhǔn)治療提供一定的分子依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

在GEO數(shù)據(jù)庫中以關(guān)鍵詞“Diabetic Neuropathy”搜索發(fā)現(xiàn)GSE95849芯片數(shù)據(jù)為研究對象。該芯片包括18例研究對象（6例女性DPN，6例DM，6例健康者）的血樣全基因組的總RNA信息。 。

1.2 數(shù)據(jù)預(yù)處理

對探針信號值進(jìn)行歸一化處理，若有多個探針對應(yīng)同個基因的，對信號值求取中位數(shù)作為唯一表達(dá)值。根據(jù)Gene Symbol將探針轉(zhuǎn)換為基因名稱。

1.3 GESA富集分析

利用該18例研究對象的全血總RNA測序信息，按照DPN、DM和正常組，用Hallmark庫進(jìn)行注釋，進(jìn)行GSEA富集分析，置換類型為gene sets，置換檢驗次數(shù)為1000次，探索DPN和DM在表達(dá)水平與哪些特定生物學(xué)意義的基因集有顯著關(guān)聯(lián)。以校正后的歸一化的富集得分（NES）絕對值>1，標(biāo)化顯著性水準(zhǔn)P<0.05，校正多重假設(shè)檢驗FDR<0.25的富集結(jié)果為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 差異表達(dá)篩選

如表1，12637（62.7%）個基因在DPN患者中高表達(dá)，7512（37.3%）個基因在正常組中高表達(dá)，DPN患者與正常組的信噪比值約為1.85：1（64.9%;35.1%）。

9200（45.7%）個基因在DM患者中高表達(dá)，10949（54.3%）個基因在正常組中高表達(dá)，DM患者與正常組的信噪比分值各為35.9%和64.1%。

而與DM患者相比，有13630（67.6%）個基因在DPN中表達(dá)更高，6519（32.4%）個基因在DM患者中表達(dá)更高，DNP患者和DM患者的信噪比大小分別是77.5%和22.5%。

2.2 GSEA功能富集分析

與正常組相比，共有32個基因集參與了DPN的發(fā)生。9個基因集在FDR<0.25時顯著富集，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），3個基因集達(dá)到富集標(biāo)準(zhǔn)。差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），有8個基因集達(dá)標(biāo)。其中，參與程度排前的基因集涉及NF-kB信號通路（圖1A）、轉(zhuǎn)化生長因子-β信號通路（圖1B）、未折疊蛋白反應(yīng)、P53通路、缺氧因子、細(xì)胞頂端連接和UV誘導(dǎo)反應(yīng)上調(diào)分子功能。

DM患者有4個基因集富集。在FDR<0.25和P<0.05時分別有1個基因集顯著富集?；蚋患@著的分子機(jī)制與β細(xì)胞、KRAS蛋白信號等功能有關(guān)。

3討 論

超過50%的DM患者都可能發(fā)展為DPN，DPN患者下肢疼痛麻木甚至感覺喪失，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量。研究DPN的分子機(jī)制，有助于靶點治療。而生物信息學(xué)分析，可幫助研究者在大量遺傳表達(dá)信息中更精準(zhǔn)地定位有意義的研究方向。

本研究通過GSEA富集分析發(fā)現(xiàn)DPN和DM的分子通路都與免疫功能相關(guān)。由于神經(jīng)組織的高度氧化應(yīng)激敏感，線粒體在高糖環(huán)境中產(chǎn)生大量活性氧， 激活NF-kB，誘發(fā)炎癥反應(yīng)或細(xì)胞凋亡，最后導(dǎo)致神經(jīng)損傷。劉紅梅[5-6]發(fā)現(xiàn)，血糖波動的DM大鼠的DPN病情比持續(xù)高糖的DM大鼠更嚴(yán)重，NF-kB表達(dá)量也是該組大鼠最高，這與氧化應(yīng)激水平升高會導(dǎo)致神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)病變及傳導(dǎo)功能受損一致的觀點一致，說明血糖波動可能增加NF-kB。研究發(fā)現(xiàn)[7-8]治療DPN的關(guān)鍵是通過抑制NF-Kb通路。高血糖引起的線粒體功能障礙和ROS的產(chǎn)生也是DPN的可能病因。研究發(fā)現(xiàn)[9]缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF1α）信號傳導(dǎo)受損會導(dǎo)致DM小鼠早期感覺喪失。說明HIF1α是周圍感覺神經(jīng)元中ROS的上游調(diào)節(jié)劑，并通過限制ROS水平和誘導(dǎo)VEGF的表達(dá)來抑制高血糖引起的神經(jīng)損傷。但是，這些功能分子與DPN的關(guān)系都只是在動物模型上論證，人群患者的推廣性受到限制。作為補充，本研究的結(jié)果從人群DPN的角度揭示了NF-Kb信號通路在其中參與的可能性。

研究[10]提出：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能導(dǎo)致DPN，而未折疊的蛋白反應(yīng)能降低DPN的發(fā)生。有研究[11]建議TGF-β1作為DPN的標(biāo)志物。這與本研究的結(jié)果未折疊的蛋白反應(yīng)和生長因子可能與DPN相關(guān)的觀點一致。

此外，本研究還暗示了P53、細(xì)胞頂端連接和UV誘導(dǎo)反應(yīng)與DPN有關(guān)的可能性，這些可能涉及的分子機(jī)制不同于DM的分子機(jī)制，有助于未來發(fā)掘更多的DPN獨立于DM的機(jī)制成因。

綜上，本研究利用生信分析，探討了DPN的成因，從側(cè)面補充了動物實驗的論點，為DPN的研究提供一些參考，但這些機(jī)制還需要進(jìn)一步的分子實驗進(jìn)行證明。

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