無細(xì)菌松材線蟲對(duì)馬尾松的致病性*

朱麗華 章欣月 夏馨蕊 萬 羽 代善俊 葉建仁

(南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心 江蘇省有害生物入侵預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院 南京 210037)

松材線蟲(Bursaphelenchusxylophilus)病又稱松樹萎蔫病,是松屬(Pinus)樹種的一種毀滅性病害，不僅在世界范圍內(nèi)造成高達(dá)數(shù)千萬美元的損失(Tóth, 2011)，而且導(dǎo)致嚴(yán)重的生態(tài)破壞。1905年，日本首次報(bào)道大面積松樹萎蔫枯死，隨后病害迅速擴(kuò)展蔓延，幾乎席卷日本全境。20世紀(jì)80年代，該病害相繼傳入中國(guó)(程瑚瑞等，1983)和韓國(guó)(Choietal., 1989; Moonetal., 1995)。隨后，松材線蟲病傳入葡萄牙(Motaetal.， 1999)和西班牙(Abelleiraetal.， 2011)，成為一種世界性松樹病害。我國(guó)于1982年首次發(fā)現(xiàn)松材線蟲病，30多年來，該病害迅速擴(kuò)散到南方多個(gè)省(區(qū))，并逐步向北方省份蔓延。截止2018年，我國(guó)松材線蟲病疫區(qū)涉及18個(gè)省(區(qū)、市)的588個(gè)縣級(jí)行政區(qū)(葉建仁， 2019)，與2018年相比，2019年新增松材線蟲病疫區(qū)283個(gè)，病害防控形勢(shì)異常嚴(yán)峻。在我國(guó)，該病害主要為害馬尾松(Pinusmassoniana)、黑松(P.thunbergii)、赤松(P.densiflora)等松屬樹種， 2018年，首次發(fā)現(xiàn)我國(guó)東北地區(qū)廣泛種植的落葉松(Larix)感染該病害(于海英等， 2019)。

松材線蟲病的發(fā)生發(fā)展涉及多個(gè)生物因子(Rorizetal.， 2011)，其病原目前尚存在一定爭(zhēng)議，致病機(jī)制迄今尚不明確(Proen?aetal., 2010)，這給防控工作帶來了極大困難(楊寶君， 2002)。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為松材線蟲是該病害的唯一病原(Nickleetal.， 1981； 楊寶君， 2002； 葉建仁等， 2012)，而有些學(xué)者認(rèn)為，松材線蟲病由松材線蟲攜帶的產(chǎn)毒細(xì)菌引起(Okuetal.， 1980； Kawazuetal.， 1997； 郭道森等， 2000； Hanetal., 2003)。有研究表明，無菌松材線蟲并未失去對(duì)松苗的致病性(Zhuetal., 2012； Zhaoetal.， 2013； 林麗等， 2017)； 而有些研究顯示，松樹萎蔫與松材線蟲攜帶細(xì)菌有關(guān)，無菌松材線蟲喪失了致病性(Kawazuetal.， 1997； Kawazuetal.， 1999; Hanetal., 2003)，有研究者提出松材線蟲病是松材線蟲及其伴生細(xì)菌復(fù)合侵染引起(郭道森等， 2000； 趙博光， 2004)。由于病原問題不十分明確，防控措施中既有針對(duì)松材線蟲的樹干注射(葉建仁，2019)，亦有針對(duì)松材線蟲攜帶細(xì)菌的抗生素法(Kwonetal.， 2010)和細(xì)菌演替法(姚伍等，2018)。本研究以馬尾松5年生盆栽苗為試驗(yàn)材料，探討了無菌松材線蟲的致病性，旨在進(jìn)一步探明松材線蟲病的病原，為疫情控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試蟲株為強(qiáng)致病力松材線蟲蟲株AMA3的近交系后代AMA3c1(本文稱帶菌松材線蟲)，使用前培養(yǎng)于灰葡萄孢(Botrytiscinerea)上。無細(xì)菌松材線蟲(本文稱無菌松材線蟲，代號(hào)BFAMA3c1)的制備及無菌檢驗(yàn)參照朱麗華等(2011)的方法，經(jīng)檢驗(yàn)無任何細(xì)菌生長(zhǎng)，用于接種試驗(yàn)。

5年生馬尾松盆栽苗培養(yǎng)于南京林業(yè)大學(xué)，備用。

1.2 無菌松材線蟲對(duì)溫室馬尾松盆栽苗的致病性測(cè)定

松材線蟲致病性測(cè)定采用人工皮接法(張治宇等， 2002)。首先，用70%酒精棉球擦拭當(dāng)年生枝條基部待接種部位，再用無菌手術(shù)刀斜切一個(gè)約1 cm長(zhǎng)的傷口，傷口深達(dá)木質(zhì)部。立即于傷口處塞入1無菌棉球，用無菌槍頭將0.4 mL帶菌松材線蟲和無菌松材線蟲懸液(8 000條)分別接種于傷口處無菌棉球上，用封口膜輕輕包裹固定，達(dá)到保濕效果，以等體積無菌水為對(duì)照，每處理各接種20株馬尾松。接種后，于28 ℃溫室條件下培養(yǎng)。

1.2.1 萎蔫狀況觀察 每2天觀察1次，記錄松苗發(fā)病和萎蔫的情況，統(tǒng)計(jì)松苗萎蔫率，即萎蔫率=萎蔫植株數(shù)/接種植株數(shù)×100%。

1.2.2 松脂分泌狀況觀察 在接種5、10、30天后對(duì)植株分別取樣，每組取3株作為重復(fù)。選取接種點(diǎn)下2 cm處莖段，去除針葉，切出平整截面，觀察松脂分泌情況。

1.2.3 組織病理學(xué)結(jié)構(gòu)觀察 取接種20天后接種點(diǎn)上方2 cm處莖段，按照周乃富等(2018)的方法制作石蠟切片，每組取樣3次作為重復(fù)。取下的莖段立即放入FAA固定液，浸泡24 h以上，軟化劑浸泡7天以上，乙醇和二甲苯脫水處理，浸蠟，包埋，切片，番紅固綠染色，封片。光學(xué)顯微鏡下觀察莖段橫截面的組織結(jié)構(gòu)。

1.2.4 線蟲種群增長(zhǎng)情況 在接種后30天，對(duì)植株分別取樣，進(jìn)行線蟲的再分離，每組取3個(gè)重復(fù)。取接種部位上下10 cm莖段(共20 cm)，去除針葉，修剪成5～6 mm的小段，采用貝爾曼漏斗法再分離線蟲，靜置24 h后收集線蟲懸液，離心去上清液后保留約1 mL，統(tǒng)計(jì)線蟲數(shù)量。將試樣置于85 ℃熱烘3天至恒質(zhì)量稱量。計(jì)算每克木樣中線蟲數(shù)量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用GraphPadPrism6.01軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 無菌松材線蟲和帶菌松材線蟲接種馬尾松外觀癥狀變化

無菌松材線蟲及帶菌松材線蟲接種均可導(dǎo)致馬尾松萎蔫，且外觀癥狀與野外發(fā)病癥狀一致(圖1A、B)。無菌松材線蟲和帶菌松材線蟲接種的馬尾松均于接種5天后出現(xiàn)發(fā)病癥狀，發(fā)病率分別于第8天和第12天達(dá)到50%。2組松材線蟲接種發(fā)病癥狀均表現(xiàn)為接種5天后針葉失去光澤，輕微褪綠； 10天后，針葉明顯黃化，部分針葉下垂； 20天后，針葉全部下垂； 30天后針葉轉(zhuǎn)為紅褐色，整株枯萎(圖1A)。接種35天后，無菌松材線蟲及帶菌松材線蟲致萎蔫率均達(dá)到90%，對(duì)照組馬尾松始終保持健康(圖1B)。

圖1 5年生馬尾松盆栽苗接種無菌松材線蟲和帶菌松材線蟲后的外觀癥狀Fig.1 Symptoms of 5-year-old potted Pinus massoniana after inoculation with aseptic and non-aseptic pine wood nematodesA. 接種5、10、20和30天后馬尾松外觀癥狀變化 Symptoms of P. massoniana at 5 d, 10 d, 20 d and 30 d after inoculation, respectively； B. 接種35天后馬尾松外觀癥狀Symptoms of P. massoniana 35 days after inoculation.比例尺Scale bar=10 cm

2.2 無菌松材線蟲和帶菌松材線蟲接種馬尾松松脂分泌情況

無菌松材線蟲及帶菌松材線蟲接種均導(dǎo)致馬尾松樹脂分泌失常。接種帶菌線蟲的馬尾松在接種5天后尚分泌少量松脂，10天后幾乎停止分泌松脂，30天后開始出現(xiàn)空洞。無菌松材線蟲接種的馬尾松，5天后幾乎停止分泌松脂，10天后莖段出現(xiàn)少量空洞，30天時(shí)出現(xiàn)大片空洞。對(duì)照組馬尾松正常分泌樹脂，莖段橫切面完整平滑(圖2)。

2.3 無菌松材線蟲和帶菌松材線蟲接種馬尾松組織病理學(xué)結(jié)構(gòu)

石蠟切片結(jié)果顯示，對(duì)照馬尾松皮層薄壁細(xì)胞輪廓近橢圓形，細(xì)胞壁完整，被染成綠色，內(nèi)有明顯細(xì)胞質(zhì)； 樹脂道橢圓形，圍繞樹脂道的上皮細(xì)胞形態(tài)規(guī)整(圖3A)。木質(zhì)部細(xì)胞細(xì)胞壁完整，排列緊密，被染成紫紅色； 樹脂道周圍的上皮細(xì)胞細(xì)胞壁完整(圖3B)。髓心細(xì)胞清晰完整，界限明顯； 細(xì)胞質(zhì)淡薄，被染成綠色(圖3C)。

接種帶菌松材線蟲的馬尾松皮層細(xì)胞在線蟲影響下多變形或殘缺，細(xì)胞壁破裂不連續(xù)，細(xì)胞質(zhì)極少； 樹脂道變形，圍繞樹脂道的上皮細(xì)胞破損(圖3D)。木質(zhì)部細(xì)胞細(xì)胞壁多完整，排列緊密，有少數(shù)微小空隙； 薄壁細(xì)胞、射線細(xì)胞被破壞，樹脂道周圍上皮細(xì)胞細(xì)胞壁破碎或成不規(guī)則形狀(圖3E)。髓心細(xì)胞輪廓較完整，細(xì)胞質(zhì)濃厚并皺縮變形，被染成深紅色，部分細(xì)胞核變形或破裂(圖3F)。

接種無菌松材線蟲的馬尾松皮層細(xì)胞呈扁的不規(guī)則形狀，細(xì)胞壁被線蟲破壞而變得零碎，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)大多消失，樹脂道周圍上皮細(xì)胞破損(圖3G)。木質(zhì)部細(xì)胞大多完整，部分細(xì)胞之間形成空洞，部分樹脂道被破壞，周圍上皮細(xì)胞變形或破裂(圖3H)。髓心大面積空洞，與木質(zhì)部連接處樹脂道及其周圍細(xì)胞破壞嚴(yán)重，髓心細(xì)胞少數(shù)變形或破裂(圖3I)。

圖2 無菌松材線蟲和帶菌松材線蟲接種后馬尾松的松脂分泌情況Fig.2 Secretion of resin of P. massoniana after inoculation with aseptic and non-aseptic pine wood nematodes箭頭所示為松脂，三角形所示為空隙The arrows point at pine resins and the triangles point at cavities.

圖3 無菌松材線蟲和帶菌松材線蟲接種20天后馬尾松莖段橫切面顯微結(jié)構(gòu)Fig.3 Anatomical of stem cross sections of P. massoniana after inoculated with aseptic and non-aseptic pine wood nematodes for 20 daysRc: 樹脂道Resin canal； R: 射線Ray； P: 髓心Pith.

2.4 無菌松材線蟲和帶菌松材線蟲接種馬尾松體內(nèi)線蟲種群數(shù)量

接種后第30天，線蟲再分離結(jié)果顯示，無菌松材線蟲和帶菌松材線蟲接種致萎蔫馬尾松苗中均能再分離得到大量松材線蟲，無菌松材線蟲接種致萎蔫植株中再分離線蟲數(shù)量高于帶菌松材線蟲接種致萎蔫植株，其再分離線蟲數(shù)量分別為(8 167±5 840)條·g-1和(4 475±2 138)條·g-1，但二者差異不顯著(P=0.361 9)。

3 討論

探明松材線蟲病真正的病原，是該病害致病機(jī)制研究和防治的基本問題。諸多研究者對(duì)該病害的病原進(jìn)行了研究，但松材線蟲及其伴生細(xì)菌在松樹萎蔫中的作用依然未能達(dá)成共識(shí)。

本研究中，無菌松材線蟲和帶菌松材線蟲接種均可引起馬尾松苗發(fā)病，發(fā)病植株外觀癥狀與野外自然發(fā)病癥狀相似； 2組線蟲處理均導(dǎo)致馬尾松松脂分泌異常，最終停止分泌； 2組線蟲對(duì)馬尾松的致病力相似，致松苗萎蔫率均達(dá)到90%； 從無菌松材線蟲和帶菌松材線蟲處理致萎蔫的植株體內(nèi)均能再分離得到松材線蟲，接種無菌線蟲植株中再分離到的線蟲數(shù)量稍高于帶菌線蟲接種植株，但二者差異不顯著，證明松材線蟲能單獨(dú)引起松樹萎蔫，該結(jié)果與Tamura(1977，1983)、Zhu等(2012)、Zhao等(2013)、Faria 等(2015)、林麗等(2017)、Rodrigues 等(2017)等的結(jié)果一致，而與Kawazu等(1997； 1999)、洪英娣等(2002)、Han 等(2003)以及王華光等(2018)等的結(jié)果相反。Tamura(1977)發(fā)現(xiàn)無菌松材線蟲及帶菌松材線蟲接種均可使3年生赤松苗萎蔫，且二者致松苗枯死率無差別； 并且，在石蠟油中保存1年后，無菌松材線蟲依然保持其致病性。Tamura(1983)進(jìn)一步證實(shí)無菌松材線蟲接種不僅能使無菌黑松苗萎蔫，同樣能使溫室盆栽的3年生赤松苗萎蔫。多位研究者采用無菌松材線蟲在完全無菌條件下對(duì)馬尾松(Zhuetal. 2012)、赤松(Zhuetal.， 2012，林麗等， 2017)和海岸松(Pinuspinaster)(Fariaetal.， 2015)組培苗或松樹愈傷組織(林麗等， 2017)進(jìn)行接種，發(fā)現(xiàn)能導(dǎo)致松苗萎蔫、愈傷組織嚴(yán)重水漬化并失去活性。Zhao等(2013)證實(shí)無菌松材線蟲能使7～8年生黑松萎蔫。Rodrigues 等(2017)亦發(fā)現(xiàn)無菌松材線蟲及帶菌松材線蟲接種的2年生地中海松(P.halepensis)，其萎蔫癥狀及化學(xué)成分變化均無差別。然而，Kawazu等(1997； 1999)的結(jié)果表明，無菌化處理使松材線蟲OKD-3蟲株失去了對(duì)赤松無菌苗的致病性； 洪英娣等(2002)和Han等(2003)亦報(bào)道無菌松材線蟲單獨(dú)接種不能使黑松無菌苗萎蔫； 王華光等(2018)發(fā)現(xiàn)無菌松材線蟲對(duì)3年生黑松沒有致病性。這其間的差異可能與試驗(yàn)所用的蟲株有關(guān)，也可能與致病性測(cè)定所用接種方法及觀察時(shí)間有關(guān)。例如，Kawazu 等(1997； 1999)對(duì)1月齡赤松無菌苗進(jìn)行接種時(shí)，將無菌苗長(zhǎng)15 mm的針葉剪去13 mm，然后用淀粉糊將棉球固定在剩余葉子的頂部，再在棉球上接種線蟲懸浮液； 洪英娣等(2002)對(duì)試管中2月齡黑松無菌苗進(jìn)行接種時(shí)，用針于無菌苗莖干中上部輕輕刺一傷口，附上少許滅菌脫脂棉后接種線蟲液于脫脂棉上，接種4天后統(tǒng)計(jì)萎蔫率，5天后拔出松苗進(jìn)行線蟲再分離。雖然Kawazu 等(1997)無菌條件下的接種結(jié)果顯示無菌OKD-3失去致病性，但其開放條件下的接種結(jié)果卻表明無菌OKD-3依然能導(dǎo)致非無菌赤松苗的枯萎，該結(jié)果與Tamura(1977； 1983)的結(jié)果一致。對(duì)此，Kawazu等(1997)認(rèn)為，由于在開放條件下接種，無菌松材線蟲重新感染了具有致病性的細(xì)菌，因此使其重新獲得了致病性。因此，為了更準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)無菌松材線蟲的致病性，今后的試驗(yàn)中，應(yīng)采用更多蟲株、更統(tǒng)一的方法(如苗齡、接種方法、接種量、觀察時(shí)間)在完全無菌的條件下進(jìn)行接種。

石蠟切片結(jié)果顯示，無菌松材線蟲和帶菌松材線蟲接種均導(dǎo)致馬尾松組織結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化。皮層、木質(zhì)部、髓心大量細(xì)胞細(xì)胞壁破裂、細(xì)胞變形，樹脂道上皮細(xì)胞破壞嚴(yán)重，該組織病理學(xué)變化與Manabu(1987)、金鋼等(2007)、賁愛玲等(2012)采用帶菌松材線蟲接種后所觀察到的現(xiàn)象一致，而與李良(2006)、王華光等(2018)等的結(jié)果不同。李良(2006)發(fā)現(xiàn)無菌松材線蟲處理植株其組織結(jié)構(gòu)與健康植株一致，而伴生細(xì)菌或無菌松材線蟲與伴生細(xì)菌混合接種的黑松，其組織病理學(xué)變化與野生松材線蟲致死黑松一致。王華光等(2018)亦報(bào)道，無菌松材線蟲接種黑松的莖段組織超微結(jié)構(gòu)與健康松樹無區(qū)別，而野生松材線蟲、無菌松材線蟲與細(xì)菌GcM5-1 A或GcM5-1 A鞭毛毒蛋白混合接種可導(dǎo)致黑松組織嚴(yán)重破壞。

4 結(jié)論

無菌化處理并未使松材線蟲失去對(duì)馬尾松的致病性，無菌松材線蟲與帶菌松材線蟲一樣導(dǎo)致馬尾松苗松脂分泌失常，對(duì)莖段組織結(jié)構(gòu)造成嚴(yán)重破壞，最終引起松苗萎蔫枯死。因此，松材線蟲是引起松樹萎蔫病發(fā)生的真正原因，其對(duì)松樹的致病性與其伴生細(xì)菌無關(guān)。