長柄雙花木種群遺傳結(jié)構(gòu)及種群歷史*

孟藝宏 徐剛標(biāo) 盧孟柱,2 姜小龍,3 郭飛龍

(1. 中南林業(yè)科技大學(xué)林木遺傳育種實驗室 長沙 410004； 2. 浙江農(nóng)林大學(xué) 杭州311300； 3. 中國科學(xué)院上海辰山植物園 上海 201602)

遺傳多樣性是生物長期進化的產(chǎn)物。探討生物種群進化歷史，是理解歷史環(huán)境因子和人為因素對現(xiàn)實種群地理分布格局、豐富度及進化潛力影響的理論基礎(chǔ)(Cabreraetal., 2017)。我國亞熱帶山區(qū)多數(shù)原始森林植被是由暖溫帶落葉闊葉林和常綠闊葉林組成，是北半球溫帶植物區(qū)系中物種多樣性和特有性程度最高的地區(qū)，分布18 000余種種子植物，其中50%～60%為特有種(Wangetal., 2015)，為中國-日本植物區(qū)系的核心部分，被認為是古老的植物演化譜系在第四紀(jì)冰期的重要避難所，成為全球生物多樣性熱點地區(qū)之一(葉俊偉等， 2017)。基于化石孢粉數(shù)據(jù)重建的植被分布模式(Yuetal., 2000; Nietal., 2010)表明，我國亞熱帶植物在末次冰盛期明顯向南退縮，冰期后從避難所內(nèi)原地(insitu)周邊經(jīng)歷局部擴張，在冰期/間冰期的氣候波動過程中，大多數(shù)植物可能選擇在多地避難所幸存下來。隨著分子種群遺傳學(xué)理論和技術(shù)的發(fā)展，利用現(xiàn)實種群的遺傳信息推測種群進化歷史、多樣性起源、分布和維持的潛在機制成為可能(Beaumontetal., 2004)。

長柄雙花木(Disanthuscercidifoliusvar.longipes)(2n=16) 系金縷梅科(Hamamelidaceae)雙花木屬(Disanthus)植物(潘開玉等，1994)，為我國特有的第三紀(jì)孑遺植物，殘存于南嶺山脈、羅霄山脈及武夷山脈海拔1 300 m以下的常綠闊葉林和針闊葉混交林或矮林中。該物種對生境條件要求苛刻，適宜在溫暖濕潤氣候和酸性土壤上生長，分布區(qū)狹窄，種群數(shù)量少，已被列為我國Ⅱ級保護植物和珍稀瀕危植物(高浦新等， 2013； 孟藝宏等， 2019)。長柄雙花木為多年生的落葉灌木或小喬木，樹高2～3 m(溪谷兩側(cè)的植株可達7 m)，叢生。頭狀花序上對生2朵無梗的兩性花，花序柄細長。自交親和，以昆蟲和風(fēng)傳播花粉，“花多果少”，種子主要依靠風(fēng)力傳播(肖宜安等， 2004)。心型葉，互生，葉色由初春綠色變?yōu)樯钋镒霞t色，花、果紅色，觀賞價值高，極具有園林綠化市場的開發(fā)利用潛力(廖飛勇， 2010)。作為雙花木屬中國-日本植物區(qū)系的替代種，該物種在研究金縷梅科系統(tǒng)發(fā)育和東亞植物區(qū)系地理演化等方面具有重要的科學(xué)價值(高浦新等， 2013)，是探討第四紀(jì)冰期以來我國亞熱帶地區(qū)植物分布格局及種群遺傳結(jié)構(gòu)時空變化機制的模式植物之一。

有關(guān)長柄雙花木種群遺傳學(xué)研究較少?，F(xiàn)有的研究報道，由于樣本采集于不同的局部區(qū)域以及采用不同的標(biāo)記系統(tǒng)，存在著差異性結(jié)論。肖宜安等(2003)基于同工酶標(biāo)記開展羅霄山脈井岡山地區(qū)5個種群遺傳多樣性研究，發(fā)現(xiàn)種群遺傳多樣性較高，種群遺傳分化較?。?謝國文等(2014)采用ISSR標(biāo)記分析南嶺山脈5個種群遺傳多樣性的結(jié)果顯示，種群遺傳多樣性偏低，種群間遺傳差異不大； Yu等(2014)采用AFLP標(biāo)記分析8個種群遺傳多樣性的結(jié)果表明，種群維持較豐富的遺傳多樣性，種群遺傳分化明顯。鑒于此，本研究基于熒光SSR標(biāo)記技術(shù)，采集長柄雙花木全分布區(qū)12個代表性自然種群，分析其種群遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)，探討現(xiàn)實種群遺傳結(jié)構(gòu)的歷史成因，旨在為該物種遺傳資源保護與開發(fā)利用策略的制定提供理論基礎(chǔ)，也為理解我國亞熱帶地區(qū)植物多樣性的起源和維持機制提供新證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2017—2018年，參考文獻(高浦新等， 2013)和各地植被本底調(diào)查資料，選擇12個長柄雙花木自然種群(表1)，采集嫩葉開展遺傳多樣性研究。為避免采樣個體親緣關(guān)系近，盡可能選取同齡級植株(株高3 m左右)，樣株間距20 m以上(徐剛標(biāo)， 2016)，共采集261個植株的葉片樣本。采集的嫩葉立即放入裝有硅膠的自封袋中，GPS定位采樣點的經(jīng)緯度和海拔，記錄種群大小及采集的樣本數(shù)。葉片樣本帶回實驗室，倒出硅膠后密封，放入-4 ℃冰柜中保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 長柄雙花木采樣信息、樣本量及種群遺傳多樣性參數(shù)①Tab.1 Sampling information, sample size and population genetic diversity of D. cercidifolius var. longipes

根據(jù)Gao等(2009)和孟藝宏等(2018)開發(fā)的長柄雙花木特異SSR引物序列信息，篩選出15對能獲得多態(tài)性擴增產(chǎn)物的SSR 引物(表2)。引物由上海Sangon公司合成。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取、TP-M13-SSR擴增及基因分型 采用孟藝宏等(2018)改良的CTAB法提取葉片DNA，TP-M13-SSR擴增技術(shù)進行熒光PCR擴增，毛細管自動熒光電泳系統(tǒng)ABI 3730XL對擴增產(chǎn)物進行檢測。TP-M13-SSR擴增反應(yīng)體系與程序，同孟藝宏等(2018)。

采用Gene Marker V4.0(http:∥www.lifetechnologies.com/cn/zh/home/technical-resources/software-down loads.html)，判讀PCR擴增片段的長度大小。1個峰，視為純合子； 2個峰，視為雜合子。

1.2.2 遺傳參數(shù)估算 采用FSTAT2.9.3(http:∥www.bio-soft.net/tree/FSTAT.html)，統(tǒng)計估算種群及位點上的等位基因數(shù)(NA)、有效等位基因數(shù)(NE)、觀測雜合度(HO)、期望雜合度(HE)，以及種群私有等位基因豐富度(pAR)和種群內(nèi)近交系數(shù)(FIS)(Weiretal., 1984)，并對各位點和種群進行Hardy-Weinberg平衡檢測。

1.2.3 遺傳結(jié)構(gòu)分析 采用FSTAT2.9.3，估算成對種群間遺傳分化系數(shù)(FST)(Weiretal., 1984)。

采用STRUCTURE 2.3(http:∥pritch.bsd. ushicago.edu/structure.html)，對所有參試個體進行Bayesian聚類分析。基于種群間等位基因頻率相互獨立(independent allele frequencies)的假設(shè)，采用獨立等位基因頻率混合模型(admixture model)，設(shè)定類群數(shù)(K)為1～12(參試種群數(shù))，Length of Burn-in Period和MCMC均為10 000，每個K值運行12次。根據(jù)獨立運行每個K值所獲得的后驗概率lnP(D)，計算ΔK值。ΔK最大值對應(yīng)的K值視為最合理的類群數(shù)(Evannoetal., 2005)。用STRUCTURE 2.3分析參試個體歸屬各類群的比率(Q>0.6)，確定個體歸屬的類群。

采用ARLEQUIN 3.2(https:∥www.softpedia.com/get/Science-CAD/Arlequin.shtml) 中分子方差分析(AMOVA) 選項，估算種群間、種群內(nèi)遺傳方差分量，10 000次置換，評價統(tǒng)計顯著性。

1.2.4 種群歷史事件推測 采用Bottleneck1.2.02(http:∥www.montpellier.inra.fr/URLB/bottleneck/bottleneck. html)軟件中Wilcoxon單側(cè)檢驗法選項，選擇雙相突變模型(two-phased mutation model, TPM)，基于種群雜合度過剩概率，檢測每個種群是否經(jīng)歷遺傳瓶頸事件。10 000次置換，評價統(tǒng)計顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 長柄雙花木種群遺傳多樣性

15對SSR引物對12個種群261株個體進行TP-M13-SSR擴增，共檢測到129個等位基因。各位點上的等位基因數(shù)(NA)為4(DC111)～15(DC115)，平均值為8.6； 有效等位基因數(shù)(NE)介于2.00～6.79之間，平均值為3.5。各位點觀測雜合度(HO)和期望雜合度(HE)變動幅度分別為0.11～0.63和0.50～0.85，平均值分別為0.37和0.67(表2)。這表明，各SSR引物檢測出的位點多態(tài)性較高，長柄雙花木種內(nèi)遺傳變異較豐富。Hardy-Weinberg平衡檢驗的結(jié)果顯示，所有位點都極顯著偏離Hardy-Weinberg平衡(P<0.001)。

種群遺傳參數(shù)的統(tǒng)計分析結(jié)果(表1)表明，種群中的等位基因數(shù)(NA)變異幅度為2.7～4.1，平均值為3.4； 有效等位基因數(shù)(NE)為1.74～2.50，平均值為2.1。種群觀測雜合度(HO)均小于期望雜合度(HE)，平均值分別為0.35和0.43。各種群中均有私有等位基因，平均值為0.15，但私有等位基因豐富度(pAR)差異較大(0.06～0.25)。這表明種群遺傳多樣性較豐富。所有參試種群中，井岡山種群(JGS)的各項遺傳參數(shù)最大，遺傳多樣性最高，其次為玉山種群(YS)； 湖南莽山種群(MS)除觀察雜合度(HO)外，其他各項遺傳參數(shù)最小，遺傳多樣性最低。平均種群內(nèi)近交系數(shù)(FIS)為0.19，除湖南道縣種群(DX)內(nèi)近交系數(shù)為負值(-0.02)，并未顯著偏離Hardy-Weinberg平衡以外，其他種群內(nèi)近交系數(shù)均為正值(0.10～0.40)，呈現(xiàn)出極顯著的不平衡狀況(P<0.001)。

2.2 長柄雙花木種群遺傳結(jié)構(gòu)

FSTAT2.9.3估算的成對種群間遺傳分化系數(shù)(FST)見表3。FST為0.169(YS與KH)～0.514(LQ與MS)，平均值為0.354。這表明，在整體上，種群間遺傳分化程度較高。

表3 長柄雙花木成對種群FST的估算值Tab.3 The estimates of pairwise FST for D. cercidifolius var. longipes

基于Bayesian聚類的STRUCTURE 2.2軟件分析的結(jié)果顯示，當(dāng)K=2時，對應(yīng)的△K值最大，表明長柄雙花木12個種群261株個體的最合理聚類組數(shù)為2。K=2情況下，根據(jù)每株個體歸屬于各類群的比值(Q)，繪制參試的植株個體歸屬2個類群的比例圖(圖1)。由圖1可知，龍泉(LQ)、開化(KH)、玉山(YS)和井岡山(JGS)種群聚為類群Ⅰ(紅色)，道縣(DX)、莽山(MS)、宜章(YZ)、連州(LZ)、邵陽(SY)、新寧(XN)、宜黃(YH) 和宜豐(YF)種群聚為類群II(綠色)。除宜章(YZ)(4株)、井岡山(JGS)(2株)、邵陽(SY)(2株)、宜黃(YH)(1株)種群中的少數(shù)個體(占比3.4%)歸屬于不同類群的Q值小于0.6外，大多數(shù)(96.6%)植株個體的譜系清晰。

AMOVA分析結(jié)果(表4)表明，長柄雙花木種群內(nèi)變異分量占總變異的59.67%，種群間遺傳變異占總變異的40.33%，種群間遺傳差異極顯著(P<0.001)。

圖1 STURCTURE分析結(jié)果的直方圖(K=2)Fig.1 Histogram of the STRUCTURE analysis for the model with K=2

表4 長柄雙花木種群分子方差分析Tab.4 The molecular variance analysis of populations of D. cercidifolius var. longipes

2.3 長柄雙花木種群歷史

基于雙相突變模型檢測長柄雙花木參試種群近期進化歷史上是否經(jīng)歷遺傳瓶頸效應(yīng)的結(jié)果(表5)顯示，12個種群均未出現(xiàn)雜合子過?，F(xiàn)象(P>0.05)，所有種群中的等位基因分布模式為正常L型分布(normal L-shaped distribution)，不符合漂移模型(shifted mode)，表明長柄雙花木種群未經(jīng)歷遺傳瓶頸事件。

表5 長柄雙花木種群遺傳瓶頸效應(yīng)檢測①Tab.5 Bottleneck detection for D. cercidifolius var. longipes

3 討論

3.1 長柄雙花木自然種群的遺傳多樣性

我國南方地區(qū)山脈走向多變，地形復(fù)雜，物種多樣性和特有性程度高，是人類活動較頻繁的經(jīng)濟地理區(qū)域，自然生境碎片化較為嚴(yán)重(Zhaoetal., 2012)。本研究表明，該區(qū)域特有物種長柄雙花木維持較高水平的遺傳變異(表1、表2)，與前人的研究結(jié)論(肖宜安等， 2003； Yuetal., 2014)一致，也與基于SSR標(biāo)記分析我國南方同科植物檵木(Loropetalumchinense)(Yuanetal., 2015)的結(jié)果相類似。這表明，近期生境碎片化和遺傳漂變并未對其種群遺傳多樣性產(chǎn)生嚴(yán)重影響(Zhaoetal., 2012; Yuanetal., 2015)。

大量研究表明，一些珍稀、特有物種維持較高遺傳多樣性(Geetal., 2003; Zhaoetal., 2012； Turchettoetal., 2016; Soaresetal., 2018)。遺傳多樣性高低與物種的演化歷史、冰期避難所種群的遺傳多樣性維持、分布區(qū)的地域特征、物種的生態(tài)習(xí)性及交配系統(tǒng)等諸多因素有關(guān)(Xiaoetal., 2015; Turchettoetal., 2016; Soaresetal., 2018)。長柄雙花木維持較高遺傳多樣性，可能與該物種起源古老、第四紀(jì)冰期種群結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定、現(xiàn)實種群為其避難所殘跡有關(guān)(Geetal., 2003; Behlingetal., 2007; Yuetal., 2014)。

本研究中，所有位點都偏離Hardy-Weinberg平衡(表2)。絕大多數(shù)(91.7%)種群內(nèi)近交系數(shù)為正值，呈現(xiàn)出極顯著的不平衡狀況，表現(xiàn)為雜合子缺失(表1)，揭示出種群內(nèi)普遍存在自交或近交(王雁紅等， 2015； Turchettoetal., 2016)，這符合長柄雙花木植株叢生、自交親和的生物學(xué)特性。

3.2 長柄雙花木種群遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳分化

長柄雙花木遺傳變異主要存在于種群內(nèi)(59.67%，表4)，與Yu等(2014)的研究結(jié)論基本一致。分子方差分析結(jié)果中的種群間變異組分(40.33%)與估算的成對種群遺傳分化系數(shù)平均值(0.354)相差不大，種群間遺傳分化程度較高。但是，與肖宜安等(2003)和謝國文等(2014)研究得出的種群間遺傳差異較小的結(jié)論相反。這可能與前人采集的樣本材料來源于局部區(qū)域有關(guān)。

植物種群遺傳分化程度受其交配系統(tǒng)、生活史、分布類型、花粉/種子傳播方式及分布范圍、隔離程度及進化歷史等諸多因素影響。長柄雙花木的繁育系統(tǒng)為混合交配系統(tǒng)，小粒種子依靠風(fēng)力傳播(肖宜安等， 2003)，但種群遺傳分化系數(shù)高于基于SSR標(biāo)記揭示的混合交配系統(tǒng)(0.26)、種子依靠風(fēng)力傳播(0.13)、特有(0.26)、窄域分布(0.23)的植物種群遺傳分化系數(shù)的統(tǒng)計平均值(Nybom， 2004)。這可能與該物種對生境要求特殊以及分布區(qū)的地形地貌特征有關(guān)。長柄雙花木間斷分布于南嶺山脈、羅霄山脈及武夷山脈，多在空氣濕度大的溝谷、溪流兩旁生長，種群間被走向多樣的高山阻隔。

STRUCTURE分析結(jié)果(圖1)表明，長柄雙花木自然種群被聚為2個不同類群，個體譜系清晰，與Yu等(2014) 基于AFLP標(biāo)記技術(shù)的研究結(jié)果(南嶺類群和華東類群)基本吻合。

3.3 長柄雙花木種群的歷史事件

更新世期間，我國亞熱帶地區(qū)的氣候溫和(Juetal., 2007)，長柄雙花木可能廣泛分布于該地理區(qū)域。末次盛冰期(約2.2萬年前)，該地區(qū)氣溫比當(dāng)前低 4～6 ℃，明顯變干(Qiuetal., 2011)，但南嶺山脈、武夷山脈的氣候波動較小(Fengetal., 2016)，可能為該物種生存提供了較適宜的生境條件，成為其避難所。

末次盛冰期以來，長柄雙花木的潛在分布區(qū)收縮(孟藝宏等， 2019)，歷史種群中的等位基因分布模型為正常L型分布，沒有經(jīng)歷遺傳瓶頸事件(表5)，這表明該物種可能遭受末次盛冰期的氣候影響較小。長柄雙花木種群進化歷史過程不符合基于化石孢粉證據(jù)揭示的第四紀(jì)冰期亞熱帶植物“收縮-擴張”模型(即冰期向低緯度遷移至避難所，間冰期及冰期后向高緯度擴張)(Yuetal., 2000; Nietal., 2010)。這與分布于我國南方的白菊木(Leucomerisdecora) (Zhaoetal., 2012)、甜櫧(Castanopsiseyrei)(Shietal., 2014)、三葉崖爬藤(Tetrastigmahemsleyanum)(Wangetal., 2015)、檵木(Gongetal., 2016)的種群歷史過程相類似。Zhao等(2012)認為，復(fù)雜的地形特點，可能會引起植物種群間諸多的地理隔離因素產(chǎn)生，在間冰期種群間仍然保持隔離。自然地理屏障隔離，以及氣候變遷和人類經(jīng)濟活動造成的生境碎片化，導(dǎo)致種群間遺傳分化加劇，種群規(guī)?？s小甚至部分種群趨向滅絕，是長柄雙花木現(xiàn)代地理分布格局和種群遺傳結(jié)構(gòu)的主要成因。

3.4 長柄雙花木遺傳資源保護

長柄雙花木種群間遺傳分化較大(表3、表4)，種群中私有基因較豐富(表1)。因此，保護種群遺傳多樣性，是防止該物種特異種質(zhì)流失的關(guān)鍵，也對維持種群遺傳結(jié)構(gòu)十分重要。目前，該物種的大多數(shù)種群分布于自然保護區(qū)內(nèi)，自然生境得到了有效保護，但種群中的幼苗過少，為負增長型結(jié)構(gòu)(繆紳裕等， 2014)。如何采取有效的營林措施促進其種群的自然更新能力，將是今后研究的重點。前期采樣發(fā)現(xiàn)，邵陽種群(SY)分布地已被當(dāng)?shù)卣?guī)劃為旅游區(qū)，而新寧種群(XN)的周邊為農(nóng)田，人為干擾破壞極為嚴(yán)重。因此，分布于自然保護區(qū)外的種群，建立自然保護小區(qū)的工作已顯得迫在眉睫。相對于其他種群，井岡山種群(JGS)和宜豐種群(YF)的遺傳多樣性最為豐富(表1)，應(yīng)重點開展這2個種群的生境監(jiān)測和種群生殖生物學(xué)特性研究，評估生境碎片化對小尺度種群空間遺傳結(jié)構(gòu)、交配系統(tǒng)的影響。加強長柄雙花木的繁殖生物學(xué)特性和人工輔助授粉技術(shù)研究，突破其“花多果少”的繁殖瓶頸，對該物種自然種群恢復(fù)與重建、人工遷地保育和資源開發(fā)利用都尤為重要。

4 結(jié)論

近期生境碎片化和遺傳漂移對長柄雙花木種群遺傳多樣性影響較小。長柄雙花木在物種和種群水平上，維持較豐富的遺傳變異，具有較高的進化潛力。種群間的自然屏障，以及氣候變遷和人類干擾導(dǎo)致的種群生境碎片化，是其現(xiàn)代地理分布格局和種群遺傳結(jié)構(gòu)的主要成因。本研究從物種水平上較全面地揭示了長柄雙花木種群遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)特征，可為該物種遺傳資源保護策略的制定提供科學(xué)依據(jù)。