轉(zhuǎn)玉米PEPC和PPDK基因楊樹(shù)苗期的光合生理特性

孫偉博 宮新棟 周 燕 李紅巖

(南京林業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境學(xué)院 南京 210037)

楊樹(shù)(Populus)是世界上中緯度平原地區(qū)主要的人工種植速生樹(shù)種之一，也是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)林木，具有生長(zhǎng)快、產(chǎn)量高、成林早、易加工等眾多優(yōu)勢(shì)，是人工速生豐產(chǎn)林的主要樹(shù)種(趙桂華， 2011)。楊樹(shù)作為木本植物與草本植物相比較，生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，并且屬于光合效率較低的C3植物，其光能利用率低(Yuanetal.， 2017)，與理想的光能利用率差距較大，因此，提高光合作用的效率對(duì)于木本植物尤其是楊樹(shù)等速生樹(shù)種的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用。在自然界中，玉米(Zeamays)、高粱(Sorghumbicolor)等作物屬于C4植物，具有較高的光合效率，能夠有效濃縮CO2，這些植物的CO2補(bǔ)償點(diǎn)低、光合補(bǔ)償點(diǎn)高，使得它們?cè)谶m宜環(huán)境中和逆境條件下均能有更高的光合效率。因此，將C4植物光合作用的關(guān)鍵基因引入C3植物進(jìn)行表達(dá)，是解決相關(guān)問(wèn)題的熱點(diǎn)研究領(lǐng)域(Ishimaruetal.， 1998； Huoetal.， 2017； Sivarametal.， 2018)。

對(duì)C4植物光合能力具有重要作用的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenol pyruvate carboxylase，PEPC)，其酶活性強(qiáng)，是1,5-二磷酸核酮糖羧化酶活性的60倍，對(duì)CO2親和力大(Singhetal.， 2012)； 另外一個(gè)關(guān)鍵的限速酶即磷酸丙酮酸二激酶(phosphopyruvate dikinase，PPDK)，該酶主要分布于葉肉細(xì)胞的葉綠體中，催化CO2最初受體PEP的再生(Wangetal.， 2012)。二者是C4植物具有高效光合作用的關(guān)鍵。在擬南芥(Arabidopsisthaliana)、小麥(Triticumaestivum)等C3植物中也成功獲得了轉(zhuǎn)C4型PEPC基因的植株，并相應(yīng)提高了其光合效率(Lebouteilleretal.， 2007； Chenetal.， 2004)； 將玉米PPDK基因轉(zhuǎn)化到水稻(Oryzasativa)中，葉片總N含量明顯升高(嚴(yán)建民等， 2003)； 使用共轉(zhuǎn)法獲得的轉(zhuǎn)PEPC和PPDK基因水稻株系，其孕穗期葉綠素?zé)晒鈪?shù)及相關(guān)生理生化指標(biāo)等均有顯著提高(崔紅云等， 2012)。本研究選取C4植物玉米中的PEPC和PPDK基因，并通過(guò)基因工程手段將這2種基因轉(zhuǎn)化南林895楊(P.deltoides×P.euramericana‘Nanlin 895’)，獲得穩(wěn)定高效表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株，并對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行分子檢測(cè)、生理生化檢測(cè)以及相關(guān)功能分析，為培育楊樹(shù)高光效新品種提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選取玉米植株(B73品系)的葉片用于基因克隆，南林895楊植株作為轉(zhuǎn)化的目的材料并進(jìn)行分子及生理檢測(cè)。

1.2 玉米PEPC及PPDK基因信息挖掘及分析

選擇ZeamaysEnsembl-18和ZeamaysPH207 V1.1數(shù)據(jù)庫(kù)(https:∥phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#)進(jìn)行PEPC和PPDK基因的相關(guān)信息挖掘，分別以phosphoenolpyruvate carboxylase和pyruvate phosphate dikinase為關(guān)鍵詞進(jìn)行搜索，對(duì)搜索結(jié)果依據(jù)功能注釋、保守功能域結(jié)構(gòu)及家族標(biāo)簽進(jìn)行篩選。

1.3 玉米PEPC和PPDK表達(dá)分析

利用real-time qPCR技術(shù)對(duì)PEPC和PPDK基因在玉米中時(shí)空表達(dá)差異進(jìn)行分析。PEPC基因real-time qPCR引物為： 正向： 5′-TCACACATGCT GATCCTGGC-3′，反向： 5′-GTCAGGACGAGGTCAAC AGT-3′；PPDK基因real-time qPCR引物為： 正向： 5′-GCTCAAAATGCACCAGGGAC-3′，反向： 5′-TTGT TGCCCTCGCTCTTGCC-3′。

1.4 目的基因的克隆及載體構(gòu)建

使用多糖多酚RNA提取試劑盒(北京天根生化)進(jìn)行RNA提?。?cDNA的合成使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara)； 目的基因克隆及擴(kuò)增所使用菌株為大腸桿菌(Escherichiacoli)Trans1-T1菌株(Transgen)和大腸桿菌TOP10菌株(北京天根生化)； 擴(kuò)增所使用載體為pTOPO-T(Transgen)。根據(jù)目的基因保守區(qū)設(shè)計(jì)3′及5′端引物(PEPC引物序列： 正向： 5′-CCTCTCGCTCCGTCC-3′，反向： 5′-CCATAGATAT GATCCCCTACAGA-3′；PPDK引物序列： 正向： 5′-ATGGCGGCATCGGTTTCC-3′，反向： 5′-CAAGCACC TGAGCTGCAG-3′)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增并回收目的片段，經(jīng)擎科公司測(cè)序正確后，利用Gateway系統(tǒng)將目的基因分別構(gòu)建到植物表達(dá)載體pGWB406中(圖1)，目的基因通過(guò)重組反應(yīng)連接到attR1和attR2之間，啟動(dòng)子為花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子。

圖1 pGWB406載體圖譜Fig.1 Vector map of pGWB406P35S： 花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子； attR1和attR2： 重組反應(yīng)識(shí)別位點(diǎn)； CmR： 氯霉素抗性基因； ccdB： Gateway載體自殺序列； ori： 復(fù)制起始位點(diǎn)； aadA(SpcR)： 壯觀霉素抗性基因； PNOS： 胭脂堿合酶NOS啟動(dòng)子； NPTII： 卡那霉素抗性基因； TNOS： 胭脂堿合酶NOS終止子； LB： T-DNA左邊界； RB： T-DNA右邊界。P35S: CaMV 35S promoter; attR1 and attR2: Recognition sites of recombination reaction; CmR: Chloramphenicol resistant gene; ccdB: Suicide sequence at Gateway vector; ori: Origin of repulication; aadA(SpcR): Spectinomycin resistant gene; PNOS: Nopaline synthase NOS promoter; NPTII: Kanamycin resistant gene; TNOS: Nopaline synthase NOS terminator; LB: T-DNA left border; RB: T-DNA right border.

1.5 楊樹(shù)遺傳轉(zhuǎn)化及分子檢測(cè)

將含有目的基因的表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌(Agrobacterium)EHA105，采用南林895楊葉盤(pán)進(jìn)行侵染，預(yù)培養(yǎng)1天，侵染菌液OD值為0.8。侵染結(jié)束用無(wú)菌濾紙吸干多余菌液，將葉盤(pán)置于分化培養(yǎng)基(MS + 6-BA 0.5 mg·L-1+ TDZ 0.002 mg·L-1+ 蔗糖 30 g·L-1+ 瓊脂 6.5 g·L-1+ 頭孢霉素 100 mg·L-1)，暗培養(yǎng)3天，將葉盤(pán)置于分化篩選培養(yǎng)基(分化培養(yǎng)基 + 卡那霉素25 mg·L-1+ 特美汀 100 mg·L-1)，長(zhǎng)芽后轉(zhuǎn)入芽生長(zhǎng)篩選培養(yǎng)基(MS + 6-BA 0.2 mg·L-1+ TDZ 0.001 mg·L-1+ 蔗糖 25 g·L-1+ 瓊脂 6.5 g·L-1+ 卡那霉素20 g·L-1+ 頭孢霉素 100 mg·L-1+ 特美汀 100 mg·L-1)，最后轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基(1/2 MS + 蔗糖 20 g·L-1+ 瓊脂 6.5 g·L-1+ 卡那霉素 10 mg·L-1+ 頭孢霉素 100 mg·L-1+ 特美汀 100 mg·L-1)，于溫室培養(yǎng)，每隔20天更換培養(yǎng)基至獲得完整抗性植株。

篩選抗性植株，進(jìn)行PCR檢測(cè)，PEPC基因的引物為PEPC35S-F: 5′-GCAAGACCCTTCCTCTATAT-3′，PEPC-C-R: 5′-CTTAAGAGCAGTGTCAACCC-3′，檢測(cè)片段長(zhǎng)度851 bp；PPDK基因的引物為PPDK35S-F: 5′-GCAAGACCCTTCCTCTATAT-3′，PPDK-C-R: 5′-GTAGACCTCCTTGTACTGAC-3′，檢測(cè)片段長(zhǎng)度為832 bp。

1.6 轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)植株的表達(dá)分析

選用actin為內(nèi)參基因，分別以組培瓶中生長(zhǎng)3個(gè)月的組培苗和移栽溫室中2個(gè)月約60 cm高的盆栽苗為試驗(yàn)材料，對(duì)PEPC和PPDK基因在南林895楊中表達(dá)量進(jìn)行分析，具體試驗(yàn)參照1.3 所述方法。蛋白表達(dá)分析選取組培瓶中生長(zhǎng)3個(gè)月的南林895楊轉(zhuǎn)基因植株和對(duì)照組植株的葉片，分別提取總蛋白并利用Bradford方法測(cè)定蛋白濃度，根據(jù)蛋白濃度對(duì)待檢測(cè)蛋白樣品進(jìn)行定量，通過(guò)SDS-PAGE進(jìn)行蛋白電泳，檢測(cè)分析轉(zhuǎn)基因植株與對(duì)照組蛋白表達(dá)差異。

1.7 轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)光合作用相關(guān)參數(shù)及葉綠素指標(biāo)測(cè)定

使用GFS-3000便攜式光合儀測(cè)定已在溫室中生長(zhǎng)2個(gè)月的南林895楊盆栽苗的光合參數(shù)，選擇6、7月份晴朗無(wú)云的天氣條件下7:00—19:00之間的整點(diǎn)時(shí)刻進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定植株選擇相同時(shí)間移栽、長(zhǎng)勢(shì)相同且健壯的幼苗，每個(gè)株系取5株，測(cè)定從植株頂端數(shù)第3—5片長(zhǎng)勢(shì)相同的葉片，每個(gè)植株測(cè)定3片，每個(gè)處理重復(fù)3次。測(cè)定數(shù)據(jù)包括光合速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(Gs)、蒸騰速率(Tr)、胞間CO2濃度(Ci)及對(duì)CO2響應(yīng)、對(duì)光照響應(yīng)及光合效率(LUE)等。光合效率的計(jì)算： 凈光合速率與光合有效輻射的比值。

CO2響應(yīng)的測(cè)定條件： 光合有效輻射1 200 μmol·m-2s-1，葉室溫度30 ℃，相對(duì)濕度60%； 相關(guān)參數(shù)通過(guò)回歸分析獲得。CO2濃度在0～1 000 μmol·mol-1范圍內(nèi)，每隔100 μmol·mol-1，設(shè)定若干梯度，測(cè)定對(duì)應(yīng)的光合速率值。

光響應(yīng)的測(cè)定條件： 葉室CO2濃度350 μmol·mol-1，葉室溫度30 ℃，相對(duì)濕度60%； 相關(guān)參數(shù)通過(guò)回歸分析獲得。光合有效輻射在0～1 400 μmol·m-2s-1范圍內(nèi)，每隔100 μmol·m-2s-1，設(shè)定若干梯度，測(cè)定對(duì)應(yīng)的光合速率值。

1.8 轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定

對(duì)南林895楊轉(zhuǎn)基因株系和對(duì)照組的生長(zhǎng)狀況進(jìn)行測(cè)定記錄，在轉(zhuǎn)入花盆中生長(zhǎng)60天后對(duì)株高、地徑進(jìn)行測(cè)量記錄，分別選取不同植株相同位置的葉片進(jìn)行面積和質(zhì)量測(cè)定，每個(gè)植株選取生長(zhǎng)狀態(tài)一致的8片葉片。生長(zhǎng)量測(cè)定，每個(gè)株系選定3個(gè)樣本，40天后從花盆中取出清洗干凈，75 ℃干燥至恒重后進(jìn)行測(cè)量。

1.9 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，利用SPSS 16.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行誤差計(jì)算及差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米PEPC及PPDK基因序列

利用生物信息學(xué)工具對(duì)玉米PEPC和PPDK基因編碼蛋白進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)，蛋白理化性質(zhì)及亞細(xì)胞定位如表1所示，PEPC蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)中，PPDK蛋白定位于葉綠體中，與其家族蛋白亞細(xì)胞定位一致，2個(gè)蛋白與各自家族蛋白成員相同均不含有信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)，并各自具有本家族蛋白保守的結(jié)構(gòu)基序和活性位點(diǎn)。PEPC基因編碼蛋白序列中，具有形成與PEPC蛋白家族功能密切相關(guān)的典型裂縫結(jié)構(gòu)的4個(gè)保守基序(FHK-x-W，SWYKWP，TAHPT-x-R，M-x-GYSDS-x-K-x-G，其中x為非保守位點(diǎn))，并具有保守的活性催化位點(diǎn)K和H；PPDK基因編碼蛋白序列中，具有與PPDK蛋白家族催化作用密切相關(guān)的3個(gè)保守基序(K-x-P-x-DL-x-N-x-YK，G-x-NDL-x-Q-x-R，G-G-x-H-x-R)及保守的活性催化位點(diǎn)K和H。通過(guò)對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行的生理生化、結(jié)構(gòu)域基序、信號(hào)肽、功能位點(diǎn)等相關(guān)分析和預(yù)測(cè)，表明玉米PEPC和PPDK基因編碼蛋白均具有其相關(guān)家族高度保守的功能域，2個(gè)基因均為光合作用關(guān)鍵酶的編碼基因。

表1 PEPC和PPDK蛋白理化性質(zhì)及亞細(xì)胞定位Tab.1 Physicochemical properties and subcellular localization of PEPC and PPDK proteins

2.2 玉米PEPC和PPDK基因的表達(dá)模式

對(duì)PEPC和PPDK基因在玉米中的表達(dá)進(jìn)行分析(圖2)，發(fā)現(xiàn)2個(gè)基因在植株發(fā)育的不同階段及不同組織中表達(dá)量均存在差異。在拔節(jié)期、穗期和花粒期3個(gè)發(fā)育階段，PEPC和PPDK2個(gè)基因在葉片中表達(dá)量明顯高于莖中表達(dá)量。隨著發(fā)育生長(zhǎng)，2個(gè)基因在葉片中表達(dá)量呈上升趨勢(shì)，即花粒期>穗期>拔節(jié)期。在莖中這種趨勢(shì)并不明顯，PEPC基因花粒期在莖中的表達(dá)量低于穗期，PPDK基因在花粒期和穗期的表達(dá)量無(wú)明顯差異。在不同生長(zhǎng)階段中，PEPC基因的表達(dá)量均高于PPDK基因。PEPC和PPDK基因在葉片中表達(dá)占優(yōu)勢(shì)，與其參與光合作用的生理過(guò)程相一致。

2.3 轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)分子檢測(cè)及基因表達(dá)

2.3.1 楊樹(shù)遺傳轉(zhuǎn)化及分子檢測(cè) 侵染的葉盤(pán)在共培養(yǎng)3天后轉(zhuǎn)移到分化篩選培養(yǎng)基，待抗性芽生長(zhǎng)健壯后轉(zhuǎn)入芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基，最后將幼苗置于生根培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)獲得完整的轉(zhuǎn)化植株。幼苗培養(yǎng)3個(gè)月后可轉(zhuǎn)移到土壤中生長(zhǎng)。具體過(guò)程如圖3a-f所示。

圖3 轉(zhuǎn)基因南林895楊的獲得及分子檢測(cè)Fig.3 Obtainment and molecular detection of transgenic ‘Nanlin 895’ poplarsa-f: 轉(zhuǎn)基因植株獲得； g: PCR檢測(cè)； h, i: 葉片內(nèi)蛋白含量分析。CK: 對(duì)照組； M: Marker； PEPC1-5： 轉(zhuǎn)PEPC基因5個(gè)株系； PPDK1-3： 轉(zhuǎn)PPDK基因3個(gè)株系。a-f: Process of transformation; g: PCR detection; h, i: Analysis of protein content of leaves. CK: Control lines; M: Marker; PEPC1-5: 5 PEPC transgenic lines; PPDK1-3: 3 PPDK transgenic lines.

圖2 PEPC和PPDK基因在不同發(fā)育階段玉米莖、葉中的表達(dá)量Fig.2 Relative expression of PEPC and PPDK gene in stems and leaves of Zea mays at different developmental stages

對(duì)篩選獲得的陽(yáng)性植株進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果表明PEPC獲得5個(gè)轉(zhuǎn)基因株系，PPDK獲得3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系(圖3g)。對(duì)轉(zhuǎn)基因植株蛋白表達(dá)進(jìn)行分析，結(jié)果表明在轉(zhuǎn)PEPC基因植株和PPDK基因植株中，均有目的蛋白條帶(PEPC基因編碼蛋白約110 kDa，PPDK基因編碼蛋白約103 kDa)存在，對(duì)照組中沒(méi)有表達(dá)(圖3h、i)，表明基因已轉(zhuǎn)化到南林895楊中并正常表達(dá)。同時(shí)，電泳結(jié)果表明各轉(zhuǎn)基因株系間葉片中蛋白含量無(wú)顯著差異。

2.3.2 轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)的基因表達(dá) 對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行real-time qPCR檢測(cè)，比較轉(zhuǎn)基因株系間的基因表達(dá)水平，對(duì)基因表達(dá)組織特異性進(jìn)行分析，并對(duì)不同時(shí)期轉(zhuǎn)基因植株的相關(guān)基因表達(dá)量進(jìn)行比對(duì)。

在轉(zhuǎn)基因植株組培苗中，PEPC和PPDK基因在葉片中表達(dá)量顯著高于莖中。PEPC在不同株系間表達(dá)量差異明顯，PEPC-3株系表達(dá)量最低，PEPC-5株系表達(dá)量最高，是PEPC-3株系表達(dá)量的1.79倍；PPDK基因在3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中表達(dá)量無(wú)顯著差異(圖4a)。未轉(zhuǎn)基因南林895楊中無(wú)目的基因，故沒(méi)有其表達(dá)量分析結(jié)果。

對(duì)轉(zhuǎn)基因植株盆栽苗表達(dá)分析結(jié)果表明，PEPC基因表達(dá)量比PPDK基因表達(dá)量高，同時(shí)葉片中的基因表達(dá)量高于莖中(圖4b)，這與組培苗時(shí)期(圖4a)相同，但差距更為明顯。以組培苗葉片基因表達(dá)量最低值(即PPDK-2)作為基數(shù)，分別計(jì)算組培苗和盆栽苗植株葉片中基因表達(dá)量的平均值與此基數(shù)的比值(圖4c)，比對(duì)結(jié)果表明，盆栽苗葉片中2個(gè)基因的表達(dá)量顯著高于組培苗時(shí)期，與生長(zhǎng)時(shí)間呈正相關(guān)關(guān)系，這可能與植物葉片生長(zhǎng)、光合作用提高有直接關(guān)系。

另一方面，對(duì)轉(zhuǎn)基因的盆栽苗進(jìn)行了不同光照處理(圖5)，結(jié)果表明2個(gè)基因表達(dá)量均在高光照條件下升高，高光照下基因表達(dá)量是低光照條件下的2～3倍，基因表達(dá)受光照條件調(diào)控作用明顯。

圖4 PEPC和PPDK基因在轉(zhuǎn)基因南林895楊莖葉中的表達(dá)Fig.4 Relative expression of PEPC, PPDK genes in stem and leaf of transgenic ‘Nanlin895’ poplarsa： 組培苗； b： 盆栽苗； c： 組培苗與盆栽苗葉片中表達(dá)量比對(duì)，以組培苗葉片基因表達(dá)量最低值(即PPDK-2)作為基數(shù)。a: Tissue culture plantlets; b: Potted young plants; c: Comparison of expression in leaves between tissue culture plantlets and potted young plants, taking the lowest gene expression value(PPDK-2) in leaves of tissue culture plantlets as the base value.

圖5 轉(zhuǎn)基因南林895楊在不同光照條件下PEPC和PPDK基因的相對(duì)表達(dá)量Fig.5 Relative expression of PEPC and PPDK gene in transgenic ‘Nanlin895’ poplars under different light conditions

2.4 轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)的光合作用水平

2.4.1 光合速率日變化 南林895楊轉(zhuǎn)基因株系及對(duì)照植株的凈光合速率(圖6)在一天當(dāng)中均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。PEPC-1、PEPC-2株系呈現(xiàn)單峰狀態(tài)，對(duì)照組和PEPC-3、PEPC-4和PEPC-5株系均呈現(xiàn)雙峰變化趨勢(shì)，其中PEPC-5株系雙峰狀態(tài)最為明顯且最大值高于對(duì)照組16.2%。轉(zhuǎn)PPDK基因株系均未出現(xiàn)雙峰狀態(tài)，且凈光合速率的最大值低于轉(zhuǎn)PEPC基因植株。與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)基因株系在早晨及傍晚低光照條件下凈光合速率出現(xiàn)低于對(duì)照組的情況。

圖6 南林895楊轉(zhuǎn)基因株系和對(duì)照組的凈光合速率(Pn)日變化Fig.6 Diurnal change of net photosynthetic rate(Pn) in transgenic ‘Nanlin895’ poplars and control不同小寫(xiě)字母表示不同株系間數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05)，下同。Different lowercase letters represent significant difference among lines(P<0.05), the same below.

2.4.2 氣孔導(dǎo)度日變化 所有植株的氣孔導(dǎo)度在一天當(dāng)中的變化趨勢(shì)相同，均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。轉(zhuǎn)PEPC基因植株在中午高光照條件下，氣孔導(dǎo)度均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)； 在早晨和傍晚，大部分轉(zhuǎn)基因株系的氣孔導(dǎo)度低于對(duì)照組(圖7)。5個(gè)PEPC株系的氣孔導(dǎo)度日變化也存在差異性：PEPC-1和PEPC-2株系的氣孔導(dǎo)度在10:00后一直呈現(xiàn)逐步上升的趨勢(shì)，在15:00出現(xiàn)大幅下降(PEPC-1下降27.6%，PEPC-2下降31.3%)；PEPC-3和PEPC-4株系及對(duì)照組植株的氣孔導(dǎo)度在10:00—14:00之間出現(xiàn)波動(dòng)趨勢(shì)，具有雙峰值，其中對(duì)照組植株的谷值出現(xiàn)在13:00而轉(zhuǎn)基因株系PEPC-3和PEPC-4的谷值出現(xiàn)在12:00且均高于對(duì)照組谷值；PEPC-5株系的氣孔導(dǎo)度在13:00之前一直維持較低水平，在14:00出現(xiàn)峰值后一直到16:00均維持較高水平。轉(zhuǎn)PPDK基因植株的氣孔導(dǎo)度在10:00之前與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P<0.05)，在13:00—16:00之間高于對(duì)照組，各株系間差異不顯著。另一方面，與氣孔導(dǎo)度相關(guān)的蒸騰速率的測(cè)定結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因植株與對(duì)照組之間無(wú)顯著差異。

圖7 轉(zhuǎn)基因南林895楊和對(duì)照組的氣孔導(dǎo)度(Gs)日變化Fig.7 Diurnal change of stomatal conductance(Gs) in transgenic ‘Nanlin895’ poplars and control

2.4.3 胞間CO2濃度日變化及光合速率對(duì)CO2濃度的響應(yīng) 南林895楊轉(zhuǎn)基因株系與對(duì)照組的胞間CO2濃度均在7:00出現(xiàn)峰值，在中午時(shí)間段出現(xiàn)下降趨勢(shì)。除PPDK-2株系外，轉(zhuǎn)基因株系都檢測(cè)到比對(duì)照組更高的胞間CO2濃度，表明轉(zhuǎn)基因株系比對(duì)照組有強(qiáng)的CO2固定能力。在CO2濃度為0～700 μmol·mol-1的區(qū)間中，轉(zhuǎn)基因株系及對(duì)照組的光合響應(yīng)強(qiáng)度均呈線性增長(zhǎng)，之后隨CO2濃度的升高，逐漸達(dá)到飽和狀態(tài)(圖8)。除PEPC-4株系外，轉(zhuǎn)PEPC和轉(zhuǎn)PPDK基因株系的光合響應(yīng)在任何CO2濃度下均高于對(duì)照組，表明轉(zhuǎn)基因植株光合能力較對(duì)照組增強(qiáng)。

圖8 轉(zhuǎn)基因南林895楊和對(duì)照組對(duì)CO2濃度的光合響應(yīng)變化Fig.8 Changes of photosynthetic response to CO2 concentration of transgenic ‘Nanlin895’ poplars and control

2.5 轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)的生長(zhǎng)性狀及生物量

盡管光合作用參數(shù)表明轉(zhuǎn)PEPC和PPDK基因的南林895楊植株具有更高效的光合作用，但是植物生長(zhǎng)并不是單一的生理過(guò)程。因此，評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因株系的優(yōu)劣需要進(jìn)行生物學(xué)性狀的比較。對(duì)同一批次的轉(zhuǎn)基因植株及對(duì)照組植株進(jìn)行株高、地徑、葉片質(zhì)量及葉片面積的測(cè)量，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因植株在多個(gè)指標(biāo)上優(yōu)于對(duì)照組(圖9)，但是具有顯著差異的僅有PEPC-3和PEPC-4株系，這2個(gè)株系在株高與葉片質(zhì)量指標(biāo)上顯著優(yōu)于對(duì)照組(P<0.05)。其中，PEPC-3和PEPC-4株系平均株高分別高于對(duì)照組5.6%和2.9%，葉片面積分別高于對(duì)照組13.8% 和8.9%，葉片質(zhì)量分別高于對(duì)照組23.6%和19.8%，地徑分別高于對(duì)照組13.5% 和5.4%，證明在PEPC-3和PEPC-4株系中，PEPC基因的表達(dá)對(duì)植株的生長(zhǎng)性狀產(chǎn)生了顯著影響。

圖9 轉(zhuǎn)基因南林895楊和對(duì)照組的生長(zhǎng)性狀Fig.9 The growth of transgenic ‘Nanlin895’ poplars and control*表示轉(zhuǎn)基因植株與對(duì)照組數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05)，下同。* represents significant difference between transgenic poplars and control(P<0.05), the same below.

進(jìn)一步對(duì)轉(zhuǎn)基因植株和對(duì)照組植株的生物量進(jìn)行測(cè)定比較，結(jié)果如圖10所示。所有植株的根生物量沒(méi)有明顯差異； 轉(zhuǎn)基因株系的莖生物量均高于對(duì)照組，生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)最為顯著的為PEPC-3，其莖生物量為對(duì)照組的1.2倍，與之前株高測(cè)量的結(jié)果基本一致； 葉生物量?jī)?yōu)勢(shì)明顯的依次是PEPC-3、PEPC-5和PEPC-4株系，分別高于對(duì)照組34.8%、15.4%和6.3%。生物量測(cè)定結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了轉(zhuǎn)基因植株光合作用的增強(qiáng)，但轉(zhuǎn)基因株系間差異顯著，優(yōu)勢(shì)最為明顯的為PEPC-3株系，且生物量的增長(zhǎng)主要在莖和葉。

圖10 轉(zhuǎn)基因南林895楊和對(duì)照組的生物量Fig.10 Biomass of transgenic ‘Nanlin895’ poplars and control

3 討論

PEPC和PPDK是C4植物光合作用中的關(guān)鍵酶，直接關(guān)系到CO2固定和濃縮，在光合作用初級(jí)代謝階段發(fā)揮重要作用，C4植物具有的高效的光合作用主要是因?yàn)镻EPC及PPDK等關(guān)鍵的光合酶系統(tǒng)，使其在光能和CO2利用率以及抗光抑制性上更具優(yōu)勢(shì)(Tangetal.， 2017)。將C4植物PEPC和PPDK基因轉(zhuǎn)入到C3植物進(jìn)行表達(dá)被認(rèn)為是提高C3植物光合作用的重要手段，目前在水稻中已廣泛應(yīng)用，并有效地提高了水稻的光合能力及耐旱能力(Sethietal.， 2016)。將玉米PEPC基因構(gòu)建到秈稻當(dāng)中，PEPC酶能夠顯著提高轉(zhuǎn)基因植株葉片細(xì)胞對(duì)于CO2的固定能力，并能夠增強(qiáng)高溫條件下轉(zhuǎn)基因秈稻的光合能力(Bandyopadhyayetal.， 2007)； 水稻中過(guò)量表達(dá)玉米PEPC基因能夠降低高氧濃度對(duì)光合作用的氧抑制，該生理過(guò)程并非通過(guò)與CO2的高效結(jié)合完成，而是通過(guò)調(diào)控與O2結(jié)合水平實(shí)現(xiàn)，在此過(guò)程中，PEPC基因的表達(dá)影響了轉(zhuǎn)基因水稻植株內(nèi)2種參與糖類(lèi)代謝的關(guān)鍵酶SPS和FBPase的合成(Agarieetal.， 2002)； 在轉(zhuǎn)PEPC+PPDK雙基因的水稻中，轉(zhuǎn)化基因能夠提高植株對(duì)CO2的固定和濃縮能力，加速光合循環(huán)，同時(shí)降低活性氧對(duì)質(zhì)膜的損傷，從而提高植株對(duì)水分的利用率及光合效率(姜蓓蓓等， 2018)。

綜上所述，外源PEPC和PPDK基因表達(dá)主要通過(guò)影響細(xì)胞對(duì)CO2結(jié)合及濃縮能力和相關(guān)下游基因的表達(dá)調(diào)控來(lái)提高轉(zhuǎn)基因植物的光合作用。本研究從玉米中克隆獲得的PEPC和PPDK基因與各自基因家族成員具有高度保守性，在PEPC基因編碼蛋白序列中，具有4個(gè)保守基序，能夠形成與羧化酶功能密切相關(guān)的典型裂縫結(jié)構(gòu)，PPDK基因編碼蛋白序列中具有3個(gè)參與催化功能的保守基序，且在2個(gè)蛋白中均存在保守的活性催化位點(diǎn)K和H。保守基序及保守功能位點(diǎn)的存在能夠推測(cè)玉米PEPC和PPDK基因在楊樹(shù)光合作用調(diào)控中發(fā)揮作用。另一方面，PEPC和PPDK序列分析結(jié)果表明，盡管研究中采用35S啟動(dòng)子進(jìn)行轉(zhuǎn)基因表達(dá)，但在光照條件下，轉(zhuǎn)化基因表達(dá)量出現(xiàn)升高現(xiàn)象，推測(cè)與PEPC和PPDK基因中可能存在的調(diào)控元件有密切關(guān)系?？寺～@得玉米PEPC及PPDK基因序列中具有多種調(diào)控元件的編碼序列，如調(diào)控因子MYBCORE和WRKY710S等，光誘導(dǎo)型G-box、GATA-box等，以及熱敏型AT-rich及CATT-motif等，這些序列可能在不同條件誘導(dǎo)下發(fā)揮作用，影響啟動(dòng)子活性，從而影響轉(zhuǎn)化基因的轉(zhuǎn)錄水平和表達(dá)特性(Chuetal.， 2002)，對(duì)轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)光合作用調(diào)控發(fā)揮作用。同時(shí)，2個(gè)基因表達(dá)水平的差異可能與基因插入的拷貝數(shù)等因素有關(guān)。

通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)光合生理相關(guān)指標(biāo)測(cè)定結(jié)果分析，可以發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)胞間CO2濃度在10:00—18:00期間明顯高于對(duì)照植株，在CO2濃度為0～700 μmol·mol-1的區(qū)間中，轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)的光合響應(yīng)強(qiáng)度均呈線性增長(zhǎng)，且高于對(duì)照組，同時(shí)CO2飽和點(diǎn)均低于對(duì)照組，表明與轉(zhuǎn)基因水稻相同，轉(zhuǎn)化的C4植物光合酶提高了楊樹(shù)對(duì)CO2的利用能力。C4途徑不僅能夠提供一個(gè)更高效的CO2濃縮機(jī)制，并能夠提高植物對(duì)水分和光照的利用效率，從而保障C4植物在干旱或強(qiáng)光環(huán)境下具有更高的光合效率(Liuetal.， 2017)。轉(zhuǎn)C4光合基因的作物也表現(xiàn)出相應(yīng)的優(yōu)勢(shì)。轉(zhuǎn)PEPC基因的水稻在PEG脅迫條件下較對(duì)照組有更好的耐旱能力(Qianetal.， 2015)； 在干旱條件下轉(zhuǎn)PEPC水稻氣孔關(guān)閉減少植物體內(nèi)水分流失，使轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐旱性，并在施加外源糖類(lèi)物質(zhì)的條件下恢復(fù)氣孔導(dǎo)度，維持較高的光合水平(張金飛等， 2018)； 在水稻中過(guò)量表達(dá)PEPC基因能夠同時(shí)提高轉(zhuǎn)基因植株的耐旱能力和對(duì)高光強(qiáng)的耐受能力(Dingetal.， 2012)。與轉(zhuǎn)基因水稻相同，本研究中的轉(zhuǎn)基因南林895楊光合效率顯著高于對(duì)照組，主要是由于對(duì)強(qiáng)光的利用率明顯增強(qiáng)，轉(zhuǎn)基因株系在中午時(shí)段凈光合速率高于對(duì)照組，以及第1峰推遲及單峰狀態(tài)都表明轉(zhuǎn)基因植株具有對(duì)高光照更強(qiáng)的耐受性。這與轉(zhuǎn)其他光合基因楊樹(shù)提高光合能力的途徑并不完全一致，例如轉(zhuǎn)PtRCA基因的楊樹(shù)通過(guò)提高耐光氧化性達(dá)到提高自身光合能力的目的(尹吳等， 2017)。另外與水稻等植物轉(zhuǎn)PEPC和PPDK基因的相關(guān)研究結(jié)果不同，本研究中轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)的蒸騰速率較對(duì)照組并沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢(shì)，表明楊樹(shù)蒸騰速率在CO2濃度、空氣濕度、光照等多條件的影響下，并未因PEPC和PPDK基因的插入而出現(xiàn)顯著的變化。

玉米PEPC和PPDK基因的導(dǎo)入提高了轉(zhuǎn)基因南林895楊對(duì)CO2的固定能力和對(duì)于高光強(qiáng)的利用能力，與目前轉(zhuǎn)PEPC和PPDK基因植物的相關(guān)研究結(jié)果一致，并且最終體現(xiàn)為植物生長(zhǎng)量?jī)?yōu)勢(shì)；但轉(zhuǎn)基因南林895楊生物量增長(zhǎng)與基因表達(dá)水平并不完全呈正相關(guān)，且在蛋白水平上，轉(zhuǎn)基因植株與對(duì)照組之間差異不顯著，可能與PEPC和PPDK基因下游產(chǎn)物的合成、翻譯水平的調(diào)控及翻譯后修飾有關(guān)(Ciereszkoetal.， 2001； Zhangetal.， 2018)，表明光合作用是一個(gè)多基因調(diào)控的生理過(guò)程，單個(gè)關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)化不能穩(wěn)定地形成生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，轉(zhuǎn)基因植株需要進(jìn)一步篩選優(yōu)化。

4 結(jié)論

玉米PEPC和PPDK基因的轉(zhuǎn)入能夠提高轉(zhuǎn)基因南林895楊的光合能力，用于轉(zhuǎn)化的玉米PEPC和PPDK基因具有其家族成員的典型保守基序和功能位點(diǎn)，使轉(zhuǎn)基因植株能夠增強(qiáng)對(duì)CO2的固定能力和對(duì)強(qiáng)光的利用能力，在光合生理參數(shù)上表現(xiàn)為影響轉(zhuǎn)基因植株的凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、CO2飽和點(diǎn)等。另一方面，通過(guò)對(duì)植株生長(zhǎng)性狀及生物量的測(cè)定，表明轉(zhuǎn)基因植株的生長(zhǎng)在一定程度上優(yōu)于對(duì)照組，且轉(zhuǎn)PEPC基因株系明顯優(yōu)于轉(zhuǎn)PPDK株系，轉(zhuǎn)基因植株光合能力的提高最終轉(zhuǎn)化為植物生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。