石墨烯/絲素蛋白復(fù)合支架材料及其在組織工程的研究進展

邱榮敏，梁雁

(廣西醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院兒童牙病科，廣西 南寧 530021)

石墨烯具有獨特的理化性質(zhì)，自問世以來便受到生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的青睞，但由于生物降解性差、毒性呈劑量依賴等問題而限制其進一步的應(yīng)用，這些缺點需要通過結(jié)合其他生物材料方可解決。絲素蛋白(silk fibroin，SF)作為一種具有許多優(yōu)點的天然高分子材料，力學(xué)性能卻不盡人意。近年來，研究者們根據(jù)優(yōu)勢互補的原理，將石墨烯材料與SF進行結(jié)合獲得一種性能更加優(yōu)越的復(fù)合材料，并將其應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究和組織工程領(lǐng)域中。本文將對石墨烯材料/SF復(fù)合材料及其在組織工程領(lǐng)域相關(guān)研究進展進行總結(jié)，并提出了一些設(shè)想的挑戰(zhàn)和未來的展望。

1 石墨烯性能及應(yīng)用

石墨烯是一種二維碳納米材料，因碳原子以sp2雜化軌道排列而呈蜂巢晶格的六角形狀[1]，主要分類有氧化石墨烯(graphene oxide，GO)、還原性氧化石墨烯(reduced graphene oxide，RGO)及石墨烯量子點(Graphene quantum dot，GQDs)等。由于石墨烯具有獨特的微觀結(jié)構(gòu)和良好的理化性能、生物相容性，同時還具有抗菌、抗炎特性[2-4]，現(xiàn)已倍受醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的關(guān)注。石墨烯被廣泛運用于藥物/基因載體，提高藥物溶解度，延長循環(huán)周期，針對性地釋放藥物[5]；可作為生物學(xué)標記物用于血糖、血脂等的檢測，具有操作簡單、成本低、選擇性高等可取之處[6-7]；還可作為生物傳感器[8]。此外，因有優(yōu)越的促成骨特性，以石墨烯作為支架的研究呈爆發(fā)式增長[9]，并被組織學(xué)工程高度關(guān)注。然而，石墨烯是二維材料，作為支架，功能尚有欠缺，不能解決三維成形問題；細胞的毒性仍然具有劑量和時間依賴性，并抑制細胞的增殖和分化[10-11]、抗菌和抗炎性能也因劑量的不同而呈現(xiàn)差別[12-13]；生物降解性相對比較低。因此，石墨烯很難單獨被制作成可廣泛應(yīng)用的產(chǎn)品，要利用其突出的性能并和具有優(yōu)勢的其他材料進行復(fù)合，相互取長補短，獲得新型復(fù)合材料。

2 絲素蛋白性能及應(yīng)用

SF是從蠶絲中提取的一種天然高分子蛋白，因容易獲取和制作、具有高度的可塑性和良好的生物相容性，現(xiàn)已廣泛作為生物縫合線使用。SF的生物降解性可調(diào)控，因此可利用不同結(jié)晶度的SF負載藥物而達到控釋效用[14]。SF因可儲存生物分子活性、促進細胞生長等優(yōu)點而被廣泛使用于組織工程領(lǐng)域中，但SF作為支架材料單獨應(yīng)用時機械強度不足，降解速率不確定[15]、促細胞分化作用不足，在骨組織工程中尤其明顯[16]。此外，抗菌性能低[17]，因此，需要結(jié)合其它材料進行改性。

3 石墨烯/SF復(fù)合支架材料的性能和作用

由于石墨烯和SF各自存在優(yōu)缺點，并且性能存在優(yōu)勢互補，學(xué)者們嘗試將石墨烯與SF制作為石墨烯/SF復(fù)合支架材料以期達到最佳的效果。石墨烯/SF復(fù)合支架材料的制作方法多種多樣，包括逐層組裝[18]，或者將石墨烯與SF混合，然后使用冷凍干燥或空氣干燥[19]、靜電紡絲[20]、光化學(xué)交聯(lián)等方法[21]。這些方法包括了物理結(jié)合、化學(xué)結(jié)合或理化兼之?？紤]到理化結(jié)合過程繁瑣、條件苛刻和化學(xué)試劑的使用，一些學(xué)者嘗試了環(huán)保、方便的生物合成：Wang Q等[22-23]使用噴灑有石墨烯的桑葉飼養(yǎng)家蠶或血管注射法將GQDs注入家蠶幼蟲體內(nèi)，可獲得力學(xué)性能提高的蠶絲纖維?？偠灾?，在實際的研究中，可以根據(jù)不同性能的需求而采取不同方式制作石墨烯/SF復(fù)合支架材料。

石墨烯/SF復(fù)合支架通常在機械強度、熱導(dǎo)率、導(dǎo)電率、穩(wěn)定性方面表現(xiàn)出不同程度的改善，同時還呈現(xiàn)良好的生物相容性。如Zhang H等[24]制備了具有高導(dǎo)電性的復(fù)合薄膜，在干、濕兩種條件下都具有優(yōu)異的力學(xué)性能，同時具有良好的剛度和韌性平衡。SF氣凝膠因超高孔隙率可以降低熱傳導(dǎo)而顯示出優(yōu)異的隔熱性能，但力學(xué)性能差，不利于熱管理應(yīng)用，因此利用濕法紡絲和冷凍干燥與GO結(jié)合可得到具有相當孔隙率和力學(xué)性能顯著提高的SF/GO氣凝膠纖維。除此之外石墨烯還具有紅外溫升功能，所以也顯著改善了氣凝膠的加熱性能[25]。良好的力學(xué)性能，有助于解決材料的折疊問題，從而也使石墨烯/SF復(fù)合支架材料具備了三維成形的功效。

正如上文所述，石墨烯和SF均可促進某些特定細胞的增殖和分化，因此，二者結(jié)合不僅使性能得到改善，且呈現(xiàn)更佳的生物相容性，為細胞的生長提供一個良好的自然微環(huán)境，對成骨細胞、成纖維細胞、成軟骨細胞和各種干細胞等均起到良好的促進增殖和分化作用。Nalvuran H等的研究[26]中發(fā)現(xiàn)，采用低濃度RGO與SF形成納米復(fù)合纖維，材料的熱穩(wěn)定性和力學(xué)性能得到了提高；當RGO濃度為1.0 mg/ml時，RGO/SF具有最佳的生物相容性，使細胞在支架內(nèi)有良好的存活率和增殖能力；同樣，由Rodríguez-Lozano FJ等[27]制備的GO和SF復(fù)合膜具有良好的生物相容性，SF增加GO或RGO 表面的粗糙度，使牙周膜干細胞更易于黏附在支架上，促進其生長、增殖和分化。由此可見，石墨烯/SF復(fù)合支架材料能夠保障細胞的正常生物學(xué)行為，這提示該復(fù)合材料在組織工程以及其他生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域?qū)⒂懈訌V闊的應(yīng)用前景。

4 石墨烯/SF復(fù)合支架材料在組織工程的應(yīng)用

由于石墨烯/SF復(fù)合材料具有良好的性能、三維成形的功能和促細胞生長的能力，目前已作為支架材料，在組織工程研究中作為支架應(yīng)用，其中骨組織工程研究最為多見。

4.1骨組織工程的應(yīng)用 研究表明，將GO、SF和羥基磷灰石(HA)共沉積出光滑、均勻的復(fù)合薄膜，溶血率分析和血小板黏附試驗表明薄膜具有良好的血液相容性，人骨肉瘤MG63細胞在該復(fù)合膜上具有良好的黏附和增殖行為，堿性磷酸酶ALP活性增強，說明此復(fù)合材料適用于骨組織工程[28]。骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)能刺激DNA的合成和細胞的復(fù)制，從而促進間充質(zhì)細胞定向分化為成骨細胞。有學(xué)者將BMP-2多肽P24接枝到GO上合成了功能化的GO，并通過靜電作用將GO覆蓋于SF合成具有良好生物相容性的復(fù)合支架。體外細胞實驗證實涂層支架的親水性、細胞黏附性和增殖效果相比未涂層支架均有所提高；而在動物實驗中，P24功能化的GO/SF支架對人工制造的SD大鼠顱骨缺損修復(fù)和再生的效果最佳，促進了臨界骨缺損的骨再生[29]。

4.2神經(jīng)再生組織工程的應(yīng)用 由于石墨烯材料具有一定的導(dǎo)電性，因此可用于神經(jīng)組織工程研究。與對照組(純SF支架)相比，rGO涂層能改善PC 12細胞的黏附能力；同時，SF/rGO支架結(jié)合電刺激促進神經(jīng)表型分化，達到與傳統(tǒng)神經(jīng)生長因子(NGF)處理相當甚至更高的水平[30]。另一研究表明隨著石墨烯含量的增加，干細胞向神經(jīng)分化程度增加，其機制可能是石墨烯能夠傳遞電刺激信號，刺激神經(jīng)元的伸展和生長；然而，在同一研究中過量的石墨烯對干細胞的生長和分化都是不利的，這可能是由于高含量的石墨烯所帶來的細胞毒性[31]。因此，復(fù)合材料中石墨烯毒性的劑量依賴性仍需探討。

4.3牙周組織工程的應(yīng)用 牙周病和牙外傷等引起牙周組織喪失的問題亟待解決，如何使用牙周膜細胞(periodontal ligament stem cells，PDLSCs)進行組織再生而形成相關(guān)牙周組織，是目前研究的熱點。研究表明，將PDLSCs放置GO/SF和RGO/SF復(fù)合薄膜上培養(yǎng)，細胞不僅表現(xiàn)出間充質(zhì)干細胞的多向分化功能，在無須添加成骨培養(yǎng)基或其它生長因子情況下，牙周膜干細胞更是可以向成骨細胞甚至成牙骨質(zhì)細胞自發(fā)分化[32]，提示石墨烯/SF今后將會在牙周組織再生領(lǐng)域發(fā)揮重要的作用，但目前尚缺乏相關(guān)的動物模型及臨床研究等。

綜上所述，石墨烯和SF結(jié)合后達到相輔相成的效果，不僅理化性能得到改善，能夠三維成形，還具有良好的生物相容性，促進細胞增殖、分化。這些優(yōu)越的性能必使石墨烯/SF在生物醫(yī)學(xué)和組織工程領(lǐng)域中大放異彩。然而，石墨烯/SF復(fù)合材料中石墨烯的細胞毒性仍然具有劑量和時間依賴性，如何進一步降低毒性有待研究；另外，尚需開展動物模型及臨床研究以證實該復(fù)合材料的相關(guān)應(yīng)用功效。