非小細胞肺癌中ARL4C 的表達及其在EGFR-TKI耐藥中的作用

陳增，廖錦容，蘇穎，何志勇，胡丹，林可焴，金善豐，林仁章，林賢東,4

0 引言

肺癌是常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率均居世界首位[1]。表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor,EGFR-TKI）已成為對TKI敏感的晚期非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）患者一線治療的首選用藥[2]。EGFR-TKI獲得性耐藥是導(dǎo)致NSCLC患者靶向治療失敗的重要原因之一。人EGFR T790M點突變是獲得性耐藥最常見的機制，約占50%以上，但仍有部分腫瘤出現(xiàn)耐藥的機制不明確[3]。ADP-核糖基化樣因子4C（ARL4C）也稱為Arl7，是ADP-核糖基化因子（ADP-ribosylation factor,Arf）的亞家族成員之一，在細胞內(nèi)的囊泡運輸和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中具有重要作用[4]。越來越多的研究表明，ARL4C與人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，但ARL4C在腫瘤中的作用機制仍不清楚。本研究旨在探討ARL4C在非小細胞肺癌中的表達及其與臨床病理特征的關(guān)系以及對EGFR-TKI耐藥的影響。

1 材料和方法

1.1 樣本收集、細胞和主要試劑

收集2016年1月—2018年6月于福建省腫瘤醫(yī)院進行外科手術(shù)的63例NSCLC患者的癌組織和癌旁組織，其中男34例，女29例。所有患者術(shù)前均未接受過任何治療，新鮮組織獲取后立即放入液氮，隨后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存，整個收集及保存過程均按照無酶原則操作。按照UICC/AJCC第8版肺癌TNM分期：Ⅰ期31例，Ⅱ期10例，Ⅲ期19例，Ⅳ期3例。鱗癌15例，腺癌48例。本研究經(jīng)過福建省腫瘤醫(yī)院倫理委員會批準（審批號：SQ2019-021-01），所有患者均在手術(shù)前簽署知情同意書。

人非小細胞肺癌細胞株HCC827（EGFR 19del）為厄洛替尼（Erlotinib）敏感細胞系購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心（AT C C），RPMI 1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司），胎牛血清（FBS,美國Gibco公司），Erlotinib（美國Selleck公司），RNeasy Mini Kit（德國Qiagen公司），ARL4C（英國Abcam公司），β-actin、anti-rabbit HRP-conjugated IgG antibody（美國Cell Signaling Technology公司）。RevertAid?第一鏈cDNA Synthesis試劑盒、HRP的增強型化學發(fā)光底物（美國Thermo公司）。Transwell小室（美國Millipore公司），MTS細胞活力檢測試劑盒（美國Promega公司）。ARL4C過表達慢病毒HBLV和HBLV-ARL4C（中國漢恒生物科技公司）。

1.2 EGFR基因檢測

DNA提取試劑盒購自德國Qiagen，通過石蠟包埋標本提取DNA。ARMS法擴增采用實時熒光定量PCR儀（安捷倫Mx300p）。EGFR基因檢測試劑盒均購自廈門艾德生物醫(yī)藥有限公司。所有病例檢測均有陽性質(zhì)控和陰性質(zhì)控，操作嚴格按照ARMS法試劑盒說明書進行。

1.3 細胞培養(yǎng)、TKI耐藥細胞株建立和病毒感染

將HCC827細胞培養(yǎng)于含10%FBS、100 u/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基，放置在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中，2～3 d傳代一次，采用對數(shù)生長細胞。HCC827細胞暴露于初始濃度為10 nmol/L的Erlotinib溶液中，并逐漸增加藥物濃度至1 600 nmol/L。經(jīng)過6月的篩選后撤除Erlotinib繼續(xù)培養(yǎng)2月，MTS檢測其IC50為1 843 nmol/L（為HCC827細胞的6.37倍），標記為TKI Erlotinib耐藥細胞株HCC827/ER。耐藥細胞培養(yǎng)條件：含10%FBS、100 u/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的RPMI l640培養(yǎng)基置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中，2～3 d傳代1次。HBLV和HBLV-ARL4C病毒以載體購自漢恒生物科技公司；HCC827/ER細胞以5×105個/孔接種于6孔板中，待24 h后換液，以上各病毒MOI值為10，與6 μg/ml聚凝胺混合感染細胞，48 h后，用2 μg/ml嘌呤霉素篩選細胞兩周，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的ARL4C過表達細胞株HCC827/ER/ARL4C-OE及其空載對照細胞株HCC827/ER/Vector。

1.4 實驗方法

1.4.1 MTS 法檢測細胞增殖能力及I C50將HCC8277和HCC827/ER細胞以5×103個/孔種植到96孔板中，培養(yǎng)24 h后，加含不同濃度Erlotinib（0、100、200、400、800、1 600 nmol/L）的含血清RPMI 1640培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)72 h。用20 μl MTS加100 μl含血清培養(yǎng)液，37℃孵育2 h，用僅含血清的RPMI 1640培養(yǎng)液作為背景消減，用BIO-RAD Model 680檢測490 nm的吸光度值。對加入0 nmol/L的Erlotinib對照細胞活性進行歸一化檢測，IC50值用SPSS17.0軟件進行計算。實驗重復(fù)三次。

1.4.2 實時熒光定量PCR檢測mRNA 檢測非小細胞肺癌、癌旁組織以及HCC827各實驗組細胞中ARL4C的mRNA表達水平，按照說明書用RevertAid First Strand cDNA sythesis kit將1 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。取1 μl cDNA利用Lightcycler 480 SYBR Green I Master按照說明書進行RT-qPCR，擴增程序為：95℃ 15 min；40個循環(huán)，每個循環(huán)中：95℃ 15 s;55℃ 30 s;72℃ 1 s;40℃ 1 min;GAPDH作為內(nèi)參基因。ARL4C-F-primer:5’-CTACCGGCTCAAGTTCA ACG-3’，ARL4C-R-primer:5’-CGAGTCCACCA CGTAGATGA-3’；GAPDH-F-primer:5’-CCAG AACATCATCCCTGCCT-3’，GAPDH-R-primer:CCTGCTTCACCACCTTCTTG-3’，mRNA的相對定量用2-ΔΔCt法。

1.4.3 數(shù)據(jù)分析和修正 以GAPDH為內(nèi)參基因?qū)Ω骰虮磉_進行標準化，同時以T27癌組織表達為準，即它的表達量設(shè)為1，量化其他樣本的表達量；在調(diào)整基線循環(huán)和計算閾值后，采用2-ΔΔCt法比較ARL4C的相對表達量，儀器自動根據(jù)得出的CT值（threshold cycle）運用相對定量計算公式，ΔCtpatient=CtARL4C-CtGAPDH，ΔΔCt=ΔCtpatient-ΔCt27，RQ值為2-ΔΔCt，計算得出代表相對表達量的RQ值，為了便于統(tǒng)計，把RQ值取常用對數(shù)進行分析。

1.4.4 Western blot檢測蛋白表達 將細胞冰上裂解，超聲離心后取上清液，BCA法測定蛋白濃度，并進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕法轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上。3%BSA封閉1 h后分別加入稀釋好的一抗4℃環(huán)境過夜，1×PBS洗滌4次，加入二抗封閉120 min，1×PBS洗滌3次后ECL發(fā)光試劑盒顯色，凝膠成像系統(tǒng)照相，分析灰度值。

1.4.5 Transwell侵襲實驗 把各細胞濃度調(diào)整為每毫升7×105個細胞，取100 μl接種于Transwell上室，下方用1 mg/ml的纖連蛋白進行包被，下室用含20%FBS的培養(yǎng)基作為趨化吸引條件，把小室懸掛在24孔板中。37℃孵育48 h，上室細胞用棉簽擦除，小室用甲醇固定15 min晾干，用0.1%的結(jié)晶紫進行染色。隨機選取5個視野進行觀察，倒置顯微鏡（×200）下觀察計數(shù)，以確定各組細胞的平均數(shù)。實驗重復(fù)三次。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。配對資料比較采用配對t檢驗；兩組間比較先進行正態(tài)性檢驗及方差齊性分析，再進行兩獨立樣本t檢驗。計量資料以±s表示，兩組之間均數(shù)比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 ARL4C在非小細胞肺癌及癌旁組織中的表達

非小細胞肺癌組織中ARL4C的平均相對表達量lgRQ為0.0389±0.0617，而相應(yīng)癌旁組織的相對表達量lgRQ為0.2445±0.0623，兩組間差異有統(tǒng)計學意義（P=0.0206），見圖1。

圖1 ARL4C在非小細胞肺癌及癌旁組織中的表達Figure 1 ARL4C expression in NSCLC and paracancerous tissues

2.2 ARL4C與非小細胞肺癌患者臨床病理特征的關(guān)系

結(jié)果表明，ARL4C mRNA的表達水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及肺膜侵犯密切相關(guān)（P<0.05），而與腫瘤大小、性別、年齡、腫瘤位置及組織分型無明顯相關(guān)性（P>0.05），見表1。

2.3 ARL4C與EGFR基因突變的關(guān)系

63例非小細胞肺癌中，42例進行EGFR基因突變檢測，其中EGFR基因突變組22例，EGFR野生型組20例。EGFR基因突變組，除常規(guī)突變外還包括1例T790M突變。EGFR基因突變組ARL4C mRNA的表達水平為-0.064±0.091，而EGFR野生型組表達水平為-0.0634±0.091，兩組間差異無統(tǒng)計學意義（P=0.476）。結(jié)果表明，ARL4C mRNA表達水平與EGFR的突變狀態(tài)無顯著相關(guān)性。

2.4 ARL4C在EGFR-TKI耐藥細胞株HCC827/ER中的表達

HCC827/ER細胞株中ARL4C mRNA和蛋白的表達水平分別為HCC827細胞株的0.084和0.095倍，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.0001），見圖 2。

2.5 ARL4C在HCC827/ER/Vector和HCC827/ER/ARL4C-OE細胞株中的表達

表1 ARL4C表達與非小細胞肺癌患者臨床病理特征的關(guān)系Table 1 Association between ARL4C expression and clinicopathologic features of NSCLC patients

圖2 EGFR-TKI耐藥細胞株(HCC827/ER)中ARL4C mRNA(A)及蛋白(B)的表達Figure 2 ARL4C mRNA(A) and protein(B) expression in EGFR-TKI-resistant cell line HCC827/ER

RT-qPCR和Western blot結(jié)果顯示，ARL4C在HCC827/ER/ARL4C-OE中mRNA和蛋白分別是HCC827/ER/Vector的58.28和11.89倍，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.001），見圖3。

2.6 ARL4C過表達提高耐藥株HCC827/ER的藥物敏感度

圖3 ARL4C mRNA(A)和蛋白(B)在HCC827/ER/Vector和HCC827/ER/ARL4C-OE細胞株中的表達Figure 3 ARL4C mRNA(A) and protein(B) expression in HCC827/ER/Vector and HCC827/ER/ARL4C-OE cell lines

MTS方法檢測結(jié)果顯示，HCC827/ER、HCC827/ER/Vector和HCC827/ER/ARL4C-OE細胞的IC50分別為：1 849.7、1 714.4和464.1 nmol/L；HCC827/ER/ARL4C-OE在不同濃度的Erlotinib作用下，細胞活性相比于HCC827/ER/Vector顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見圖4。

圖4 ARL4C過表達對耐藥株HCC827/ER細胞生長活性及耐藥敏感度的影響Figure 4 Effects of ARL4C overexpression on growth activity and drug resistance sensitivity of HCC827/ER cells

2.7 ARL4C過表達下調(diào)耐藥株HCC827/ER的遷移能力

結(jié)果顯示，穿過聚碳酸酯多孔濾膜的HCC827/ER、HCC827/ER/Vector和HCC827/ER/ARL4C-OE細胞數(shù)量分別為：531.7±10.33、489.7±6.360和282.0±3.786個。與HCC827/ER/Vector細胞相比，HCC827/ER/ARL4C-OE細胞的遷移能力明顯降低（P<0.0001），見圖5。

圖5 ARL4C過表達對HCC827/ER細胞遷移能力的影響Figure 5 Effects of ARL4C overexpression on migration of HCC827/ER cells

3 討論

EGFR-TKI靶向治療是肺癌精準治療的核心，能延長EGFR敏感突變非小細胞患者無進展生存期（progression free survival,PFS），改善患者生活質(zhì)量[2]。EGFR-TKI獲得性耐藥是導(dǎo)致非小細胞肺癌患者治療失敗的重要原因。因此闡明EGFR-TKI的耐藥機制、尋找新的藥物靶點、研發(fā)新的藥物成為臨床中亟待解決的問題。

目前，我們對EGFR-TKI耐藥分子機制的認知研究還處于探索階段。已有的研究報道認為可能與以下機制有關(guān)：（1）EGFR基因突變誘導(dǎo)的耐藥EGFR基因的敏感突變與耐藥突變共存，如20外顯子插入突變、T790M突變；（2）EGFR通路下游基因突變誘導(dǎo)的耐藥，如EGFRl通路下游KRAS、Braf、PIK3CA等發(fā)生突變[5-6]。據(jù)文獻報道，EGFRTKI耐藥的發(fā)生率為5%～20%，遠高于EGFR敏感突變合并上述耐藥突變的發(fā)生率，所以上述分子機制不能完全解釋EGFR-TKI耐藥的原因[7]。在前期工作中，通過分析文獻的數(shù)據(jù)庫[8]，利用生物信息手段篩查出腫瘤相關(guān)的基因ARL4C。本研究結(jié)果顯示，ARL4C不僅與非小細胞肺癌臨床病理特征密切相關(guān)，而且對EGFR-TKI耐藥有重要調(diào)控作用。

研究顯示，高表達ARL4C可以抑制卵巢癌細胞的遷移，但是對腫瘤細胞的增殖無影響，并且高表達ARL4C mRNA的卵巢癌患者具有良好的預(yù)后[4]。而關(guān)于結(jié)直腸癌和胃癌研究表明，ARL4C表達異常并參與腫瘤細胞生長和侵襲轉(zhuǎn)移[9-10]，本研究結(jié)果與前者相一致。本研究顯示，非小細胞肺癌組織ARL4C表達相比于癌旁組織下調(diào)（P<0.05）。進一步臨床病理分析表明，ARL4C mRNA表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及肺膜侵犯密切相關(guān)（P<0.05）。結(jié)果表明，ARL4C在非小細胞肺癌中有抑癌基因作用。ARL4C在不同腫瘤中作用不同，表明腫瘤異質(zhì)性的特點。

qRT-PCR和Western blot檢測結(jié)果表明，與非小細胞肺癌細胞株HCC827相比，EGFR-TKI耐藥的細胞株HCC827/ER中ARL4C表達顯著下調(diào)。MTS細胞活性檢測表明，與HCC827/ER/Vector相比，過表達ARL4C的HCC827/ER細胞株HCC827/ER/ARL4C-OEIC50由1 714.4 nmol/L下降至464.1 nmol/L。Transwell結(jié)果顯示，與HCC827/ER/Vector相比，HCC827/ER/ARL4C-OE細胞的侵襲能力明顯減弱（P<0.05）。以上結(jié)果表明，過表達ARL4C能提高非小細胞肺癌細胞對EGFR-TKI藥物的敏感度并抑制肺癌細胞的侵襲能力。

EGFR 20號外顯子T790M位的突變是產(chǎn)生TKI獲得性耐藥的重要原因之一[11-12]。EGFR基因突變狀態(tài)與ARL4C表達相關(guān)性分析顯示，ARL4C mRNA表達水平與EGFR的突變狀態(tài)無顯著相關(guān)性。本研究中有1例EGFR T790M突變，其ARL4C表達水平為-0.148，低于非小細胞肺癌平均表達水平（0.0389）。ARL4C表達是否與EGFR T790M突變相關(guān)需要進一步擴大病例數(shù)進行研究。

Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在肺癌發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[13]，它和EGFR信號通路在腫瘤發(fā)生發(fā)展中存在交叉作用。相關(guān)研究顯示，在非小細胞肺癌中，EGFR基因突變伴隨著Wnt通路負調(diào)控因子的甲基化及β-catenin的過表達[14]。另有研究表明，ARL4C是Wnt/β-catenin和生長因子Ras信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的下游靶標，并且Wnt/β-catenin/Ras/ARL4C信號軸在發(fā)育性小管生成和腫瘤發(fā)生中均起著重要作用[4]。我們猜測，Wnt/β-catenin/Ras/ARL4C信號軸可能參與非小細胞肺癌EGFR-TKI的耐藥。

綜上所述，ARL4C在非小細胞肺癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，并且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期和肺膜侵犯密切相關(guān)。過表達ARL4C能提高非小細胞肺癌耐藥細胞HCC827/ER對EGFRTKI藥物的敏感度并抑制非小細胞肺癌細胞的侵襲能力。ARL4C的表達可考慮作為判斷非小細胞肺癌惡性程度及EGFR-TKI敏感度的重要標志物。