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    miR-144在人牙周膜成纖維細(xì)胞中調(diào)控Toll樣受體2及骨唾液酸蛋白的表達(dá)

    2020-08-14 13:47:58李新月
    口腔醫(yī)學(xué) 2020年7期
    關(guān)鍵詞:水平研究

    魏 蓉,張 源,李新月

    牙周炎是一種發(fā)生于牙齒支持組織、病因復(fù)雜的慢性感染性疾病,在其始動因子牙菌斑生物膜作用下激活機(jī)體免疫炎癥反應(yīng),最終導(dǎo)致牙周組織破壞,其表現(xiàn)之一便是牙槽骨吸收,是成年人失牙的主要原因[1]。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是P.gingivalis的毒力因子之一[2],并與牙槽骨吸收密切相關(guān)[3]。LPS除直接破壞牙周支持組織外,還可引發(fā)宿主免疫炎癥反應(yīng),激活機(jī)體免疫應(yīng)答機(jī)制[4]。Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)作為固有免疫應(yīng)答的重要防線,在牙周炎發(fā)生發(fā)展中起到了重要的防御作用[5]。LPS可作為TLRs的配體與其結(jié)合后在牙周炎中發(fā)揮重要作用[6]。骨唾液酸蛋白(bone sialoprotein,BSP)是一種高度糖基化、磷酸化的糖蛋白,能夠在骨細(xì)胞外基質(zhì)沉積,并能促進(jìn)羥基磷灰石成核,對于成骨細(xì)胞分化、骨基質(zhì)礦化都具有重要意義,并且在骨、牙骨質(zhì)、牙本質(zhì)的初始礦化中具有潛在作用[7]。LPS能夠在hPDLFs中引起B(yǎng)SP下調(diào),與牙槽骨代謝息息相關(guān)[8]。

    miRNA是一組廣泛存在于真核生物體內(nèi)的單鏈非編碼RNA,長度約22個核苷酸,通過完全或不完全的堿基互補(bǔ)配對原則,與特定mRNA的3′UTR或5′UTR結(jié)合后降解mRNA或抑制其翻譯進(jìn)而抑制蛋白表達(dá),在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)[9]。它能夠參與調(diào)控免應(yīng)答反應(yīng)[10-11],在牙周炎中也起到了重要的調(diào)控作用[12]。因此,本研究篩選TLR2具有負(fù)性調(diào)控關(guān)系的miRNA,進(jìn)而研究LPS介導(dǎo)下hPDLFs中miRNA與TLR2及miRNA與BSP的作用關(guān)系,初步探究miRNA在牙周炎骨代謝過程中的作用機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 主要試劑與材料

    DMEM培養(yǎng)基(GIBCO BRL,美國)、胰蛋白酶(GIBCO BRL,美國)、胎牛血清(GIBCOBRL,美國)、Trizol試劑(Invitrogen,美國)、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(Takara,日本)、RNA酶抑制劑(Takara,日本)、dNTP(10 mmol/L)(Takara,日本)、SYBRPremix ExTaq試劑盒(TaKaRa, 日本)、CG-02/05實時熒光定量PCR儀(HealForce,中國)、正常熔點/低熔點的瓊脂糖凝膠(GIBCO,美國)、CO2恒溫培養(yǎng)箱(Thermo Forma,美國)、超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司)、P.gingivalisLPS(InvivoGene,美國)、HiScript Ⅱ Q RT SuperMix forqPCR(+gDNAwiper)(諾唯贊生物,中國)、DYCP-31BM型水平電泳裝置(北京市六一儀器廠)、LabWorksTM凝膠成像及分析系統(tǒng)(UVP, 美國)、TS-1型搖床(江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司)。

    1.2 方法

    1.2.1 目標(biāo)miRNA的篩選 用生物信息學(xué)技術(shù)篩選與TLR2具有靶向結(jié)合關(guān)系的miRNA:用TargetScan、MiRanda、PicTar4、RNAhybrid數(shù)據(jù)庫查找和篩選TLR2基因(物種為人)的3′UTR序列,并結(jié)合已報道文獻(xiàn)中通過luciferase檢測證明與TLR2具有靶向作用位點并具有負(fù)性調(diào)控關(guān)系的miRNA作為研究對象,得到miR-23a、miR-144、miR-19a作為目標(biāo)miRNA[13-16]。

    1.2.2 hPDLFs的培養(yǎng)及處理 取因正畸拔除的前磨牙(已通過天津市口腔醫(yī)院倫理審查)根中1/3牙周膜組織剪碎成 1 mm3小組織塊,移植至24孔板,用含 10% FBS、1%雙抗的 DMEM 培養(yǎng)液,置 37 ℃含 5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行原代培養(yǎng)。待hPDLFs完全融合后按1∶3比例傳代。待第3代細(xì)胞貼壁后,用PBS漂洗1次,換為礦化誘導(dǎo)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)(礦化誘導(dǎo)培養(yǎng)基:去酚紅 DMEM,10%FBS,1×10-8mol/L 地塞米松,10 mmol/L β-甘油磷酸鈉,50 μg/mL抗壞血酸),使其骨向分化,隔3 d換1次培養(yǎng)液,長滿后傳代。接種至6孔板,待90%融合后更換不含血清的礦化誘導(dǎo)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12 h,用無血清DMEM配置的濃度為10 mg/LP.gingivalisLPS處理培養(yǎng)8 h后,收集細(xì)胞。

    1.2.3 hPDLFs中miRNA及TLR2的mRNA表達(dá)水平檢測 用Trizol試劑按其說明分別提取各組hPDLFs中的總RNA 1 μL,按M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶及HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)要求逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA(逆轉(zhuǎn)錄序列見表1)及擴(kuò)增,以U6為內(nèi)參,引物序列由天津賽爾生物技術(shù)有限公司設(shè)計(引物序列見表2),實時熒光定量法測定miRNA的mRNA表達(dá)水平,同時測定TLR2的mRNA表達(dá)水平(以β-actin為內(nèi)參)。反應(yīng)條件為94 ℃ 4 min, 94 ℃ 30 s、56 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s 40個循環(huán)。用相對定量公式2-ΔΔCt(分別計算待測基因與內(nèi)參的Ct平均值,兩者之差為ΔCt,實驗組與對照組之間為ΔΔCt)對結(jié)果進(jìn)行檢測,同樣的實驗重復(fù)3次。選擇與TLR2呈負(fù)性表達(dá)關(guān)系的miR-144作為進(jìn)一步研究對象。

    表1 制備cDNA的RT序列

    表2 熒光定量PCR引物序列

    1.2.4 hPDLFs的轉(zhuǎn)染 按1.2.2繼續(xù)培養(yǎng)hPDLFs,轉(zhuǎn)染前1 d用含有10%FBS的 DMEM礦化誘導(dǎo)培養(yǎng)液終止消化并吹打混勻細(xì)胞,將細(xì)胞接種至6孔板中,置 37 ℃含 5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 18~24 h,使次日轉(zhuǎn)染時細(xì)胞達(dá)到 70%~80%板底面積。分別用無血清培養(yǎng)基3 μL稀釋(1)空白對照組、(2)陰性對照組(LPS組)、(3)miRNA過表達(dá)對照組(LPS+miRNA-144 mimics control組)、(4)miRNA過表達(dá)組(LPS+miR-144 mimics組)、(5)miRNA抑制對照組(LPS+miRNA-144 ASO NC組)、(6)miRNA抑制組(LPS+miR-144 ASO組),終量50 μL,分別加入50 μL脂質(zhì)體Lipofectamine 2000混勻制成轉(zhuǎn)染液,加入對應(yīng)孔中,100 μL/孔。每孔滴加300 μL Opti-MEM,常規(guī)培養(yǎng)4 h后每孔換為10%FBS礦化誘導(dǎo)培養(yǎng)液3 mL,繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后48 h,將(2)~(6)共5組hPDLFs加入用無血清 DMEM配制的終濃度為 10 mg/LP.gingivalisLPS刺激8 h,空白對照組(1)更換為不含血清的礦化誘導(dǎo)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)8 h,收集細(xì)胞,提取 RNA和裂蛋白。

    1.2.5 Real-time PCR法檢測BSP及TLR2的mRNA表達(dá)水平 各組樣本細(xì)胞長滿后用Trizol試劑提取總RNA,實時熒光定量法測定TLR2及BSP的mRNA表達(dá)水平,實驗方法同1.2.3。

    1.2.6 Western Blot檢測BSP及TLR2的蛋白表達(dá)水平 收集1.2.4中各組樣本提取總蛋白,各組取40 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)移蛋白至PADF膜上形成印跡,室溫下脫脂奶粉封閉2 h,4 ℃下與一抗結(jié)合搖床過夜,浸洗后與二抗結(jié)合1.5 h浸洗顯影,曝光顯影并進(jìn)行定影處理。膠片用LabWorksTM凝膠成像及分析系統(tǒng)進(jìn)行攝像,分析各組蛋白條帶的亮度值,與對應(yīng)GAPDH(內(nèi)參照)條帶亮度值相比,得到校正后的各組蛋白的條帶亮度值,實驗重復(fù)3次取平均值,并繪制柱狀圖。

    1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

    使用SPSS 20.0對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,數(shù)據(jù)均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組間均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗,多組間比較采用單因素方差分析,檢驗水準(zhǔn)α=0.05,以P<0.05表示有統(tǒng)計學(xué)差異。繪圖由Graphpad Prism 7.0軟件完成。

    2 結(jié) 果

    2.1 hPDLFs體外培養(yǎng)

    牙周膜組織塊接種后3~6 d可見細(xì)胞游離出來,但尚不能分辨細(xì)胞結(jié)構(gòu);接種20 d后,可見大量成纖維細(xì)胞向四周呈放射狀生長;傳代后細(xì)胞呈放射狀或旋渦狀生長,形態(tài)與原代相同:鏡下呈長梭形,胞體豐滿,胞質(zhì)均勻,細(xì)胞透明度大,細(xì)胞核圓形或卵圓形,核仁清晰(圖1)。

    圖1 第4代hPDLFs(倒置顯微鏡 ×40)

    2.2 P.gingivalis LPS上調(diào)hPDLFs中TLR2的表達(dá)水平

    實時熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示,hPDLFs經(jīng)10 mg/LP.gingivalisLPS刺激8 h后,TLR2的mRNA表達(dá)水平明顯上調(diào)約13.6倍,且其上調(diào)水平與正常組相比具有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.000,圖2)。

    實時熒光定量PCR法檢測TLR2的mRNA表達(dá)水平,與對照組相比,*:P<0.05

    2.3 目標(biāo)miRNA在正常及LPS誘導(dǎo)hPDLFs中的表達(dá)

    實時熒光定量PCR顯示,正常hPDLFs中有miR-19a、miR-23a、miR-144表達(dá),10 mg/L LPS刺激hPDLFs 8 h后,miR-19a、miR-23a表達(dá)水平上調(diào),其中miR-19a上調(diào)約2.6倍,miR-23上調(diào)約1.8倍;而miR-144表達(dá)水平下調(diào)約6/100。其中上調(diào)的miR-19a、下調(diào)的miR-144與正常組對照均具有統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.002,P=0.000,圖3)。選擇表達(dá)水平下調(diào)的miR-144作為進(jìn)一步研究對象。

    實時熒光定量PCR法檢測miRNA的mRNA表達(dá)水平,與對照組相比,*:P<0.05

    2.4 miR-144對hPDLFs在LPS誘導(dǎo)下TLR2表達(dá)水平的影響

    miRNA-144 過表達(dá)對照組、miR-144過表達(dá)組、miR-144抑制對照組、miR-144抑制組分別體外轉(zhuǎn)染礦化誘導(dǎo)的hPDLFs,并經(jīng)10 mg/L LPS誘導(dǎo)8 h,與空白對照組和單純LPS刺激組比較TRL2的mRNA及蛋白表達(dá)水平,PCR結(jié)果顯示:與空白對照組相比,10 mg/L LPS誘導(dǎo)能明顯激活hPDLFs中TLR2的表達(dá)(P=0.007);miR-144過表達(dá)組TLR2的mRNA表達(dá)水平明顯低于miR-144過表達(dá)對照組(P=0.002)和陰性對照組(P=0.007),過表達(dá)miR-144明顯降低LPS對TLR2 mRNA表達(dá)的激活作用;miR-144抑制組TLR2的mRNA表達(dá)水平明顯高于抑制miR-144組(P=0.012)和陰性對照組(P=0.017),miR-144明顯上調(diào)TLR2的mRNA表達(dá)水平,與LPS具有協(xié)同作用(圖4A)。Western Blot結(jié)果顯示:過表達(dá)miR-144可以降低LPS誘導(dǎo)的TLR2的蛋白表達(dá)水平,抑制miR-144可以進(jìn)一步升高LPS誘導(dǎo)的TLR2的蛋白表達(dá)水平(圖4B);每組對應(yīng)蛋白條帶見圖4C。

    A:實時熒光定量PCR檢測TLR2的mRNA表達(dá)水平;B:WesternBlot檢測TLR2的蛋白表達(dá)水平;*:P<0.05;C:分別對應(yīng)圖4B分組的蛋白條帶

    2.5 miR-144對hPDLFs在LPS誘導(dǎo)下BSP表達(dá)水平的影響

    miRNA-144過表達(dá)對照組、miR-144過表達(dá)組、miR-144抑制對照組、miR-144抑制組分別體外轉(zhuǎn)染礦化誘導(dǎo)的hPDLFs,并經(jīng)10 mg/L LPS誘導(dǎo)8 h,與空白對照組和陰性對照組比較BSP的mRNA及蛋白表達(dá)水平,PCR結(jié)果顯示:與空白對照組相比,10 mg/L LPS能明顯下調(diào)hPDLFs中BSP的mRNA表達(dá)(P=0.016);miR-144過表達(dá)組BSP的mRNA表達(dá)水平明顯高于miR-144過表達(dá)對照組(P=0.022)和LPS組(P=0.018),miR-144明顯抵消LPS對BSPmRNA表達(dá)的抑制作用;miR-144抑制組BSP的mRNA表達(dá)水平明顯低于miR-144抑制對照組(P=0.005)和LPS組(P=0.021),抑制miR-144明顯下調(diào)BSP的mRNA表達(dá)水平,與LPS具有協(xié)同作用(圖5A)。Western Blot結(jié)果顯示:過表達(dá)miR-144可以上調(diào)LPS抑制BSP蛋白表達(dá),抑制miR-144可以進(jìn)一步下調(diào)LPS抑制BSP蛋白表達(dá)(圖5B);每組對應(yīng)蛋白條帶見圖5C。

    A:為實時熒光定量PCR檢測BSP的mRNA表達(dá)水平;B:為Western Blot檢測BSP的蛋白表達(dá)水平;與對照組相比,*:P<0.05;與陰性對照組(單純LPS刺激)相比,*:P<0.05;C:為分別對應(yīng)圖5B分組的蛋白條帶

    3 討 論

    牙周炎會引起牙周軟組織炎癥、牙槽骨吸收,研究發(fā)現(xiàn)在炎性牙周組織中TLR2高表達(dá)并在牙周炎發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。研究發(fā)現(xiàn),相較于健康人群,牙周炎患者牙齦組織中TLR2高表達(dá)[17]。革蘭陰性菌感染時,其主要抗原成分LPS可與細(xì)胞表面受體TLR2/4結(jié)合,通過轉(zhuǎn)導(dǎo)外界刺激激活細(xì)胞內(nèi)信號通路,造成牙周組織的破壞[18],TLR2作為LPS的關(guān)鍵受體,同時作為固有免疫應(yīng)答的重要組成部分,在其中發(fā)揮了重要作用。在P.gingivalisLPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞牙周炎模型中也發(fā)現(xiàn)TLR2表達(dá)水平升高[19]。我們的研究發(fā)現(xiàn)hPDLFs經(jīng)LPS刺激后,TLR2同樣被激活,與以往研究結(jié)果一致。P.gingivalisLPS可以通過TLR2促進(jìn)IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10[20-22]等促炎因子釋放。此外,LPS還能通過TLR2影響牙槽骨吸收,P.gingivalisLPS可通過TLR2引起骨代謝的重要角色——NF-κB配體激活受體(receptor of activator of NF-κB ligand,RANKL)表達(dá)變化介導(dǎo)牙槽骨吸收[23]。

    牙周炎相關(guān)miRNA研究發(fā)現(xiàn)miRNA在炎性及健康牙周組織中異常表達(dá)[24],且能影響下游炎性因子的表達(dá)并參與調(diào)控牙槽骨代謝[25-26]。我們通過生物信息學(xué)技術(shù)及文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)miR-144與TLR2間具有靶向結(jié)合位點,且有研究證明在大鼠模型中TLR2與miR-144二者呈負(fù)性作用關(guān)系[14]。因此本研究篩選miR-144為研究對象,發(fā)現(xiàn)LPS刺激hPDLFs后,TLR2表達(dá)水平升高的同時miR-144表達(dá)水平降低。但是另有研究發(fā)現(xiàn),相較于正常組織,miR-144在牙周炎性組織中呈高表達(dá)[27-28],與本研究結(jié)果存在差異。分析此差異的原因,可能是在牙周炎環(huán)境中作為機(jī)體自我保護(hù)反應(yīng)性高表達(dá)miR-144,在miR-144上游或許存在更為復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制,而非單純LPS刺激hPDLFs的細(xì)胞模型的單一環(huán)境。本研究亦發(fā)現(xiàn)miR-144在hPDLFs中抑制TLR2表達(dá)水平,能夠部分抵消LPS對TLR2的激活作用,從而證明了miR-144與TLR2的負(fù)向作用關(guān)系。

    牙周炎相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)BSP在保持正常的牙周組織功能、牙槽骨重建中具有重要作用[29]。有研究發(fā)現(xiàn),LPS刺激人牙周膜成纖維細(xì)胞后BSP的基因表達(dá)水平下調(diào),其成骨能力被削弱[30]。在我們的前期研究中取得類似結(jié)果,發(fā)現(xiàn)在hPDLFs中LPS對BSP的下調(diào)作用是通過TLR2及信號通路介導(dǎo)實現(xiàn)的[8]。在本研究中發(fā)現(xiàn),miR-144在抑制TLR2表達(dá)的同時上調(diào)BSP的表達(dá),抵消LPS對BSP的抑制作用。進(jìn)一步證明在LPS誘導(dǎo)的牙周炎中,miR-144具有與TLR2的負(fù)向作用,且促進(jìn)了成骨蛋白BSP的表達(dá)。miRNA對BSP的調(diào)控作用的研究目前少有報道,其作用機(jī)制也尚不明了。因此miR-144對BSP的調(diào)控是否是通過TLR2介導(dǎo)的這一作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

    綜上,本研究證明了在hPDLFs中,miR-144能夠負(fù)性調(diào)控TLR2并與BSP表達(dá)呈正相關(guān)性,與LPS具有反向作用,在抑制牙周炎癥反應(yīng)、促進(jìn)成骨方面可能具有積極作用,能夠為牙周炎骨代謝的基因?qū)W治療提供研究思路和實驗依據(jù),為其今后的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

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