新疆阿克蘇地區(qū)結(jié)核分枝桿菌的基因分型與耐藥性分析

劉丙雨，賈鵬霞，李新月，張萬江，程 江，吳江東，馬雅靜，2

(1.石河子大學(xué)新疆地方病與民族高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子 832000；2.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，新疆 石河子 832000)

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌感染人體導(dǎo)致的一種慢性傳染性疾病。根據(jù)WHO報(bào)告顯示，2018年世界新發(fā)結(jié)核病例約有1 000萬例，我國是全球30個(gè)高負(fù)擔(dān)國家之一[1]。新疆一直是全國結(jié)核病高發(fā)地區(qū)，呈現(xiàn)出高感染、高發(fā)病、農(nóng)村高疫情、年遞減率低的“三高一低”特點(diǎn)[2-3]。王希江等對(duì)全疆96個(gè)縣市進(jìn)行時(shí)空聚集性掃描，發(fā)現(xiàn)阿克蘇地區(qū)、喀什地區(qū)、和田地區(qū)等地區(qū)聚集性分布最強(qiáng)[4]。本研究以MIRU-VNTR為基礎(chǔ)，采用Luo等建立的12位點(diǎn)基因分型方法[5]，對(duì)阿克蘇市及周邊8縣地區(qū)的痰涂片陽性的結(jié)核病患者分離培養(yǎng)得到的結(jié)核桿菌進(jìn)行基因分型，并采用比例法對(duì)一線抗結(jié)核藥進(jìn)行藥物敏感試驗(yàn)，了解該地區(qū)結(jié)核菌株基因分型和耐藥性及主要傳播方式，為結(jié)核病預(yù)防及治療提供導(dǎo)向。

1 資料與方法

1.1菌株來源：收集2018年9月～2019年10月新疆阿克蘇地區(qū)第二人民醫(yī)院痰涂片陽性的維吾爾族結(jié)核病患者經(jīng)臨床分離培養(yǎng)得到的結(jié)核桿菌186株，結(jié)核桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37RV購自國家結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室。所有菌株-80℃保存。本次研究經(jīng)過本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)同意。

1.2主要方法

1.2.1藥敏試驗(yàn)：按照《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[6]進(jìn)行藥物敏感試驗(yàn)。采用比例法進(jìn)行藥物敏感試驗(yàn)，終濃度分別異煙肼0.2 μg/ml、利福平40.0 μg/ml、乙胺丁醇2.0 μg/ml、鏈霉素4.0 μg/ml。耐藥百分比=(含藥培養(yǎng)基的菌落數(shù)/陰性對(duì)照培養(yǎng)基的菌落數(shù))×100%。耐藥百分比>1%，表示對(duì)該藥耐藥；≤1%，表示敏感。

1.2.2結(jié)核桿菌DNA提?。河媒臃N環(huán)從羅氏培養(yǎng)基中挑2滿環(huán)結(jié)核分枝桿菌，置于含200 μl生理鹽水的EP管中，金屬浴100℃,60 min后取出，置于冰上5 min，13 000×g,離心15 min，取上清液于1.5 mlEP管中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3基因分型：采用Luo提出的符合我國國情的12位點(diǎn)分型方法[5]，分別是QUB11b、QUB18、QUB26、MIRU26、MIRU31、MIRU40、Mtub21、Mtub04、VNTR2372、VNTR3820、VNTR4120、VNTR3232。采用RD105缺失基因檢測(cè)北京型與非北京型，使用北京康為世紀(jì)公司生產(chǎn)的TB基因分型試劑盒，PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件及結(jié)果判讀參照說明書。

相關(guān)定義如下:①簇：不同菌株基因型相同數(shù)≥8個(gè)定義為一簇，表示可能與近期傳播有關(guān)聯(lián)；獨(dú)特基因型為單一基因型，表示該病例可能是內(nèi)源性復(fù)燃而得病[8]。②耐藥結(jié)核桿菌：患者體內(nèi)感染的結(jié)核桿菌對(duì)任意一種抗結(jié)核藥物產(chǎn)生耐藥。耐多藥結(jié)核桿菌：結(jié)核患者感染的結(jié)核分枝桿菌至少同時(shí)對(duì)異煙肼和利福平產(chǎn)生的耐藥。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法；以是否成簇為因變量，成簇定義為1，非成簇定義為0，患者信息為自變量，采用多因素Logistic回歸分析，Bio Numerics7.0軟件進(jìn)行聚類分析。所有檢驗(yàn)都為雙側(cè)檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1藥敏試驗(yàn)結(jié)果：186株結(jié)核桿菌總耐藥率為34.9%(65/186)，耐多藥率28%(52/186)。初治患者耐藥率明顯低于復(fù)治患者耐藥率，初治患者耐多藥率明顯低于復(fù)治患者耐多藥率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 藥敏試驗(yàn)結(jié)果比較[例(%)]

2.2基因分型與耐藥性相關(guān)分析

2.2.1北京型與非北京基因型：北京基因型和非北京基因型在耐藥性方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 基因分型與耐藥結(jié)果相關(guān)分析[例(%)]

2.2.2基因多態(tài)性及分型結(jié)果比較：采用12位點(diǎn)基因分型方法，分析不同位點(diǎn)基因多態(tài)性(HGDI)，總分辨率0.998，其中VNTR3820位點(diǎn)分辨率最高(0.913)，MIRU40位點(diǎn)分辨率最低(0.587)。186株分型結(jié)果及聚類分析樹狀圖見圖1所示。共產(chǎn)生156種基因型，其中獨(dú)特基因型129種，余成27簇，每簇2～3株，共57株，成簇率16.1%。

圖1 結(jié)核分枝桿菌MIRU-VNTR基因分型聚類分析樹狀圖

2.2.3菌株成簇(近期傳播)的影響因素分析：經(jīng)單因素分析發(fā)現(xiàn)菌株成簇在年齡、職業(yè)、治療史、耐藥、耐多藥等方面的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在性別、吸煙史、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、營養(yǎng)不良史、文化程度、家庭年收入等方面差異無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。將菌株分型結(jié)果是否成簇當(dāng)作因變量，成簇是1，非成簇是2。將年齡、職業(yè)、治療史、耐藥、耐多藥等可能的危險(xiǎn)因素作為自變量納入多因素Logistic回歸模型，使用ENTER法分析。結(jié)果顯示耐多藥(OR=12.328，95%CI:5.235～16.875)和治療史(OR=5.718,95%CI:2.914～11.217)是影響患者成簇的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，相比敏感菌株，耐多藥和復(fù)治患者更容易成簇即耐多藥和復(fù)治是近期傳播的危險(xiǎn)因素。見表3。

表3 肺結(jié)核患者基因分型與病人臨床資料的影響因素分析[例(%)]

3 討論

不同地區(qū)結(jié)核桿菌基因分型及表型耐藥狀況有所不同[9]。本研究發(fā)現(xiàn)阿克蘇地區(qū)菌株成簇率16.1%，成簇提示患者近期可能被同一傳染源感染，說明近期傳播在該地區(qū)結(jié)核病的流行中占有一定比例。

結(jié)核桿菌在不同省份的分子流行病學(xué)研究顯示北京基因型占主導(dǎo)地位，但是否與耐藥性相關(guān)尚不明確；阿克蘇地區(qū)也以北京基因型為主，二者于耐藥性上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明該地區(qū)北京型與耐藥性無明顯相關(guān)性。此研究結(jié)果與北疆地區(qū)[10]、北京地區(qū)[11]、陜西地區(qū)[12]等研究結(jié)果一致；不同地區(qū)結(jié)核桿菌的耐藥性呈現(xiàn)多樣性，藥敏實(shí)驗(yàn)顯示本地區(qū)總耐藥率34.9%，低于北疆地區(qū)[11](40.35%)，基本和邢臺(tái)地區(qū)[13](31.6%)一致。

耐藥是目前治療結(jié)核病的一大棘手問題，結(jié)合本文研究結(jié)果得出耐藥菌株有可能較非耐藥菌株傾向于近期傳播；分析基因型與病例相關(guān)資料發(fā)現(xiàn)，在阿克蘇結(jié)核病患者中，男女比例1.19∶1，與HortonKC等調(diào)查結(jié)果[14]相符。年齡以60歲以上為主，職業(yè)以農(nóng)民為主，與郝艷艷[15]、王希江[4]、王玥[16]等研究結(jié)果一致。影響結(jié)核桿菌成簇的危險(xiǎn)因素，不同地區(qū)研究結(jié)果略有差異[9,17]。本研究得出復(fù)治和耐多藥是影響結(jié)核桿菌成簇的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，因此，加強(qiáng)復(fù)治患者健康教育的同時(shí)，注重強(qiáng)調(diào)服藥督導(dǎo)的重要性，在加強(qiáng)本地區(qū)結(jié)核病的耐藥篩查的同時(shí)，注重MDR-TB患者的早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療，從而最大限度減少耐多藥結(jié)核桿菌的產(chǎn)生和傳播。新疆一直是我國結(jié)核病高發(fā)地區(qū)，阿克蘇及周邊地區(qū)是新疆結(jié)核病高發(fā)的時(shí)空聚集地區(qū)之一，從分子流行病學(xué)角度了解本地區(qū)結(jié)核桿菌成簇情況及影響因素，為結(jié)核病的防控提供更多有價(jià)值的信息。