基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接探討血必凈注射液治療新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)的作用機(jī)制

鄭 雅,劉志強(qiáng),朱曉芹,王博龍*

(1.宜春學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院,江西 宜春 336000； 2.鶴壁職業(yè)技術(shù)學(xué)院,河南 鶴壁 458030)

自2019 年12 月以來(lái),出現(xiàn)多起由于感染新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)而引起的新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)病例[1-2]。 SARS-CoV-2 具有傳播迅速、傳染性強(qiáng)、各類(lèi)人群普遍易感的特征。 截止2020 年6 月9 日13 時(shí)09 分,我國(guó)累計(jì)確診患者84636 例,死亡病例4645 例；境外累計(jì)確診患者7116552 例,死亡病例404157 例。 特別是近期美國(guó)、巴西、俄羅斯、西班牙、英國(guó)、意大利、法國(guó)等多個(gè)國(guó)家的激增態(tài)勢(shì),COVID-19 的防控現(xiàn)已成為全球挑戰(zhàn),尋找COVID-19 防治藥物迫在眉睫。

由于SARS-CoV-2 是一種先前未在人類(lèi)發(fā)現(xiàn)的β 屬新型冠狀病毒,目前沒(méi)有特效治療藥物[3]。 我國(guó)專(zhuān)家及時(shí)分析評(píng)價(jià)前期治療措施,不斷更新COVID-19 的診療方案,為后續(xù)治療提供指導(dǎo)。 《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案》(試行第五版)于2020 年2 月4 日,由國(guó)家衛(wèi)生健康委及中醫(yī)藥管理局發(fā)布,并首次增加了血必凈注射液等解毒類(lèi)中成藥[4],這說(shuō)明血必凈注射液治療COVID-19 確有療效,但其治療機(jī)理并不清楚。 本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法,聯(lián)合數(shù)挖掘、分子對(duì)接等技術(shù)手段解析血必凈治療COVID-19 的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 血必凈主要成分及靶點(diǎn)篩選

本研究基于文獻(xiàn)挖掘確定血必凈注射液主要成分,借助TCMSP(http:/ /lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php) 數(shù)據(jù)庫(kù)收集主要成分靶點(diǎn), 利用ChemicaoBook 數(shù)據(jù)庫(kù)(https:/ /www.chemicalbook.com/ProductIndex.aspx)查找主要成分分子結(jié)構(gòu)式,保存 mol 格式文件后導(dǎo)入 Swiss Target Prediction(http:/ /www.swisstargetprediction.ch)數(shù)據(jù)庫(kù),利用相似性靶點(diǎn)搜尋方法查找靶點(diǎn)。 運(yùn)用UniProt 數(shù)據(jù)庫(kù)(http:/ /www.uniprot.org/)將靶點(diǎn)轉(zhuǎn)換成為相應(yīng)的基因名稱(chēng),將檢索出的基因合并后匯總,再運(yùn)用Gephi 0.9.2 軟件構(gòu)建血必凈成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。

1.2 血必凈治療COVID-19 靶點(diǎn)的確定

以“ Corona Virus Disease 2019 ”、 “ Novel coronavirus pneumonia” 為 關(guān) 鍵 詞, 在 GeneCards(https:/ /www.genecards.org) 數(shù)據(jù)庫(kù)中收集與COVID-19 相關(guān)的作用靶點(diǎn)合并后篩重,將血必凈靶點(diǎn)與COVID-19 靶點(diǎn)相映射,得到血必凈治療COVID-19 的作用靶點(diǎn),并繪制韋恩圖。

1.3 血必凈治療COVID-19 靶點(diǎn)的器官定位

利用BioGPS((http:/ /biogps.org)對(duì)血必凈治療COVID-19 靶點(diǎn)進(jìn)行器官組織定位分析,以高于平均水平確定該靶點(diǎn)所定位的器官或組織,并構(gòu)建靶點(diǎn)-器官組織定位圖。

1.4 關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選

在STRING 平臺(tái)(https:/ /string-db.org/)導(dǎo)入血必凈靶點(diǎn)并構(gòu)建靶點(diǎn)群蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)(proteinprotein interaction network,PPI network),物種設(shè)置為“Homo sapiens” (智 人), 結(jié) 果 保 存 后 導(dǎo) 入Cytoscape3.7.0 中分析并篩選關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.5 關(guān)鍵靶點(diǎn)基因本體GO 與KEGG 信號(hào)通路富集分析

分別運(yùn)用 Omicshare 平臺(tái)( http:/ /www.omicshare.com/tools/index.php/)和DAVID v 6.8 平臺(tái)(https:/ /david.ncifcrf.gov)對(duì)血必凈關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO 功能富集與KEGG 信號(hào)通路富集,并利用Omicshare 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行富集點(diǎn)狀圖繪制。

1.6 成分-靶點(diǎn)分子對(duì)接

從TCMSP 網(wǎng)站搜索血必凈主要成分結(jié)構(gòu)式,從PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)(http:/ /www.rcsb.org/) 下載SARSCoV-2 病毒的3CL 水解酶及其人體受體血管緊張素轉(zhuǎn)化酶II(ACE2)蛋白結(jié)構(gòu),運(yùn)用Mgltools1.5.6 軟件進(jìn)行加氫、計(jì)算電荷等處理后,保存為pdbqt 文件。定義SARS-CoV-2 和ACE2 天然結(jié)合配體作為活性口袋,使用Autodock Vina 1.1.2 進(jìn)行分子對(duì)接,取結(jié)合能最小的分子用Pymol 和Maestro 11.9 繪制分子對(duì)接圖。

2 結(jié)果

2.1 血必凈主要成分及主要成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

查閱文獻(xiàn)[5-12]發(fā)現(xiàn)血必凈主要成分有阿魏酸、苯甲酰芍藥苷、丹參素、丹酚酸A、芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、洋川芎內(nèi)酯I、原兒茶醛、原兒茶酸等22 種,詳見(jiàn)表1。 在TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)和SwissTarget Prediction 服務(wù)器中獲取22 種主要成分靶點(diǎn)數(shù)據(jù),將數(shù)據(jù)合并、刪重后得到血必凈22 種主要成分作用于370 個(gè)靶點(diǎn),見(jiàn)圖1。

2.2 血必凈治療COVID-19 靶點(diǎn)的獲取與收集

通過(guò)GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)獲得與COVID-19 相關(guān)的靶點(diǎn)數(shù)目272 個(gè),與血必凈預(yù)測(cè)靶點(diǎn)相映射并繪制韋恩圖,如圖2 所示,相交集的54 個(gè)靶點(diǎn)即為血必凈治療COVID-19 的潛在靶點(diǎn)。

2.3 血必凈治療COVID-19 靶點(diǎn)的器官定位

為明確血必凈作用的主要靶器官,將血必凈治療COVID-19 的54 個(gè)靶點(diǎn)導(dǎo)入BioGPS 數(shù)據(jù)庫(kù),以高于平均水平作為基因定位于某器官或組織的標(biāo)準(zhǔn),由圖3 可見(jiàn),血必凈54 個(gè)靶點(diǎn)中有47 個(gè)靶點(diǎn)位于肺,49 個(gè)靶點(diǎn)位于心臟,49 個(gè)靶點(diǎn)位于肝,47 個(gè)靶點(diǎn)位于全血,33 個(gè)靶點(diǎn)位于結(jié)腸,24 個(gè)靶點(diǎn)定位于小腸,12 個(gè)靶點(diǎn)位于氣管,11 個(gè)靶點(diǎn)位于腎,8 個(gè)靶點(diǎn)位于胰腺。

2.4 血必凈靶點(diǎn)關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選

將血必凈54 個(gè)靶點(diǎn)輸入STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建基因關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò),如圖4 所示,共有54 個(gè)節(jié)點(diǎn)、519 條相互作用連線構(gòu)成關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)。 圖中節(jié)點(diǎn)的大小代表度值(Degree)大小,節(jié)點(diǎn)越大代表度值越大；節(jié)點(diǎn)邊的粗細(xì)和顏色代表介數(shù)(Betweenness)大小,節(jié)點(diǎn)邊越粗且顏色越深代表介數(shù)越大。 PPI 關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)的平均度值為19.22,平均介數(shù)為1.28×10-2,平均最短距離(Closeness)為6.13×10-1,取均在平均值以上的14 個(gè)基因作為血必凈治療COVID-19 的關(guān)鍵靶點(diǎn),詳見(jiàn)表2。

表1 血必凈主要成分基本信息Table 1 Basic information on the main components of Xuebijing

圖1 血必凈主要成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)Figure 1 Xuebijing injection main ingredients - targets network

圖2 血必凈治療COVID-19 的靶點(diǎn)維恩圖Figure 2 Venn diagram of targets in the treatment of COVID-19 with xuebijing injection

2.5 血必凈關(guān)鍵靶點(diǎn)GO 功能富集分析

利用OmicShare 云平臺(tái)對(duì)14 個(gè)關(guān)鍵靶標(biāo)進(jìn)行GO 功能與富集分析,結(jié)果顯示生物過(guò)程主要涉及生物過(guò)程調(diào)控、多細(xì)胞生物過(guò)程、免疫系統(tǒng)過(guò)程、細(xì)胞增殖、刺激反應(yīng)、代謝過(guò)程、生物過(guò)程的調(diào)節(jié)、解毒等；分子功能及細(xì)胞組成主要涉及抗氧化活性、催化活性、細(xì)胞膜、細(xì)胞突觸、細(xì)胞器等,詳見(jiàn)圖5。進(jìn)一步富集發(fā)現(xiàn)血必凈可能是通過(guò)參與細(xì)胞死亡的調(diào)節(jié)、脂多糖應(yīng)答、蛋白質(zhì)定位調(diào)節(jié)、細(xì)胞對(duì)有機(jī)物的反應(yīng)、調(diào)節(jié)細(xì)胞蛋白質(zhì)代謝過(guò)程、分子功能調(diào)節(jié)、細(xì)胞死亡等方面發(fā)揮作用,詳見(jiàn)圖6。

2.6 血必凈關(guān)鍵靶點(diǎn)KEGG 信號(hào)通路分析

依據(jù)P＜0.05 篩選14 個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)的KEGG 通路,共得到非小細(xì)胞肺癌(Non-small cell lung cancer)、甲型流感(Influenza A)、T 細(xì)胞受體信號(hào)通路(T cell receptor signaling pathway)、 肺 結(jié) 核(Tuberculosis)、單純皰疹病毒感染(Herpes simplex infection)、朊病毒疾病(Prion diseases)、腫瘤壞死因子信號(hào)通路(TNF signaling pathway)、HIF-1 信號(hào)通路(HIF-1 signaling pathway)、Toll 樣受體信號(hào)通路(Toll-like receptor signaling pathway)、PI3K-Akt 信號(hào)通路(PI3K-Akt signaling pathway)、MAPK 信號(hào)通路(MAPK signaling pathway)、FoxO 信號(hào)通路(FoxO signaling pathway)等信號(hào)通路。 圖7 為上述20 條信號(hào)通路的高級(jí)氣泡圖,其中氣泡顏色代表P 值的大小,RichFactor 代表富集的程度大小,氣泡大小代表該通路中目標(biāo)基因的多少。

2.7 血必凈主要成分與SARS-CoV-2 3CL 水解酶及人體受體ACE2 的分子對(duì)接

將血必凈22 個(gè)主要成分分別與SARS-CoV-2 3CL 水解酶(PDB ID:6LU7)和ACE2(PDB:1R4L)進(jìn)行分子對(duì)接。 結(jié)果如表3 所示,血必凈22 個(gè)主要成分與SARS-CoV-2 3CL 水解酶的結(jié)合能均小于-5.0 kJ/mol；與ACE2 的對(duì)接中,除羥基紅花黃色素A 大于-5.0 kJ/mol 外,其余成分與ACE2 的結(jié)合能均小于-5.0 kJ/mol。 圖8 為結(jié)合能最小分子的對(duì)接圖,金絲桃苷與SARS-CoV-2 3CL 水解酶活性位點(diǎn)附近的LEU 141、GLU 166、ASP 187、THR 26 形成氫鍵,與HIS 41 形成Pi-cation 相互作用；木犀草苷與ACE2 活性位點(diǎn)附近的ALA 348 形成氫鍵、與HIS 345 形成Pi-Pi 相互作用、與HIS 505、ARG 273形成Pi-cation 相互作用。 這些氫鍵及相互作用促使小分子穩(wěn)定結(jié)合到各自蛋白的活性位點(diǎn)上,進(jìn)而抑制蛋白活性。

圖3 靶點(diǎn)-器官組織定位圖Figure 3 Targets-organ mapping

圖4 血必凈靶點(diǎn)關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)Figure 4 The association network of Xuebijing injection genes

表2 關(guān)鍵靶標(biāo)及其拓?fù)鋮?shù)Table 2 The main targets and their topological parameters

圖5 關(guān)鍵靶點(diǎn)的GO 功能分析Figure 5 GO function analysis of key target genes

圖6 靶點(diǎn)的GO 富集分析Figure 6 GO enrichment analysis of target genes

3 討論

COVID-19 患者大多表現(xiàn)為為發(fā)熱、乏力和干咳等癥狀,預(yù)后良好。 但少數(shù)重型和危重型患者可快速進(jìn)展為膿毒癥休克、出凝血功能障礙及多器官衰竭等,往往預(yù)后不良[13]。 而研究發(fā)現(xiàn)SARS-CoV-2感染導(dǎo)致的免疫反應(yīng)過(guò)激與炎癥因子風(fēng)暴是上述并發(fā)癥產(chǎn)生,以及患者死亡的罪魁禍?zhǔn)譡3]。 血必凈注射液是我國(guó)被批準(zhǔn)治療膿毒癥、全身炎癥反應(yīng)綜合征及多器官衰竭的中成藥,此藥是根據(jù)我國(guó)著名中西醫(yī)結(jié)合急救專(zhuān)家王今達(dá)教授提出的"四證四法"中醫(yī)治則及"菌毒炎并治"理論,以血府逐瘀湯為基礎(chǔ),由紅花、赤芍、川芎、丹參、當(dāng)歸5 味中藥提取物精制而成,臨床上在重癥肺炎、燒傷膿毒癥、慢性阻塞性肺疾病、急性呼吸窘迫綜合征等危重疾病患者治療方案中廣泛應(yīng)用[14]。 專(zhuān)家組在總結(jié)COVID-19 前期治療經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,于五版診療方案中首次推薦了血必凈,而后六、七版診療方案[13-15]依舊推薦重型和危重型患者使用,再次肯定了血必凈治療COVID-19 的有效性。

為明確血必凈治療COVID-19 的確切機(jī)制,本研究挖掘血必凈主要成分的作用靶點(diǎn),并重點(diǎn)分析了關(guān)鍵靶點(diǎn)及其富集的生物過(guò)程、信號(hào)通路。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)IL6、IL2、TNF、MAPK1、FGF2 等血必凈關(guān)鍵靶點(diǎn)中多為免疫、炎癥因子或相關(guān)受體,主要參與催化活性、抗氧化活性、細(xì)胞增殖等生物功能,以及脂多糖應(yīng)答、刺激反應(yīng)、代謝過(guò)程、免疫系統(tǒng)進(jìn)程等生物過(guò)程。 關(guān)鍵靶點(diǎn)富集的通路主要有T 細(xì)胞受體、TNF、HIF-1、PI3K-Akt、MAPK、FoxO 等,其中調(diào)控免疫、炎癥的通路為數(shù)最多,如調(diào)控免疫的T 細(xì)胞受體通路；調(diào)控炎癥的TNF、MAPK、Toll 樣受體等；而HIF-1 信號(hào)通路是眾所周知的機(jī)體缺氧應(yīng)激主要通路；甲型流感感染、單純皰疹病毒感染、朊病毒疾病通路則涉及病毒感染的調(diào)控。 諸多實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)血必凈注射液主要通過(guò)抑制TNF-α、IL1、IL6、IL8、IL17 等促炎因子,抑制晚期炎癥細(xì)胞因子高遷移率族蛋白B1 (HMGB1) 的表達(dá),抑制Toll 樣受體4(TLR4) /NF-κB 通路的激活發(fā)揮抗炎作用[16]。 許月球[17]的meta 分析顯示血必凈注射液能夠改善膿毒癥的免疫功能紊亂,這些都與我們的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究結(jié)果保持了一致。 由此可見(jiàn),緩和過(guò)激的免疫反應(yīng),抑制炎癥因子風(fēng)暴,進(jìn)而減輕免疫、炎性損傷是血必凈治療COVID-19 的主要機(jī)制。

表3 血必凈活性成分與SARS-CoV-2 3CL水解酶和ACE2 分子對(duì)接結(jié)果Table 3 Docking results of the active components of xubijing with SARS-CoV-2 3CL hydrolase and ACE2

圖7 KEGG 通路富集Figure 7 KEGG pathway enrichment

圖8 SARS-CoV-2 3CL 水解酶與金絲桃苷(1,2)和ACE2 與木樨草苷(3,4)的二維及三維分子對(duì)接模式Figure 8 2D and 3D Molecular docking diagram of SARS-CoV-2 3CL hydrolase(1,2)with hyperoside and ACE2 with cynaroside(3,4)

ACE2 是SARS-CoV-2 侵入人體的細(xì)胞受體,主要表達(dá)于呼吸系統(tǒng)上皮細(xì)胞,消化系統(tǒng)吸收性腸細(xì)胞、食管、回腸和結(jié)腸的上皮細(xì)胞中,表明消化系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)是SARS-CoV-2 入侵及損傷的首要器官[18],而臨床上患者在發(fā)熱、咳嗽的同時(shí),往往伴有腹瀉、惡心、厭食等消化道癥狀也說(shuō)明了這一點(diǎn)。房曉偉[19]等分析了79 例COVID-19 患者的臨床特征及實(shí)驗(yàn)室檢查,發(fā)現(xiàn)SARS-CoV-2 感染還能造成患者(特別是重型和危重型)凝血系統(tǒng)、心臟、肝、腎等多個(gè)器官及系統(tǒng)的全面損傷,提示要積極防治多器官損傷,避免患者由普通型轉(zhuǎn)化為重型和危重型。 本研究對(duì)血必凈治療COVID-19 的54 靶點(diǎn)進(jìn)行器官定位,發(fā)現(xiàn)靶點(diǎn)主要富集在肺、心臟、肝、胰腺、氣管、小腸、結(jié)腸、全血、腎等器官,與重型和危重型患者的多器官損傷情形完全吻合,說(shuō)明血必凈能夠保護(hù)多個(gè)器官,產(chǎn)生協(xié)同治療COVID-19 的作用,同時(shí)也再次印證了中醫(yī)藥物之間協(xié)同作用、整體論治的基本優(yōu)勢(shì)。

SARS-CoV-2 3CL 水解酶是病毒自身的一個(gè)關(guān)鍵蛋白,病毒需要利用它來(lái)復(fù)制RNA,被認(rèn)為是抗SARS-CoV-2 病毒的有效靶點(diǎn),饒子和/楊海濤課題組測(cè)定并提供了SARS-CoV-2 3CL 水解酶的高分辨晶體結(jié)構(gòu),為抗SARS-CoV-2 活性成分篩選奠定了基礎(chǔ)[20]。 由于ACE2 在介導(dǎo)SARS-CoV-2 入侵細(xì)胞、促進(jìn)病毒復(fù)制、加重急性肺損傷方面發(fā)揮重要作用,也是潛在的藥物篩選靶點(diǎn)[21-23]。 在AutoDock軟件中,一般以結(jié)合能小于-5.0 kJ/mol 為標(biāo)準(zhǔn),來(lái)認(rèn)定小分子化合物與靶蛋白之間具有較好的親和力[24]。 本文分子對(duì)接顯示血必凈22 個(gè)主要成分中的絕大數(shù)與SARS-CoV-2 3CL 水解酶、ACE2 有較好的親和力,其中與SARS-CoV-2 3CL 水解酶親和力最大是金絲桃苷,與ACE2 親和力最大的是木犀草苷、苯甲酰芍藥苷。 因此,本研究推測(cè)血必凈苷類(lèi)成分可能具有一定的抗病毒潛力。

綜上所述,血必凈治療COVID-19 的機(jī)理集中體現(xiàn)在兩個(gè)方面,主要是通過(guò)調(diào)節(jié)人體免疫炎癥反應(yīng)來(lái)保護(hù)重要器官,其次還可能作用于病毒必需蛋白3CL 水解酶及其人體受體ACE2 而產(chǎn)生一定的抗病毒作用,具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路、整體論治的協(xié)同優(yōu)勢(shì)。