免疫性血小板減少癥氣不攝血證小鼠外周血小板活化功能的研究

王 攀,藺亞東,武曲星,侯 敏,高文靜,劉建勛,任鈞國

(中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 中藥藥理北京市重點實驗室, 北京 100091)

免疫性血小板減少癥(immune thrombocytopenia,ITP)是一種常見的出血性疾病,主要表現(xiàn)為血小板計數(shù)降低、皮膚出血[1]。 目前大多認(rèn)為血小板在止血過程中發(fā)揮著主要的作用,其數(shù)量的多少和功能的強(qiáng)弱決定著出血的嚴(yán)重程度。 近年來,臨床上發(fā)現(xiàn)部分ITP 患者血小板數(shù)量降低但沒有出血現(xiàn)象或出血程度不嚴(yán)重,相反,部分ITP 患者經(jīng)治療后血小板數(shù)量回升但仍有出血現(xiàn)象,可見血小板的功能在該出血性疾病中發(fā)揮著重要作用。 呂明恩等[2]、Frelinger 等[3]等研究發(fā)現(xiàn)ITP 患者的出血程度與血小板活化功能相關(guān)。 近年來,ITP 血小板的功能研究越來越受到人們的關(guān)注。

氣不攝血證是ITP 最常見的一種證型[4-5],蔣群[6]發(fā)現(xiàn)ITP 血熱妄行證及陰虛血熱證患者中主要為輕度、中度出血,而大量及嚴(yán)重出血集中在ITP 氣不攝血證患者中。 血小板是血栓形成和止血過程中重要的參與者[7-8],且血小板的黏附、聚集和活化功能在止血過程中發(fā)揮著主要作用[9-10]。 目前,關(guān)于ITP 氣不攝血證血小板功能的研究較少,為此,我們在ITP 氣不攝血證小鼠模型的基礎(chǔ)上[11],對其外周血小板的活化功能做一探究,明確血小板功能的變化情況,為ITP 氣不攝血證的研究提供基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

28 只SPF 級健康雄性BALB/c 小鼠,8 周齡,體重(20±2)g,購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2016-0006]；動物飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院SPF 級實驗動物中心[SYXK(京)2015-0011],溫度20℃～26℃,濕度40%～70%,晝夜12 h 交替,自由攝食攝水。 本研究獲得中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院倫理委員會審批(2018XLC003-2)。 實驗嚴(yán)格遵循3R 原則。

1.2 主要試劑與儀器

檸檬酸鈉(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,批號:20170605)；PBS 緩沖液(北京索萊寶科技有限公司,批號:20180427)；大鼠抗小鼠CD41-APC 抗體、(TonboBio,批號:5180518496)；小鼠Anti-Ly-6GPE、 CD62P-PE 抗 體( Miltenyi, 批 號 分 別 為:5180924558、5180924576)；小鼠β-TG 試劑盒、小鼠PF-4 試劑盒、小鼠ATP 試劑盒、小鼠ADP 試劑盒(Andygene, 批 號 分 別 為: HT21481、 HT20575、HT22026、 HT20827 )； 小 鼠 ROS 試 劑 盒(eBioscience,批號:E118430)；小鼠JC-1 試劑盒(BD PMG,批號:7061587)；APS(中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所提供)。 高速冷凍離心機(jī)(Thermo,IEC CL31R)；超低溫保存箱(Haier,DW-86L626)；流式細(xì)胞儀(BD,FACSARI)；酶標(biāo)儀(芬蘭Labsystems Multiskan MS,352 型)；掃描電子顯微鏡(日本HITACHI 公司,S-3400 N)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組及造模

按照體重與外周血小板計數(shù)將BALB/c 小鼠隨機(jī)分為正常組(13 只)、模型組(15 只)。

參考文獻(xiàn)[11]進(jìn)行造模:模型組小鼠:前7 d 進(jìn)行睡眠剝奪,后14 d 隔天腹腔注射APS 復(fù)合睡眠剝奪,共注射7 次(第8、10、12、14、16、18、20 天注射APS(100 μL/20 g)。 正常組小鼠:前7 d 正常飼養(yǎng),后14 d 隔天腹腔注射生理鹽水7 次(時間與劑量同模型組)。

1.3.2 標(biāo)本采集

實驗結(jié)束后,麻醉小鼠,取血,以3.5%檸檬酸鈉抗凝,取50 μL 全血當(dāng)天待測；剩下全血離心,800 r/min,24℃,離心10 min,上清即富血小板血漿(platelet rich plasma,PRP),取出當(dāng)天待測,下層再3000 r/min,4℃,離心15 min,取上清即血漿,分裝后置-80℃冰箱待測。

1.3.3 小鼠血小板形態(tài)觀察

實驗結(jié)束后,各組隨機(jī)取2 只小鼠,制備血小板掃描電鏡樣本,觀察血小板形態(tài)變化情況。 樣本制備方法如下:小鼠麻醉后,取血,3.5%檸檬酸鈉抗凝,800 r/min,24℃,離心10 min,取10 μL 上清平鋪在細(xì)胞爬片上(長、寬約0.5 cm),10 min 后,加1 mL 戊二醛,使其完全覆沒細(xì)胞爬片,之后放4℃冰箱保存,待檢測。

1.3.4 小鼠血小板α 顆粒、致密顆粒釋放的檢測

取10 μL 制備好的PRP,按照試劑操作說明書用流式細(xì)胞儀檢測血小板α 顆粒CD62P 的表達(dá)率；將制備好的血漿從-80℃冰箱取出,按照ELISA 試劑盒說明書進(jìn)行操作,檢測血漿中血小板α 顆粒β 血小板球蛋白(β-thromboglobulin,β-TG)、血小板第四因子(platelet facter 4,PF-4),致密顆粒三磷酸腺苷( adenosine triphosphate,ATP)、二磷酸腺苷(adenosine diphosphate,ADP)的釋放情況。

1.3.5 小鼠血小板-中性粒細(xì)胞黏附(plateletneutrophil aggregation,PNA)的檢測

取50 μL 制備好的全血,按照試劑操作說明書用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

1.3.6 小鼠血小板線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential,MMP)、活性氧平均熒光強(qiáng)度(reactive oxygen species-mean fluorescence intensity,ROS-MFI)的檢測

分別取10 μL 制備好的PRP,按照試劑操作說明書用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 血小板形態(tài)的變化

掃描電鏡顯示,正常組小鼠血小板大多呈圓形或圓盤形,形狀不規(guī)則,部分血小板有少量偽足形成。 模型組小鼠血小板體積增大,呈扁平、片狀等不規(guī)則形狀,有大量偽足形成,部分黏附聚集成團(tuán)(圖1)。

圖1 血小板形態(tài)的變化(掃描電鏡)Note.A, Normal group.B, Model group.C, Normal group.D, Model group.Arrow 1, Platelet pseudopodia.Arrow 2, Platelet aggregation.Figure 1 Changes of platelet morphology (Scanning electron microscopy)

2.2 血小板顆粒釋放的變化

與正常組比較,模型組小鼠血小板CD62P、ADP均明顯增高(P＜0.05),血小板β-TG、PF-4、ATP 均明顯增高(P＜0.01)(表1、表2,圖2)。

2.3 外周血中PNA 的變化

與正常組比較,模型組小鼠PNA 明顯增高(P＜0.05)(表3,圖3)。

2.4 血小板MMP、ROS-MFI 的變化

與正常組比較,模型組小鼠血小板線粒體膜電位(MMP)、活性氧平均熒光強(qiáng)度(ROS-MFI)均顯著增高(P＜0.01)(表4,圖4、圖5)。

3 討論

ITP 是一種常見的出血性疾病,血小板在出血凝血過程中發(fā)揮著重要作用[7-8]。 近年來,有關(guān)ITP患者血小板功能的報道逐漸多,但結(jié)果各異。 王天有等[12]通過檢測體內(nèi)和體外ADP 刺激后血小板表面膜糖蛋白GPIIb/IIIa 和CD62P 的表達(dá),發(fā)現(xiàn)ITP患者體內(nèi)血小板處于低活化狀態(tài),可見出血現(xiàn)象與血小板功能降低有關(guān)。 但Harker 等研究[13]發(fā)現(xiàn)ITP 患者出血時間較其他血小板水平相應(yīng)的出血時間短,由此推測血小板功能增強(qiáng)。 此外,張娜等[14]研究結(jié)果表明瘀血內(nèi)阻型、陰虛火旺型ITP 患者的血小板膜糖蛋白GPIIb/IIIa 水平高于血熱妄行型、氣不攝血型,血熱妄行型ITP 患者血小板的膜糖蛋白GPIb/IX 水平低于氣不攝血型、瘀血內(nèi)阻型、陰虛火旺型。 因此,本研究認(rèn)為:①無論血小板功能降低還是增強(qiáng)均屬于功能的異常,均能引起出血現(xiàn)象；②血小板功能與中醫(yī)辨證分型相關(guān),證型不同,血小板功能不同。 本研究主要從血小板的形態(tài)、顆粒釋放、血小板黏附及凋亡方面來探究ITP 氣不攝血證小鼠血小板的活化功能。 血小板在正常狀態(tài)下呈橢圓形或圓盤形,平均直徑約2 ～4 μm,是機(jī)體最小的血細(xì)胞。 血小板被激活后,其形狀發(fā)生改變,出現(xiàn)放射狀的突起(又稱偽足),變成樹突型血小板。 在血小板被激活的過程中,大部分顆粒隨即釋放,血小板之間發(fā)生融合,成為粘性變形血小板。本實驗掃描電鏡結(jié)果顯示,模型組小鼠血小板體積增大,有大量偽足形成,部分黏附聚集成團(tuán),表明模型組小鼠血小板被激活,呈活化狀態(tài)。

表1 血小板α 顆粒釋放的變化()Table 1 Changes of alpha granule release in platelets

表1 血小板α 顆粒釋放的變化()Table 1 Changes of alpha granule release in platelets

注:與正常組比較,*P＜0.05,**P＜0.01。Note.Compared with the normal group, *P＜0.05, **P＜0.01.

組別Groups CD62P(n)(%)β-TG(n)(μg/L)PF-4(n)(μg/L)正常組Normal group 4.78±1.19(10) 5.17±0.49(10) 5.24±0.22(10)模型組Model group 6.82±3.00(13)* 6.73±0.36(10)** 6.78±0.47(10)**

表2 血小板致密顆粒釋放的變化()Table 2 Changes of dense granule release in platelets

表2 血小板致密顆粒釋放的變化()Table 2 Changes of dense granule release in platelets

注:與正常組比較,*P＜0.05,**P＜0.01。Note.Compared with the normal group, *P＜0.05, **P＜0.01.

組別Groups ATP(n)(nmol/L)ADP(n)(nmol/L)正常組Normal group 441.29±26.11(10) 1546.52±97.83(10)模型組Model group 575.61±31.87(10)** 1627.04±31.38(8)*

血小板被激活后會釋放α 顆粒和致密顆粒,其中α 顆粒含有多種活化因子和膜糖蛋白,如纖維蛋白原、組織蛋白酶A、β-TG、PF-4、和CD62P 等,β-TG、PF-4、CD62P 可作為血小板活化的主要指標(biāo)；致密顆粒含有ATP、ADP 等,ADP 可促進(jìn)血小板的活化,ATP 為其提供能量,進(jìn)而促進(jìn)血小板發(fā)揮活化與聚集功能。 本實驗結(jié)果顯示,模型組小鼠血小板CD62P 表達(dá)率顯著高于正常組,這與文獻(xiàn)報道[15]一致,其結(jié)果顯示ITP 患者血小板的CD62P 表達(dá)有不同程度升高的現(xiàn)象,提示模型組小鼠血小板活化程度增高；此外,模型組小鼠β-TG、PF-4 的含量均顯著升高,這與俞亞琴等[16]對ITP 患者的臨床研究一致,其研究表明ITP 患者血漿中β-TG、PF-4 的含量比對照組高,且ITP 病情越重,β-TG、PF-4 的含量越高,表明血小板活化程度越高,導(dǎo)致其消耗量增加、外周血小板計數(shù)降低；模型組小鼠血小板血漿中ATP、ADP 的含量均顯著高于正常組,表明模型組小鼠血小板呈活化狀態(tài),這與棘啟明等[17]研究相反,其研究表明ITP 患者ATP、ADP 的釋放減少,這可能與ITP 證型相關(guān),其原因需進(jìn)一步研究。

表3 外周血中PNA 的變化(,n)Table 3 Changes of PNA in peripheral blood

表3 外周血中PNA 的變化(,n)Table 3 Changes of PNA in peripheral blood

注:與正常組比較,**P＜0.05,**P＜0.01。Note.Compared with the normal group, *P＜0.05, **P＜0.01.

組別Groups n PNA(%)正常組Normal group 10 16.23±4.38模型組Model group 12 22.78±7.41*

表4 血小板MMP、ROS-MFI 的變化(,n)Table 4 Changes of MMP and ROS-MFI in platelets

表4 血小板MMP、ROS-MFI 的變化(,n)Table 4 Changes of MMP and ROS-MFI in platelets

注:與正常組比較,*P＜0.05,**P＜0.01。Note.Compared with the normal group, *P＜0.05, **P＜0.01.

組別Groups MMP(n)(%) ROS-MFI(n)正常組Normal group 87.44±6.32(10) 539.57±77.39(11)模型組Model group 99.00±0.45(10)** 828.92±161.02(11)**

PNA 可作為血小板活化的敏感指標(biāo)[18],黏附的強(qiáng)弱代表著血小板活化的強(qiáng)弱。 CD41、LY-6G分別是血小板、中性粒細(xì)胞的特異性標(biāo)志物,本實驗通過流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠外周血中CD41 與LY-6G 雙陽性表達(dá)含量百分比來表示PNA 的百分率。結(jié)果顯示PNA 增高,提示模型組小鼠血小板與中性粒細(xì)胞黏附率增高,活化增強(qiáng)。

圖2 血小板CD62P 表達(dá)率的變化Figure 2 Changes of CD62P expression rate in platelets

圖3 血小板PNA 的變化Figure 3 Changes of PNA in peripheral blood

研究報道[19-20],血小板雖然沒有細(xì)胞核,但也存在著凋亡現(xiàn)象,線粒體介導(dǎo)的內(nèi)始式途徑在其凋亡過程中起主要調(diào)控作用。 尹俊等[21]發(fā)現(xiàn)ITP 患者的血小板凋亡率較高,主要表現(xiàn)在血小板MMP降低、促凋亡蛋白和抗凋亡白的異常表達(dá)等。 血小板MMP 的降低表示血小板去極化,研究表明MMP降低是血小板早期凋亡的一種反應(yīng)；ROS 是一種氧單電子的還原物,主要由線粒體產(chǎn)生,可通過降低血小板內(nèi)NO 含量、提高血小板內(nèi)Ca2+濃度促進(jìn)血小板活化[22-23]；此外ROS 還可誘導(dǎo)線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放,進(jìn)而使MMP 降低,引起細(xì)胞凋亡[24-25]。 本實驗結(jié)果顯示,模型組小鼠去極化血小板百分率明顯升高,血小板ROS-MFI 顯著高于正常組,提示模型組小鼠血小板凋亡率高于正常組,提示血小板凋亡可能與ITP 的發(fā)病機(jī)制相關(guān),這與尹俊等[21]、邵澤偉等[26]臨床研究一致。

綜上,無論是血小板形態(tài)、血小板顆粒釋放還是血小板黏附及凋亡,均表明了該模型小鼠外周血小板呈高度活化狀態(tài),提示該模型小鼠血小板的活化與黏附功能沒有喪失,反而增強(qiáng)。 血小板活化后,一方面發(fā)揮其黏附和聚集功能,一方面消耗血小板,加速其數(shù)量的降低,這與該模型中外周血小板計數(shù)顯著降低表現(xiàn)一致,提示血小板異常的活化功能可能是其發(fā)病機(jī)制之一,由此推測血小板的高活化狀態(tài)也是引起氣不攝血證的原因之一,這為ITP 氣不攝血證的研究提供了新的思路,同時也為血小板的研究奠定了基礎(chǔ)。

圖4 血小板MMP 的變化Figure 4 Changes of MMP in platelets

圖5 血小板ROS-MFI 的變化Figure 5 Changes of ROS-MFI in platelets