慢病毒介導(dǎo)Fg12 基因沉默技術(shù)對自身免疫性心肌炎大鼠Th1/Th2 漂移及Th17/Treg 平衡的影響

張晶晶,劉 婕,楊占峰,孫 巖,岳麗曉,何群力

(鄭州工業(yè)應(yīng)用技術(shù)學(xué)院 醫(yī)學(xué)院,河南 新鄭 451100)

自身免疫性心肌炎是一種由T 細胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病,多項研究均顯示,Th1/Th2 細胞漂移和Th17/Treg 細胞平衡與疾病進展密切相關(guān)[1-3]。Th1 細胞和Th17 細胞主要分泌促炎細胞因子IFN-γ和IL-17,而Th2 細胞和Treg 細胞主要分泌抑炎細胞因子IL-4 和TGF-β[4]。 當(dāng)T 細胞亞群從Th1 向Th2 漂移或Th17 細胞減少而Treg 細胞增加時,則表明機體炎癥反應(yīng)被抑制,反之能表明炎癥反應(yīng)加劇。 Fg12 凝血酶原酶是一種II 型跨膜糖蛋白,其在免疫調(diào)節(jié)和凝血過程中發(fā)揮重要作用。 目前,Fg12基因的研究主要集中在肝病方面,多項研究均報道Fg12 蛋白具有促炎作用,由于自身免疫性心肌炎的病理過程與炎癥反應(yīng)和纖維化密切相關(guān),因此,本研究推測Fg12 基因可能參與疾病的發(fā)生發(fā)展[5-6]。本研究通過建立自身免疫性心肌炎大鼠模型,應(yīng)用慢病毒介導(dǎo)Fg12 基因沉默技術(shù)敲低大鼠Fg12 基因,旨在探討Fg12 基因表達與Th1/Th2 漂移及Th17/Treg 平衡之間的關(guān)聯(lián),以期為自身免疫性心肌炎的治療提高理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

6 周齡Sprague Dawley(SD)雄性SPF 大鼠購自凱學(xué)生物科技(上海)有限公司[SCXK(滬)2018-0006],體重為200～220 g,共40 只。 動物購回后在鄭州工業(yè)應(yīng)用技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)系動物飼養(yǎng)室內(nèi)飼養(yǎng)[SYXK(豫)2019-0011]。 大鼠在25℃、55%相對濕度、12 h 光暗循環(huán)的環(huán)境中,給予大鼠標(biāo)準(zhǔn)飼料和自來水飼養(yǎng)。 本研究已獲得我院倫理審查委員會批準(zhǔn)(ZZGYXY-20190314)。

1.2 主要試劑與儀器

慢病毒Fgl2 載體以及攜帶綠色熒光蛋白慢病毒空載體由上海吉凱基因化學(xué)公司進行合成；MAC 1200ST 心電分析儀和GE logic E9 心臟超聲診斷儀均由美國GE Marquette 醫(yī)療系統(tǒng)公司生產(chǎn)；完全弗氏佐劑和豬心肌球蛋白購自美國Sigma 公司；TRIzol試劑購自美國 Invitrogen 公司； PrimeScript RT reagent 試劑盒和SYBR Premix Ex Taq 購自日本TaKaRa 公司；快速7500 型熒光定量PCR 儀和TaqMan MicroRNA 測定試劑盒購自美國Applied Biosystems 公司；組織細胞總蛋白抽提試劑盒P1250購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；BCA 蛋白定量試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)公司；IFN-γ、IL-17和TGF-β 一抗購自美國Cell Signaling Technology 公司；IL-4、TGF-β 和β-actin 一抗購自美國Sigma Aldrich 公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗動物分組

將大鼠隨機分為4 組,即對照組(NC 組)、模型組(Model 組)、空載組(Vehicle 組)、Fgl2-RNAi 慢病毒組(RNAi 組),每組10 只。

1.3.2 自身免疫性心肌炎大鼠模型的建立

參考文獻[7]所述方法進行自身免疫性心肌炎大鼠模型的建立。 將豬心肌球蛋白加入0.15 mol/L的PBS 溶液中進行溶解,終濃度調(diào)整為2 mg/mL。豬心肌球蛋白溶液與完全弗氏佐劑進行等體積混合,得到乳濁液。 在模型組、空載組和Fgl2-RNAi 慢病毒組SD 大鼠雙側(cè)腹股溝處注射豬心肌球蛋白乳濁液1 mL,即2 mg。 此外,將等體積的PBS 與完全弗氏佐劑混合,在對照組大鼠相同部位進行注射。所有大鼠共注射7 d 進行免疫。

1.3.3 Fgl2-RNAi 慢病毒處理

慢病毒Fgl2 載體以及攜帶綠色熒光蛋白慢病毒空載體由上海吉凱基因化學(xué)公司進行合成。 將包裝好的Fgl2-RNAi 慢病毒1 mL 加入到生理鹽水中溶解混勻,制備終體積為200 μL/mL 的慢病毒混合液。 將攜帶綠色熒光蛋白的空載體慢病毒1 mL加入到生理鹽水中進行溶解混勻,制備終體積為200 μL/mL 的慢病毒空載體混合液。 然后對Fgl2-RNAi 慢病毒組大鼠尾靜脈注射0.5 mL 的混合液,其中含有100 μL 的Fgl2-RNAi 慢病毒。 空載組大鼠注射等體積的慢病毒空載體混合液。

1.3.4 心臟功能監(jiān)測

MAC 1200ST 心電分析儀和GE logic E9 心臟超聲診斷儀均由美國GE Marquette 醫(yī)療系統(tǒng)公司生產(chǎn)。 分別于免疫第0 天和第28 天檢測各組大鼠的心臟功能,大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉進行麻醉,然后將大鼠仰臥固定在桌面上進行胸部脫毛,然后通過心臟彩超心動圖檢測,并獲取左室收縮末期的橫徑(LVEDs)、左室舒張末期的橫徑(LVEDd)、射血分數(shù)(LVEF%)和左室短軸的縮短分數(shù)(FS%)等指標(biāo)。

1.3.5 大鼠心肌病理學(xué)檢查

在初次免疫第28 天時處死大鼠,開胸取出心臟,然后沿冠狀面縱切心臟分為兩份。 一份應(yīng)用4%多聚甲醛進行固定,另一份凍存于-80℃冰箱。將4%多聚甲醛固定的心肌組織進行梯度乙醇脫水及二甲苯透明,然后石蠟包埋,制作厚度4 μm 的切片。 然后將貼片進行常規(guī)HE 染色,主要步驟包括二甲苯脫蠟,每次10 min,然后無水乙醇洗脫二甲苯5 min,梯度乙醇進行脫水,然后蒸餾水洗片5 min,蘇木素染色5 min,在用蒸餾水洗片,依次在1%的鹽酸和碳酸鋰中浸泡3 s,之后用蒸餾水洗滌10 min。 然后用伊紅染色5 min,梯度乙醇脫水,然后二甲苯浸潤2 次,室溫干燥并封片。 在光學(xué)顯微鏡先觀察切片,隨機選取5 個視野并計算炎性細胞浸潤及壞死面積占整個視野的百分比,然后對心肌炎癥進行評分。 評分如下:＜25%為1 分,25 ～50%為2分,51～75%為3 分,＞75%為4 分。

1.3.6 qRT-PCR

使用TRIzol 試劑提取大鼠組織的總RNA。 使用PrimeScript RT reagent 試劑盒逆轉(zhuǎn)錄提取的RNA為cDNA,并使用TaqMan MicroRNA 測定試劑盒進行實時PCR 定量,總反應(yīng)體積為20 μL。 使用SYBR Premix Ex Taq 在ABI Prism 快速7500 型熒光定量PCR 儀上進行qRT-PCR 分析,甘油醛3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參基因。 引物序列如下:Fg12,正向:5’-GATGGCTGGACGCGGTTAAAGGG-3’； 反 向:5’-TAATGTGGTGGTTAGGGGTGGT-3’；IFN-γ,正向:5’-GACTTTGGCAAAAGGTGGG-3’；反向:5’-TGGGGAATGTTGGTAGGT-3’；IL-17,正向:5’-CAGTTTGGTGGAAGGAGGCGA-3’； 反 向: 5’-TGCGGGAGTGGGCGGATGAGGT-3’；IL-4,正向:5’-CAGGGTTGAGGAGTTAAGGCGA-3’； 反 向: 5 ’-TGTGGGAGTACGGATGGGT-3’；TGF-β,正 向:5’-AGGTAAGTTAATGGTGGTGCGAC-3’； 反 向: 5’-TGTGGGAATGGGCGTGGAGTAGGT-3’；GAPDH,正向:5’-CCAGGTCAAGCTGCGAGAAC-3’；反向5’-TAAGACGCCAGTCGGGTGTGGA-3’。 PCR 反 應(yīng) 條件如下,95℃3 min 預(yù)變性,95℃30 s 變性,60℃30 s退火,72℃30 s 延伸,30 個循環(huán), 72℃5 min 延伸。 使用2-ΔΔCt方法計算相對表達量。

1.3.7 Western blot

使用組織細胞總蛋白抽提試劑盒P1250 提取大鼠心肌組織總蛋白。 應(yīng)用BCA 蛋白定量試劑盒對蛋白進行定量,然后將蛋白質(zhì)提取物進行10%SDS-PAGE 電泳并轉(zhuǎn)移至PVDF 膜,室溫下在5%脫脂乳中封閉30 min,然后與抗IFN-γ (1 ∶2000)、IL-17 (1 ∶1500)、IL-4 (1 ∶2000)、TGF-β (1 ∶1000)和βactin (1 ∶1000)的一抗4℃過夜孵育,然后在室溫下與辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h,并用增強化學(xué)發(fā)光法顯色,使用Image 軟件分析蛋白條帶。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS 18.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理,數(shù)據(jù)表示為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()。 通過單因素方差分析評估組間差異,P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)顯著性。

2 結(jié)果

2.1 慢病毒介導(dǎo)Fg12 基因沉默技術(shù)下調(diào)了大鼠心肌組織中Fg12 基因的表達

RT-PCR 結(jié)果證實(圖1),與對照組(NC)相比,模型組(Model)和空載體組(Vehicle)的Fg12 mRNA 表達水平顯著升高,然而Fgl2-RNAi 慢病毒處理組(RNAi)的Fg12 mRNA 表達水平顯著低于模型組和空載體組。 表明慢病毒介導(dǎo)Fg12 基因沉默技術(shù)下調(diào)了大鼠心肌組織中Fg12 基因的表達。

2.2 各組大鼠超聲心動圖參數(shù)比較

表1 顯示,各組大鼠的基線超聲心動圖參數(shù)LVEDs、LVEDd、LVEF 和FS 均無顯著差異,在建模28 d 后,Model 組、Vehicle 組和RNAi 組的LVEDs 和LVEDd 均顯著升高,并且RNAi 組顯著低于Model組。 此外,Model 組、Vehicle 組和RNAi 組的LVEF和FS 均顯著降低,而RNAi 組顯著高于Model 組。

2.3 各組大鼠心肌組織HE 染色結(jié)果

建模28 d 后,發(fā)現(xiàn)Model 組、Vehicle 組和RNAi組大鼠的心肌組織中均出現(xiàn)不同程度的炎癥反應(yīng),主要表現(xiàn)為心肌細胞腫脹或壞死、炎癥細胞浸潤、毛細血管擴張等,而NC 組未見明顯炎癥細胞浸潤。但RNAi 組大鼠心肌組織的炎癥細胞浸潤程度低于Model 組。 炎癥評分顯示,Model 組、Vehicle 組和RNAi 組的炎癥評分均顯著高于NC 組,而RNAi 組的炎癥評分明顯低于Model 組。 詳見圖2。

2.4 Fg12 基因沉默對自身免疫性心肌炎大鼠Th1/Th2 漂移的影響

圖1 各組大鼠心肌組織Fg12 基因的表達Note.Compared with NC group, *P ＜0.05.Compared with Model group, #P ＜0.05.Figure 1 Expression of the Fg12 gene in myocardial tissue of rats in each group

Th1 細胞可分泌促炎細胞因子IFN-γ,Th2 細胞可分泌抑炎細胞因子IL-4。 如圖3 所示,建模28 d后, Model 組、Vehicle 組和RNAi 組大鼠心肌組織中的IFN-γ 和IL-4 mRNA 和蛋白表達水平均顯示升高,說明三組大鼠心肌組織均出現(xiàn)明顯的炎癥反應(yīng)。 然而,值得注意的是,RNAi 組大鼠心肌組織中的IFN-γ mRNA 和蛋白表達水平均顯著低于Model組,而IL-4 mRNA 和蛋白表達水平均顯著高于Model 組。 說明Fg12 基因沉默導(dǎo)致大鼠心肌組織中的輔助性T 細胞向Th2 細胞漂移,從而降低炎癥反應(yīng)。

2.5 Fg12 基因沉默對自身免疫性心肌炎大鼠Th17/Treg 平衡的影響

促炎細胞因子IL-17 主要由Th17 細胞分泌,而抑炎細胞因子TGF-β 主要由Treg 細胞分泌。 如圖4 所示,建模28 d 后,Model 組、Vehicle 組和RNAi組大鼠心肌組織中的IL-17 和TGF-β mRNA 和蛋白表達水平均顯示升高。 然而,RNAi 組大鼠心肌組織中的IL-17 mRNA 和蛋白表達水平均顯著低于Model 組,而TGF-β mRNA 和蛋白表達水平均顯著高于Model 組。 說明Fg12 基因沉默可抑制大鼠心肌組織中的Th17 細胞,而上調(diào)Treg 細胞,從而抑制炎癥反應(yīng)。

3 討論

心肌炎是一種在青少年人群中較為常見的一種心血管疾病,主要致病原因為病毒感染。 心肌炎與其他心血管疾病的癥狀比較類似,因此臨床診斷中也比較困難[8]。 目前,心肌炎的發(fā)病機制尚不清楚,許多專家認為心肌炎與病毒感染引起的心肌抗原自身免疫反應(yīng)有關(guān)。 因此,目前的大多數(shù)病理研究著重于自身免疫性心肌炎的動物模型實驗,該模型主要通過心肌球蛋白誘導(dǎo)動物心肌損傷及多核細胞浸潤,其發(fā)病機制與病毒性心肌炎和人類巨細胞心肌炎類似[9]。

表1 各組大鼠超聲心動圖參數(shù)Table 1 Echocardiographic parameters of rats in each group

圖2 各組大鼠心肌組織HE 染色結(jié)果Note.a, HE staining legend.b, HE staining inflammation score.Compared with NC group, *P＜0.05.Compared with Model group, #P＜0.05.Figure 2 Results of HE staining of myocardial tissue in each group

圖3 Fg12 基因沉默對Th1/Th2 漂移的影響Note.a and b, Relative expression of IFN-γ and IL-4 mRNA in myocardial tissue of each group.c and d, Relative expression of IFN-γ and IL-4 protein in myocardial tissue of each group.e, IFN-γ and IL-4 protein bands.Compared with NC group, *P＜0.05.Compared with Model group, #P＜0.05.Figure 3 Effect of Fg12 gene silencing on Th1/Th2 drift

圖4 Fg12 基因沉默對Th17/Treg 平衡的影響Note.a and b, Relative expression of IL-17 and TGF-β mRNA in myocardial tissue of each group.c and d, Relative expression of IL-17 and TGF-β protein in myocardial tissue of each group.e, IL-17 and TGF-β protein bands.Compared with NC group, *P＜0.05.Compared with Model group, #P＜0.05.Figure 4 Effect of Fg12 gene silencing on Th17/Treg balance

Fg12 凝血酶原酶是一種II 型跨膜糖蛋白,屬于纖維蛋白家族,Fg12 蛋白可由血管內(nèi)皮細胞和巨噬細胞表達,在免疫調(diào)節(jié)和凝血過程中發(fā)揮重要作用,Fg12 可將凝血酶原轉(zhuǎn)化為凝血酶并導(dǎo)致形成不溶性纖維蛋白,從而加速纖維蛋白沉積及形成血栓[10]。 目前,Fg12 基因的研究主要集中在肝病方面,多項研究均報道Fg12 蛋白具有促炎作用,然而Fg12 基因與自身免疫性心肌炎發(fā)生發(fā)展的關(guān)系仍不明確[11]。 本研究建立了自身免疫性心肌炎大鼠模型,并應(yīng)用慢病毒介導(dǎo)Fg12 基因沉默技術(shù)敲低大鼠Fg12 基因,研究顯示,建模28 d 后,Model 組、Vehicle 組和RNAi 組的LVEDs 和LVEDd 均顯著升高,并且RNAi 組顯著低于Model 組。 此外,Model組、Vehicle 組和RNAi 組的LVEF 和FS 均顯著降低,而RNAi 組顯著高于Model 組。 由于LVEDd 是評價左室舒張功能的指標(biāo),而FS 是評價收縮功能,LVEDd 升高或FS 下降則說明心臟舒張功能發(fā)生障礙[12]。 LVEF 是LVEDs 與LVEDd 的比值,LVEF 下降則說明心臟收縮能力發(fā)生障礙[12]。 因此,本研究表明,Fg12 基因沉默可顯著改善自身免疫性心肌炎大鼠的心臟功能。 此外,HE 染色結(jié)果也顯示,Fg12基因沉默可顯著降低大鼠心肌組織的炎癥細胞浸潤,從而抑制炎癥反應(yīng)。

自身免疫性心肌炎是一種由T 細胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病,有關(guān)學(xué)者通常將CD4+T 細胞分泌的細胞因子分為Th1 和Th2 細胞,Th1 細胞因子具有介導(dǎo)細胞免疫和抗腫瘤免疫作用,比如IFN-γ 和IL-2；而Th2 某些細胞因子參與機體免疫逃逸機制,如IL-4 和IL-6。。 疾病發(fā)生早期主要分泌Th1 細胞因子,導(dǎo)致Th1/Th2 漂移。 Th1 和Th2 細胞因子的紊亂可誘導(dǎo)自身免疫性疾病的發(fā)展。 Th1 和Th2 細胞因子由機體T 淋巴細胞分泌并形成網(wǎng)絡(luò),正常情況下兩種細胞因子通過互相影響并維持機體免疫功能的正常運作,IFN-γ 是自身免疫中出現(xiàn)較早的細胞因子,主要參與調(diào)節(jié)單核巨噬細胞的吞噬作用,IL-2 是維持機體正常免疫功能的細胞因子,具有廣譜的免疫增強活性,IL-4 可抑制Th1 細胞因子的分泌,IL-6 則具有調(diào)節(jié)細胞增殖、凋亡和血管生成的作用。

此外,隨著淋巴細胞亞群的劃分越來越細,多項研究均顯示,新的亞群如Th17 細胞和Treg 細胞的平衡性也與自身免疫性心肌炎的發(fā)病機制有關(guān)。Th17 細胞分泌的IL-17 細胞因子在急性病毒性心肌炎患者中顯著升高[13],而且IL-17 也參與調(diào)節(jié)Th1細胞的分化及Treg 細胞對細胞因子TGF-β 的分泌過程,而包括CD4+CD25+Treg 細胞在內(nèi)的Treg 細胞在免疫調(diào)節(jié)中具有重要作用[14]。 現(xiàn)有研究均證實,Th1 和Th17 細胞主要表現(xiàn)為促炎癥反應(yīng),而Th2 和Treg 細胞主要表現(xiàn)為抑制炎癥反應(yīng)[15]。 Th17 和Treg 細胞之間的平衡影響疾病的進展,如果平衡從Treg 細胞向Th17 細胞移動,即Th17/Treg 細胞比率升高,則疾病的嚴重程度會顯著升高。 Th17 細胞通過分泌IL-6 和IL-17 而發(fā)揮促炎作用,而Treg 細胞通過分泌TGF-β 和IL-10 在抑制炎癥過程中起關(guān)鍵作用[15]。

因此,Th1/Th2 漂移及Th17/Treg 平衡可反應(yīng)自身免疫性心肌炎的嚴重程度。 本研究發(fā)現(xiàn),建模28 d 后, Model 組、Vehicle 組和RNAi 組大鼠心肌組織中的IFN-γ、IL-4、IL-17 和TGF-β mRNA 和蛋白表達水平均顯示升高,說明三組大鼠心肌組織均出現(xiàn)明顯的炎癥反應(yīng)。 然而,值得注意的是,RNAi 組大鼠心肌組織中的IFN-γ 和IL-17 mRNA 和蛋白表達水平均顯著低于Model 組,而IL-4 和TGF-β mRNA和蛋白表達水平均顯著高于Model 組。 說明Fg12基因沉默導(dǎo)致大鼠心肌組織中的輔助性T 細胞向Th2 細胞漂移,并且下調(diào)Th17 細胞,而上調(diào)Treg 細胞,從而糾正Th1/Th2 漂移及Th17/Treg 細胞平衡,并緩解心肌炎癥反應(yīng)。

綜上所述,本研究表明Fg12 基因通過調(diào)節(jié)Th1/Th2 漂移及Th17/Treg 平衡來參與自身免疫性心肌炎的發(fā)生發(fā)展,Fg12 基因沉默可顯著改善自身免疫性心肌炎大鼠的心臟功能,并降低心肌炎癥反應(yīng)。