血液分析儀與手工計數(shù)法在實驗樹鼩紅細胞生理指標檢測中的效果評價

馮清源,馮一唯,夏 巍,戢克銅,陳泓霖,賴永靜,唐安洲

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院,南寧 530000)

樹鼩是一種小型哺乳類動物,在我國云南、廣西、貴州、海南等地均有分布[1]。 樹鼩具有體型小、易飼養(yǎng)、繁殖周期短、管理便捷等特點,在解剖結(jié)構(gòu),生理功能與生化代謝方面與人類有諸多相似之處[2-3],并且全基因組測序結(jié)果證實了樹鼩與靈長類動物具有高度親緣關(guān)系[4]。 基于這些優(yōu)勢,近年來樹鼩作為實驗動物被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,并取得了豐碩的成果[5-8]。

目前有關(guān)樹鼩的研究多為應(yīng)用型研究,較少見有關(guān)于樹鼩自身生理指標測量方面的報導(dǎo),隨著樹鼩的廣泛使用,其正常生理指標的系統(tǒng)化和標準化將變得至關(guān)重要。 血常規(guī)檢查簡便、快捷,對機體內(nèi)許多病理改變都有敏感反映[9-12],是動物造模中最常用的檢查指標之一。 雖已有學(xué)者對實驗樹鼩的血象進行了初步研究[13-20],但尚未見有通過手工法對樹鼩紅細胞相關(guān)生理值進行測定的報導(dǎo),同時由于不同研究中使用的血細胞分析儀型號和廠商不同,導(dǎo)致分析系統(tǒng)的原理和方法不盡相同,而使得不同的研究結(jié)果之間一致性較差,例如:馬旭通等[19]使用美國雅培CELL-DYN3700 全自動血球分析儀測量的人工繁育樹鼩紅細胞數(shù)量(1012/L)和血紅蛋白含量(g/L)分別為(7.99±0.92)和(149.2±15.5)；而李進濤等[20]利用貝克曼庫爾特DifF-2 型全自動血細胞分析儀測量中緬滇西亞種樹鼩的結(jié)果分別為(9.8±0.6)和(174.8±11.04)；而白繼麗等[18]利用BC-2800Vet 全自動血液細胞分析儀測量人工飼養(yǎng)樹鼩的結(jié)果為(8.21±0.96)和(150.12±13.60)。 以上研究中樹鼩的種屬來源有一定差異,此外,馬旭通等[19]測量了野生樹鼩不同性別紅細胞數(shù)量,結(jié)果分別為(7.93±0.59)(雌)、(6.97±2.15)(雄),因此,樹鼩種屬來源以及性別的不同也可能是導(dǎo)致研究結(jié)果差異的影響因素。 同時,血液分析儀較手工法測量血液生理指標有可能存在一定誤差,2012 年,Zandecki 等[21]詳細分析了血液分析儀的誤差可能,脂質(zhì)、凝集素、冷球蛋白和白細胞計數(shù)升高等會導(dǎo)致血紅蛋白測量或紅細胞計數(shù)異常,這些測量指標的異常同時可能導(dǎo)致計算出的平均紅細胞指數(shù)也受到影響。 為了對血細胞分析儀測定結(jié)果的準確性進行分析,本研究對實驗室繁殖樹鼩外周血中紅細胞生理值指標數(shù)值進行了手工檢測,并與不同血液細胞分析儀的結(jié)果進行對比,旨在為今后的研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

普通級成年中緬樹鼩滇西亞種20 只,雌雄各半,體重為120～130 g 之間,由昆明醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供[SCXK(滇)K2019-0005],在廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心[SYXK(桂)2014-0003]穩(wěn)定4周以上。 普通級樹鼩飼養(yǎng)房,單籠喂養(yǎng), 室內(nèi)溫度(24±1)℃,相對濕度40%～50%,人工光照12 h/d。每日上午10 點清理糞便并投喂全營養(yǎng)顆粒飼料及谷物,隔天投喂水果, 每周投喂面包蟲1 次,自由正常飲水。 實驗時處于樹鼩非繁殖期。 實驗動物的使用經(jīng)過廣西醫(yī)科大學(xué)動理倫理委員會的批準(20190921),實驗過程中按照3R 原則給予實驗動物人道主義關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

使用邁瑞B(yǎng)C-6800 型全自動血液細胞分析儀(邁瑞,深圳)和優(yōu)利特URIT-3010 型全自動血細胞分類計數(shù)儀(優(yōu)利特,桂林)進行血液細胞分析測定,檢測試劑為原裝配套試劑。 血紅蛋白測試液、游離血紅蛋白測試盒均購自南京建成生物工程研究所；BX53F 正置光學(xué)顯微鏡(奧林巴斯,日本)。

1.3 實驗方法

1.3.1 血樣的采集

禁食12 h 后將樹鼩置于專用的樹鼩保定袋中固定,清醒狀態(tài)下經(jīng)股靜脈抽取2 ～2.5 mL 全血,采血時間控制在30 s 以內(nèi),動作輕柔,盡量避免溶血。將收集到的血液置于含有EDTA 抗凝劑的采血管中并混勻,同時取4 μL 血于干凈載玻片上,制備薄厚適宜且細胞分布均勻的血涂片。

1.3.2 檢測方法

嚴格按照標準操作程序使用邁瑞B(yǎng)C-6800 型全自動血液細胞分析儀和優(yōu)利特URIT-3010 型全自動血細胞分類計數(shù)儀測定血液細胞,得到包括紅細胞數(shù)(RBC)、血細胞比容(HCT)、血紅蛋白含量(Hb)、紅細胞平均容積(MCV)、紅細胞平均血紅蛋白含量(MCH)、紅細胞平均血紅蛋白濃度(MCHC)等血液生理指標。 手工法測量血細胞比容原理為微量比容法,紅細胞直徑的測量和紅細胞計數(shù)；使用正置光學(xué)顯微鏡及其配套軟件進行血涂片鏡檢；血紅蛋白含量、游離血紅蛋白(FHB)含量檢測使用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)試劑盒通過HICN 比色法測得。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

用SPSS 25.0 軟件包分析數(shù)據(jù),各項數(shù)據(jù)均以“平均數(shù)±標準差”()表示,參考值范圍的計算方法則根據(jù)數(shù)據(jù)是否正態(tài)分布決定,若符合正態(tài)分布,則進一步計算中位數(shù)(median) 和95% CI(confidence interval,置信區(qū)間),統(tǒng)計判斷:正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用t 檢驗,非正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用秩和檢驗,P＜0.05 被認為具有統(tǒng)計學(xué)差異。 采用Medcalc 7.0 和GraphPad Prism 7 統(tǒng)計分析軟件繪制Bland-Altman 圖和Passing-Bablok 回歸分析,評估兩種方法的一致性?；赑assing-Bablok 回歸分析所獲得的截距和斜率來判斷方法的一致性:若截距和斜率的95%置信區(qū)間(CI)分別包括0 和1,則兩方法一致性好；若截距和斜率的95%置信區(qū)間(CI)未分別包括0 和1,則兩方法一致性差。 基于Bland-Altman 圖上的點在一致性界限(limits of Agreement, LoA)的分布情況,均勻分布于Y=0 的兩側(cè),判斷兩種方法是否存在系統(tǒng)差異；基于兩方案總體平均差、總體截距和斜率的95%CI 是否包括0,判斷兩種方法是否存在比例差異。

2 結(jié)果

表1 記錄了樹鼩外周血中紅細胞數(shù)、血細胞比容、血紅蛋白含量、紅細胞平均容積、紅細胞平均血紅蛋白含量、紅細胞平均血紅蛋白濃度的手工法和血液細胞分析儀的測量結(jié)果。 手工法中紅細胞平均容積、紅細胞平均血紅蛋白含量和紅細胞平均血紅蛋白濃度依據(jù)所測得紅細胞數(shù)、血細胞比容和紅細胞平均血紅蛋白濃度的結(jié)果結(jié)合公式計算得來?？梢娛止しê臀宸诸愌杭毎治鰞x的結(jié)果中僅有血細胞比容和紅細胞平均血紅蛋白含量無統(tǒng)計學(xué)的差異,其余各項指標均存在統(tǒng)計學(xué)差異；三分類血液細胞分析儀的結(jié)果僅有紅細胞計數(shù)一項與手工法結(jié)果之間無統(tǒng)計學(xué)差異,其余各項指標均存在統(tǒng)計學(xué)差異。 圖1 和圖2 以Bland-Altman 圖和Passing-Bablok 回歸分析評估了手工法和血液細胞分析儀兩種方法的一致性,結(jié)果顯示在使用五分類血液細胞分析儀檢測HCT 和MCH 時,Bland-Altman圖上的點分布于Y=0 的兩側(cè)且總體平均差、總體截距和斜率的95%CI 均包括0,同時Passing-Bablok 回歸分析截距和斜率的95%CI 分別包括0 和1,因此兩種方法之間無顯著統(tǒng)計學(xué)差異,且方法之間一致性好,不存在系統(tǒng)誤差和比例誤差；在檢測紅細胞數(shù)、Hb、MVC、MCHC 時,Bland-Altman 圖上的點較為均勻分布但偏向于Y=0 上側(cè)或下側(cè),且部分參數(shù)的總體平均差、總體截距或斜率的95%CI 不包括0,Passing-Bablok 回歸分析截距的95%置信區(qū)間(CI)不包括0 或斜率的95%置信區(qū)間(CI)不包括1,因此兩種方法之間的一致性一般,存在較大的系統(tǒng)差異和一定的比較差異,提示使用五分類血液細胞分析儀進行檢測時僅能對上述指標變化趨勢進行判斷；三分類血液細胞分析儀的檢測結(jié)果中,紅細胞數(shù)與手工法比較,Bland-Altman 圖上的點均勻分布于Y=0 的兩側(cè)且總體平均差、總體截距和斜率的95%CI 包括0,同時Passing-Bablok 回歸分析截距和斜率的95%CI 分別包括0 和1,無系統(tǒng)差異和比例差異,但其余各項指標均存在較大的系統(tǒng)差異和比例差異,提示該型儀器的檢測結(jié)果與真實值之間存在較大差異。 手工法檢測樹鼩外周血中游離血紅蛋白的測量結(jié)果為(79.27±6.95),95%CI 為76.02～82.52,有一定參考意義。 圖3 使用正置光學(xué)顯微鏡及其配套軟件對血涂片上合適區(qū)域的樹鼩紅細胞直徑進行檢測得到外周血紅細胞直徑曲線,可見直徑在5.5～6 μm 之間的紅細胞最多,偶見過大或過小的紅細胞。

表1 手工法與血細胞分析儀檢測樹鼩紅細胞生理值結(jié)果Table 1 Manual counting and hematology analyzer method to measure the physiological indexes of tree shrew erythrocytes

3 討論

本研究使用手工法及儀器法分別對樹鼩外周血紅細胞數(shù)、血細胞比容、血紅蛋白含量、紅細胞平均容積、紅細胞平均血紅蛋白含量、紅細胞平均血紅蛋白濃度指標進行測量比較,手工法測定得到的紅細胞數(shù)、血紅蛋白含量介于三分類儀器法和五分類儀器法之間,高于三分類而低于五分類。 手工測量血細胞比容使用微量離心法,與本文五分類全自動血液分析儀測定的數(shù)據(jù)比較來看,數(shù)值較為接近,無顯著差異(P=0.104)。 測量過程中血漿滲透壓的改變對血細胞也會有一定影響[22]。 血細胞比容能夠反映出紅細胞與血漿容量的相對關(guān)系,故而血漿容量對其有明顯影響,紅細胞體積也有一定的影響。 由于所檢測的紅細胞數(shù)量多,血細胞比容有可能受到血漿容量發(fā)生改變及紅細胞體積的變化而有所差異。 手工法與五分類儀器法測得數(shù)據(jù)中紅細胞數(shù)、紅細胞平均容積、紅細胞平均血紅蛋白濃度及血紅蛋白含量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.001)；手工法與三分類儀器法測得的數(shù)據(jù)中血細胞比容、紅細胞平均容積、紅細胞平均血紅蛋白含量紅細胞、平均血紅蛋白濃度及血紅蛋白含量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001)。 本研究中所使用的優(yōu)利特血細胞分析儀采用電阻抗的原理對紅細胞及血小板進行計數(shù),而邁瑞血細胞分析儀是采用電阻抗加激光的原理。 當血細胞通過計數(shù)孔時會產(chǎn)生脈沖信號,而脈沖數(shù)量與細胞數(shù)量呈正比、脈沖的高度與通過其的血細胞體積的大小成正比[23],通過將脈沖的高度疊加換算得到血細胞比容,因此儀器并不能區(qū)分不同血細胞之間的理化性質(zhì)[24],對于小體積紅細胞和血小板計數(shù)易混淆,導(dǎo)致出現(xiàn)誤差。 同時,不同物種之間正常血細胞及蛋白的特性有一定差異,如正常人外周血紅細胞直徑在6～8 μm 之間,對比手工法測量的樹鼩紅細胞直徑(圖3),正常人紅細胞直徑略大于樹鼩,在使用未經(jīng)過數(shù)據(jù)校正的血液分析儀對樹鼩外周血進行檢測時可能存在一定的偏差,針對這些差異,在使用血液細胞分析儀時應(yīng)進行參數(shù)的調(diào)整。 并且,手工法在顯微鏡下針對細胞及特殊成分的計數(shù)依然是最可靠的檢查方法[25],應(yīng)結(jié)合手工法的結(jié)果對血液細胞分析儀的參數(shù)進行適當?shù)恼{(diào)整。

同時,本文還首次使用手工法測量了樹鼩外周血中游離血紅蛋白的含量,游離血紅蛋白能夠提示紅細胞的溶血情況,溶血程度對于其相關(guān)生理指標的檢測有明顯影響,游離血紅蛋白含量對于紅細胞及血紅蛋白相關(guān)指數(shù)的測量準確性有較好的提示作用,能夠為未來進一步研究提供參考。 紅細胞平均指數(shù)由血細胞比容、血紅蛋白量及紅細胞計數(shù)間接計算得出,為避免誤差,本文手工法測定這三個指標使用同一份抗凝血標本。 無論手工法或儀器法,都應(yīng)注意盡可能避免發(fā)生溶血。

圖1 Bland-Altman 圖的x 軸表示手工法與血液細胞分析儀的平均值,y 軸表示兩種方法結(jié)果之間的差異Note.Manual counting and BC-6800, RBC,MCH, The points on the Bland Altman are distributed on both sides of Y=0,and the 95% CI of the total mean deviation, total intercept and slope includes 0.HCT, Hb, MVC, MCHC, The points on the Bland Altman are more evenly distributed but tend to the upper or lower side of Y=0, and the 95% CI of the overall mean deviation, overall intercept or slope of some parameters does not include 0.Manual counting and UNIT-3010, RBC, The points on the Bland Altman are distributed on both sides of Y=0, and the 95% CI of the total mean deviation, total intercept and slope includes 0.HCT, Hb, MVC, MCH, MCHC, The points on the Bland Altman are more evenly distributed but tend to the upper or lower side of Y=0, and the 95% CI of the overall mean deviation, overall intercept or slope of some parameters does not include 0.Figure 1 The x-axis of Bland Altman graph represents the average value of manual method and hematology analyzer, and the y-axis represents the difference between the results of the two methods

圖2 Passing-Bablok 回歸分析顯示了手工法與細胞分析儀獲得的數(shù)據(jù)之間的一致性Note.Manual counting and BC-6800.RBC,MCH,95% CI of intercept and slope of Passing-Bablok regression analysis includes 0 and 1 respectively.HCT, Hb, MVC, MCHC, The intercept 95% CI of Passing-Bablok regression analysis does not include or the slope 95% CI does not include 1.Manual counting and UNIT-3010, RBC, 95% CI of intercept and slope of Passing-Bablok regression analysis includes 0 and 1 respectively.HCT, Hb, MVC, MCH, MCHC, The intercept 95% CI of Passing-Bablok regression analysis does not include or the slope 95% CI does not include 1.Figure 2 Passing-Bablok regression analysis shows the consistency between the data obtained by manual method and cell analyzer

本研究選用健康成年樹鼩20 只, 清醒狀態(tài)下空腹股靜脈采血,并及時處理所得樣本, 所選用儀器均有質(zhì)量控制保證,其測定結(jié)果有一定參考意義。 所有樣本結(jié)合傳統(tǒng)血涂片法并進行顯微鏡下分類計數(shù)。 綜上所述,采用電阻抗加激光為原理的五分類全自動血液分析儀測定紅細胞相關(guān)指標具有準確、快速、可靠的優(yōu)點,適用于對大批量標本進行快速有效的檢測,但是其并不能完全替代人工鏡檢法,只有兩者結(jié)合應(yīng)用才能保證檢驗結(jié)果的準確性和可靠性；單純以電阻抗為原理的三分類全自動血液分析儀的檢測結(jié)果與真實值有較大差異,應(yīng)針對樹鼩進行相關(guān)參數(shù)的校正。

圖3 樹鼩外周血紅細胞直徑曲線Note.The diameter of red blood cells in the right area of the blood smear was measured under an optical microscope using software.Figure 3 Diameter curve of peripheral blood erythrocytes in the tree shrew