神經(jīng)營養(yǎng)因子-3 基因修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和水凝膠聯(lián)合應(yīng)用對脊髓損傷模型大鼠的治療作用研究

趙宣淇,張 鈺,秦 川,張 玲

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所,北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心,北京 100021)

脊髓損傷(spinal cord injury, SCI)是一種嚴(yán)重的、破壞性的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病,對患者的生活質(zhì)量和預(yù)期壽命都有很大的影響[1-2]。 20 年前發(fā)病主要集中于青壯年人[3],多由于高能量暴力損傷胸腰段脊髓；近年來,隨著人口老齡化,SCI 發(fā)病主要集中在65 歲至74 歲之間的男性,脊柱退行性病變、頸椎不穩(wěn)導(dǎo)致頸部脊髓損傷[4]。 每名脊髓損傷患者社會保障和長期護(hù)理經(jīng)濟(jì)成本約為110 ～460 萬美元[5]。 傳統(tǒng)的治療方法主要包括手術(shù)治療、藥物治療、康復(fù)治療、心理治療、并發(fā)癥與合并癥的治療[6],但效果并不明顯。 近年來,動物實(shí)驗(yàn)中多采用神經(jīng)生長因子和可降解組織工程學(xué)支架治療[7]；臨床試驗(yàn)中多采取間充質(zhì)干細(xì)胞治療,但效果并不穩(wěn)定[8-10]。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSC)來源豐富、分離簡單、低免疫原性、沒有倫理學(xué)爭議[11],是骨髓中最豐富的細(xì)胞,也是造血和功能支持細(xì)胞,一定條件下可跨胚層誘導(dǎo)分化。 在組織修復(fù)和重建領(lǐng)域,尤其是在中樞神經(jīng)損傷修復(fù)方面具有廣闊的應(yīng)用前景[12-13]。 神經(jīng)營養(yǎng)因子-3(neurotrophic factor 3,NT-3)由神經(jīng)所支配的組織和星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的,并為神經(jīng)元生長與存活所必需的蛋白質(zhì)分子。 通過可以保護(hù)神經(jīng)元,促進(jìn)軸突再生,對神經(jīng)損傷修復(fù)有促進(jìn)作用,但半衰期較短,吸收率低,不能持續(xù)作用[14]。 水凝膠(hydrogels)作為可降解組織工程學(xué)支架功能性地橋接斷脊髓斷端,為新生突觸網(wǎng)絡(luò)架起神經(jīng)傳遞信號的上下行傳遞的橋梁[15],為細(xì)胞、因子提供三維生長環(huán)境并實(shí)現(xiàn)緩慢釋放。 本研究旨在探索BMSC+hydrogels+NT-3 三者結(jié)合的聯(lián)合治療方法,希望對脊髓損傷后神經(jīng)修復(fù)與再生提供新思路。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

8 周齡SPF 級SD 雄性大鼠48 只,體重220 ～250 g,來源于北京華阜康生物科技有限公司[SCXK(京)2019-0008],動物在標(biāo)準(zhǔn)化條件下飼養(yǎng)于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所、北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心南院屏障環(huán)境中[SYXK(京)2018-0019]。 實(shí)驗(yàn)操作經(jīng)本單位動物倫理委員會審批(QC19010)。 大鼠自由飲食和飲水,環(huán)境溫度控制為22℃～28℃,相對濕度為40%～60%,飼養(yǎng)環(huán)境每日光照時間為12 h,整個動物實(shí)驗(yàn)過程中嚴(yán)格按實(shí)驗(yàn)動物使用的3R 原則給予實(shí)驗(yàn)動物人道關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

α-MEM 培養(yǎng)基(Minimum Essential Medium α,α-MEM)、0.25%胰酶+EDTA(Trypsin-EDTA)、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、5%青-鏈霉素雙抗( Penicillin-Streptomycin, PS )、 磷 酸 緩 沖 鹽(phosphate buffered saline, PBS)(Gibco,美國)；SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化試劑盒(賽業(yè)生物科技有限公司,中國)；含有NT-3 完整編碼序列的重組慢病毒(合生基因生物科技有限公司,中國)；水凝膠試劑盒(廣州大洲醫(yī)學(xué)科技有限公司,中國)；HE 和免疫組化染色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司,中國)和相關(guān)抗體(Cell signaling technology,美國)；倒置相差顯微鏡(Olympus,日本)；細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo,美國)；離心機(jī)、Western blot 儀(Bio-rad,美國)；超凈工作臺、顯微鏡及成像系統(tǒng)(Leica,德國)；場發(fā)射透射電子顯微鏡(JEOL,日本)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)、基因修飾、鑒定與誘導(dǎo)分化

1 月齡SD 大鼠安樂死后,無菌條件下解剖雙側(cè)股骨,剪開股骨近、遠(yuǎn)端,用10 mL 含10% FBS、1%PS 的α-MEM 反復(fù)沖洗髓腔直至變白,過濾至含5 mL PBS 的無菌離心管中,吹打混勻,常溫下1500 r/min 離心5 min 后棄上清,將細(xì)胞球團(tuán)吹打混勻后,置于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每隔2～3 d 更換培養(yǎng)基。 當(dāng)細(xì)胞生長較滿時加入0.25% Trypsin-EDTA 消化離心后傳代。

選擇生長良好的P2、P3 代細(xì)胞進(jìn)行基因修飾。提前1～2 d 在24 孔板中鋪板104個/孔,待細(xì)胞鋪滿孔底面約30% ～40%時加入慢病毒、聚凝胺(polybrene)、培養(yǎng)基的混合溶液約3 mL。 設(shè)置轉(zhuǎn)染空載體(GPF)、過表達(dá)目的基因(NT-3)、空細(xì)胞(BMSC)各三組。 首次應(yīng)根據(jù)細(xì)胞形態(tài)及生長狀況12～36 h 更換培養(yǎng)基,首次后每隔3 d 更換培養(yǎng)基,4～7 d 熒光顯微鏡下觀察。

從細(xì)胞培養(yǎng)箱中取出轉(zhuǎn)染良好的BMSC+GFP和BMSC+NT-3 細(xì)胞,PBS 沖洗2 次后,消化、離心后棄上清,加入100 μL PBS 吹打混勻,放入2 mL 無菌EP 管中,并分別標(biāo)記為CD29、CD34、CD44、CD45、CD11b 然后每管分別加入10 μL 對應(yīng)的熒光標(biāo)記的抗體,4℃下避光靜置30 min,然后加入1.5 mL PBS,吹打混勻,濾紙過濾到流式管中。 并設(shè)置一組生長良好的BMSC 細(xì)胞作為對照組,重復(fù)以上操作,共同上機(jī)檢測。

選取轉(zhuǎn)染良好的BMSC+GFP 和BMSC+NT-3,PBS 沖洗2 次后,消化、離心后棄上清,重懸吹打混勻后接種于6 孔板中,調(diào)整細(xì)胞密度為106個/孔。細(xì)胞即將長滿孔板底面時,成脂誘導(dǎo)細(xì)胞加成脂誘導(dǎo)分化液A 2 mL,3 d 后更換成脂誘導(dǎo)分化液B 2 mL,1 d 后再次更換為成脂誘導(dǎo)分化液A 2 mL。4 周后4 mL PBS 沖洗3 遍,4%多聚甲醛固定30 min后4 mL PBS 沖洗3 遍。 2 mL 油紅O 溶液染色30 min,置于顯微鏡下進(jìn)行觀察。 成骨誘導(dǎo)細(xì)胞加入成骨誘導(dǎo)分化液2 mL,每隔3 d 更換新誘導(dǎo)分化液。 4周后4 mL PBS 沖洗3 遍,4%多聚甲醛固定30 min后,4 mL PBS 沖洗3 遍。 2 mL 茜紅溶液染色30 min,置于顯微鏡下進(jìn)行觀察。 選取生長良好的BMSC 運(yùn)用正常培養(yǎng)基培養(yǎng)4 周后,重復(fù)以上固定、染色步驟作為對照組,置于顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.3.2 免疫印跡試驗(yàn)(Western blot)檢測基因編輯細(xì)胞后相關(guān)蛋白的表達(dá)

選取生長良好的BMSC、BMSC+GFP、BMSC+NT-3 細(xì)胞,倒掉原培養(yǎng)基,PBS 沖洗3 次后再倒入600 μL PBS,用細(xì)胞刮刀刮下細(xì)胞,放入1.5 mL EP管中,4℃1500 r/min 離心10 min,后棄上清。 分別加入30 μL 裂解液(磷酸酶抑制劑1 片溶于1 mL 水取100 μL、蛋白酶抑制劑1 片溶于10 mL 水取100 μL、細(xì)胞RIPA 800 μL、PMSF 10 μL),插在冰上靜置30 min。 4℃14000 r/min 離心10 min 后取上清分別放入新的1.5 mL EP 管中。 測蛋白濃度后,加入25%總體積的Buffer、10%總體積的Reducing 和總體積-buffer-Reducing-蛋白體積的水,最后加入蛋白。 制樣后放入70℃中30 min。 預(yù)制膠每孔上樣12 μL,常規(guī)加滿電泳液,膠后加入1 mL 抗氧化劑。30 min、200 V 跑膠。 150 min、200 mV 冰中轉(zhuǎn)膜。麗春紅染色,去離子水清洗三遍,脫脂奶粉3 g+60 mL TBST(Tris-Hcl,NaCl,tween20,TBST)搖勻后封閉1 h。 一抗4℃搖床過夜。 3 mL TBST 清洗6 min,重復(fù)三遍,常溫?fù)u床孵育2 抗60 min。 吸走膜上的殘余液體,并在膜上覆蓋液,曝光。

1.3.3 水凝膠的制備

取5 mg 試劑B 加入到1 mL 培養(yǎng)基中,渦旋震蕩致完全溶解,放入37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中備用。取100 mg 試劑A 放在紫外下照射消毒30 min,用20 μm 濾網(wǎng)過濾5 mg 試劑B 和1 mL 培養(yǎng)基混合液,并加入消毒后的試劑A,渦旋震蕩致完全溶解,放入37℃、 5% CO2培養(yǎng)箱中備用。 選取生長良好的BMSC、BMSC+GFP、BMSC+NT-3 細(xì)胞,消化離心后棄上清。 用1 mL 培養(yǎng)基、試劑A、試劑B 的混合液,將細(xì)胞吹打混勻即可獲得細(xì)胞-CelGel 混懸液。取適量細(xì)胞-CelGel 混懸液滴注到PDMS 模具內(nèi)。放入紫外線光燈箱光照交聯(lián)60 s,獲得細(xì)胞-CelGel凝膠。 將細(xì)胞-CelGel 凝膠放入培養(yǎng)基37℃、5%CO2培養(yǎng)。

1.3.4 動物分組及急性不完全性脊髓損傷大鼠模型構(gòu)建

將SD 大鼠放置于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所SPF 級動物房中適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后,將其隨機(jī)分為6 組,每組8 只。 分別為:假手術(shù)對照組(Sham)、脊髓損傷模型組(SCI model)、BMSC+NT-3組、BMSC+hydrogels 組、BMSC+hydrogels+GFP 組、BMSC+hydrogels+NT-3 組。 手術(shù)常規(guī)2.5%異氟烷吸入麻醉SD 大鼠,背部備皮后俯臥位膠布牢固固定大鼠于手術(shù)臺上,手術(shù)區(qū)域1%碘伏消毒三遍,75%酒精消毒一遍。 無菌條件下取后正中切口逐層切開3 cm 左右,鈍性分離背部肌肉,咬除T9-T11 棘突及相應(yīng)椎板,暴露T9 ～T11 節(jié)段脊髓,切開硬脊膜,將脊髓自T10 節(jié)段向遠(yuǎn)端切除0.5 cm,清除椎管內(nèi)殘留的神經(jīng)纖維。 分別將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞和搭載細(xì)胞的水凝膠植入脊髓缺損處,使其與脊髓損傷斷端緊密接觸吻合。 明膠海綿充分止血后,5-0 號可吸收縫線依次縫合肌肉和皮下組織,0 號不可吸收線縫合皮膚。 75%醫(yī)用酒精擦凈傷口,肌肉注射抗生素預(yù)防感染,皮下注射止痛藥。 術(shù)后勤換墊料,按摩膀胱促進(jìn)排尿。

1.3.5 運(yùn)動行為學(xué)檢測(BBB)

每組大鼠在術(shù)前以及術(shù)后1、2、4、6、8 周分別按照Basso Beatlie Bresnahan(BBB)評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行觀察。 BBB 評分總分為21 分,0 分表示無明顯動作,21 分表示無損傷運(yùn)動活動。 將測試大鼠置于平坦開闊的50 cm 測試盒中自由活動,由兩名實(shí)驗(yàn)人員對大鼠后肢運(yùn)動協(xié)調(diào)能力進(jìn)行評分。

1.3.6 組織取材及切片

各組大鼠經(jīng)模型構(gòu)建和不同方法治療8 周后,完成行為學(xué)實(shí)驗(yàn)。 2%戊巴比妥鈉麻醉后經(jīng)左心室-升主動脈插管。 先快速血管灌注生理鹽水200 mL,待血液沖刷干凈,肝逐漸變?yōu)榘咨笤俟嘧?%多聚甲醛溶液約100 mL,待動物抽搐完畢后。 依次取出心臟、肺、肝、腎、脾和腦等臟器,生理鹽水沖洗表面后置入福爾馬林溶液中,石蠟包埋切片后按蘇木素-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining, HE)染色。 脊髓置于4%多聚甲醛溶液中4 ℃過夜后固定,固定后將脊髓依次放入20%和30%蔗糖溶液中浸泡,待組織塊下沉到瓶底,進(jìn)行冰凍切片,免疫組化染色。

1.3.7 染色方法

二甲苯脫蠟三次,每次15 min,然后分別在100%、90%、80%、70%酒精中浸泡5 min,PBS 漂洗3 遍,每遍5 min。 蘇木素染色后流水沖洗10 min。5%乙酸分化后流水沖洗10 min,伊紅染色后流水沖洗10 min。 70%、80%、90%、100%酒精和二甲苯各1 min 脫水透明后封片。

免疫組織化學(xué)染色時需提前1 d 將切片放入37℃烤箱中過夜。 二甲苯脫蠟15 min,重復(fù)三次。100%酒精浸泡后置于70%酒精中2 min,重復(fù)4 次。PBS 漂洗3 遍,每遍5 min。 置于放滿0.01 mmol/L檸檬酸緩沖液熱修復(fù)盒中,微波爐高、中、低火各加熱5 min,恢復(fù)至室溫后PBS 漂洗3 遍,每遍5 min。每張片子加過氧化物酶阻斷劑阻斷15 min 后PBS漂洗3 遍,每遍5 min。 羊血清覆蓋標(biāo)本封閉30 min后加入一抗(1 ∶200),4℃過夜。 37℃孵育30 min 后PBS 漂洗3 遍,每遍5 min。 加入二抗相應(yīng)的反應(yīng)增強(qiáng)劑20 min 后PBS 漂洗3 遍,每遍3 min。 加入酶標(biāo)二抗孵育30 min 后PBS 漂洗3 遍,每遍2 min。DAB 染色后放入流水中沖洗10 min,蘇木素染色后流水沖洗,鹽酸酒精浸泡3 次后流水沖洗10 min。脫水透明后封片。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

運(yùn)用Adobe Photoshop CC 2018 軟件對免疫組織化學(xué)切片進(jìn)行計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì),利用GraphPad Prism 7.0和SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 使用單因素方差分析(one-way ANOVA)確定組間差異,以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染的形態(tài)觀察

首先,對SD 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞2 d 左右貼壁生長,P2～5 代生長能力強(qiáng)。 運(yùn)用骨髓貼壁法分離、培養(yǎng)、擴(kuò)充的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為長梭形,呈團(tuán)簇狀、放射狀生長,折光性強(qiáng),形態(tài)均勻。 傳代后細(xì)胞形態(tài)單一,無明顯變化、純度較高,狀態(tài)良好,增殖能力強(qiáng)。 然后,對細(xì)胞進(jìn)行慢病毒轉(zhuǎn)染,并設(shè)置兩組,分別為空載體組(GFP)和過表達(dá)目的基因組(NT-3)并進(jìn)行觀察。結(jié)果顯示,90% 以上的細(xì)胞具有綠色熒光表達(dá),提示轉(zhuǎn)染效率較高(如圖1)。

2.2 基因修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的蛋白表達(dá)驗(yàn)證

為了驗(yàn)證NT-3 蛋白在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中過表達(dá),以及證明NT-3 來源為外源性,本研究進(jìn)行了Western blot 分析。 結(jié)果顯示,NT-3 蛋白表達(dá)結(jié)果顯示慢病毒轉(zhuǎn)染目的基因組顯著高于轉(zhuǎn)染空載體組與空細(xì)胞組。 Flag-tag 作為一種標(biāo)記標(biāo)簽,能標(biāo)記外源性的目的基因。 Flag-tag 表達(dá)表明NT-3 組蛋白高表達(dá)為外源性基因修飾的結(jié)果(如圖2)。

2.3 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的流式細(xì)胞學(xué)驗(yàn)證

為了驗(yàn)證基因修飾后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,本研究運(yùn)用流式細(xì)胞學(xué)檢測。 經(jīng)流式細(xì)胞學(xué)儀檢測,結(jié)果顯示CD29 和CD90 強(qiáng)陽性,CD11b、CD31 和CD45 呈陰性,符合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的特征(如圖3)。

2.4 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞生長曲線活力檢測

為了選取生長能力較強(qiáng)的細(xì)胞進(jìn)行動物模型的治療,本研究首先選取生長狀態(tài)良好的BMSC、GFP、NT-3 細(xì)胞105個,分別種植在24 孔板中。 在不同時間段3 d、6 d、9 d、12 d、15 d,對細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)消化、離心后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),并制作了細(xì)胞生長曲線。 結(jié)果顯示,未經(jīng)轉(zhuǎn)染的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞每次細(xì)胞計(jì)數(shù)其數(shù)量均多于轉(zhuǎn)染GFP 以及NT-3 的細(xì)胞,轉(zhuǎn)染GFP 組和NT-3 組細(xì)胞生長形態(tài)以及數(shù)量沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在3 ～9 d 時的增殖速度明顯高于9 ～12 d,而使用慢病毒轉(zhuǎn)染BMSC 后,在4 d 左右開始表達(dá)綠色熒光,7 d 時表達(dá)更多。 最終,本研究選取轉(zhuǎn)染后7 d 的細(xì)胞對實(shí)驗(yàn)動物模型進(jìn)行治療(如圖4)。

2.5 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂、成骨誘導(dǎo)分化后細(xì)胞生長情況和形態(tài)

為了觀察基因修飾后骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分化能力本研究對其進(jìn)行了成脂、成骨誘導(dǎo)分化。 4周后,成脂誘導(dǎo)分化細(xì)胞油紅O 染色后明顯可見脂滴形成。 成骨誘導(dǎo)分化細(xì)胞茜素紅染色后,可見云霧狀鈣化結(jié)節(jié)。 對照組無明顯改變(如圖5)。

2.6 水凝膠支架的形態(tài)觀察

隨后制備水凝膠,為明確水凝膠支架的內(nèi)部形態(tài)結(jié)構(gòu),進(jìn)行透射電鏡觀察。 結(jié)果顯示,典型水凝膠的三維微米尺度多孔無規(guī)則蜂窩狀結(jié)構(gòu),進(jìn)一步可觀察到納米結(jié)構(gòu)。 多孔無規(guī)則蜂窩狀結(jié)構(gòu),具有較大的表面積和體積,一方面,可為BMSC 和NT-3提供營養(yǎng)交換提供渠道和緩釋條件；另一方面,為神經(jīng)組織的再生提供較大的生長空間(如圖6)。

2.7 急性不完全性脊髓損傷大鼠模型的建立與治療

本研究在動物實(shí)驗(yàn)前,準(zhǔn)備好細(xì)胞并進(jìn)行驗(yàn)證,后將細(xì)胞置入水凝膠中,現(xiàn)在計(jì)劃對它們進(jìn)行動物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,本研究整體時間進(jìn)展(如圖7)。 為了驗(yàn)證經(jīng)基因修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合水凝膠對于脊髓損傷神經(jīng)修復(fù)治療的安全性和有效性,本研究運(yùn)用SD 大鼠進(jìn)行造模和治療。 切除大鼠脊柱椎板及附件,完全暴露后行脊髓半切(如圖8)。切除后對不同組動物分別植入BMSC+NT-3、BMSC+hydrogels、BMSC+hydrogels+GFP、BMSC+hydrogels+NT-3 進(jìn)行相應(yīng)治療。 1 周內(nèi)實(shí)驗(yàn)大鼠活動、飲食、飲水較少,2～3 周后逐漸恢復(fù)(如圖9)。

2.8 SD 大鼠運(yùn)動行為學(xué)BBB 評分

為了驗(yàn)證經(jīng)基因修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合水凝膠對大鼠脊髓損傷模型治療后,后肢運(yùn)動和協(xié)調(diào)能力恢復(fù)的有效性,本研究在手術(shù)前和術(shù)后1、2、4、6、8 周對各組大鼠進(jìn)行運(yùn)動行為學(xué)BBB 評分測定并制圖。 移植1 周后,Sham 組大鼠運(yùn)動評分恢復(fù)正常,而各治療組大鼠BBB 評分均有不同程度增加,后肢運(yùn)動能力提升,其中BMSC+hydrogels+NT-3組大鼠BBB 評分增加最為明顯,BMSC+hydrogels 組其次。 充分說明三者聯(lián)合治療的有效性。 所有結(jié)果組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.005)(如圖10)。

2.9 手術(shù)造模治療8 周后大鼠組織病理學(xué)檢測

手術(shù)造模治療8 周后,對各組大鼠進(jìn)行脊髓的病理學(xué)檢測,分析損傷區(qū)域脊髓神經(jīng)元、神經(jīng)纖維和星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目。 SCI model 組和Sham 相比,神經(jīng)元、神經(jīng)纖維數(shù)量明顯減少,星型膠質(zhì)細(xì)胞增多(P＜0.05),證明了大鼠脊髓損傷造模成功。 各治療組與SCI mode 組比較,神經(jīng)元數(shù)量增多,星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量減少(P＜0.05)(如圖11)證明了各組治療均有效。 其中,BMSC+hydrogels+NT-3 組神經(jīng)元、神經(jīng)纖維數(shù)目增加,星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目較其他治療組較少,證明其治療效果最佳。 BMSC+hydrogels+GFP 組與BMSC+hydrogels 組相比,神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05),神經(jīng)纖維數(shù)目無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 BMSC+hydrogels 組和BMSC+NT-3 組在神經(jīng)元、神經(jīng)纖維和星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(如圖12、圖13、圖14)。

為了驗(yàn)證BMSC+hydrogels+NT-3 在脊髓損傷治療中的安全性,本研究對SD 大鼠進(jìn)行急性不完全性脊髓損傷造模治療8 周后,對大鼠重要臟器進(jìn)行組織病理學(xué)切片,所有大鼠均未發(fā)現(xiàn)腫瘤形成及免疫排斥反應(yīng)。 各組大鼠心臟、肺、肝、腎功能形態(tài)正常,腦部形態(tài)正常,提示各組治療方案安全性良好(如圖15)。

圖1 細(xì)胞形態(tài)與慢病毒轉(zhuǎn)染Note.SD rat bone marrow mesenchymal stem cells had the same morphology, and green fluorescence expression was observed after transfection.A, Normal growth of bone marrow mesenchymal stem cells.B, Bone marrow mesenchymal stem cells transfected with GFP.C, Bone marrow mesenchymal stem cells transfected with NT-3.Figure 1 Cell morphology and lentiviral transduction

圖2 SD 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)染后蛋白表達(dá)Note.Western blot verified protein expression after lentiviral transduction of the target gene or the empty vector in cultured BMSCs.A, B.Protein expression of the target protein (NT-3), green fluorescent protein (GFP), and internal reference protein (β-actin) after transduction of SD rat bone marrow mesenchymal stem cells.Figure 2 Protein expression of SD rat bone marrow mesenchymal stem cells after transduction

圖3 SD 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)染慢病毒后的流式細(xì)胞學(xué)驗(yàn)證Figure 3 Flow cytometric verification of SD rat bone marrow mesenchymal stem cells transduced via a lentivirus

圖4 SD 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與轉(zhuǎn)染GFP 和NT-3細(xì)胞生長曲線Figure 4 Growth curve of SD rat bone marrow mesenchymal stem cells and transduced GFP and NT-3-expressing cells

3 討論

本研究通過構(gòu)建大鼠脊髓損傷模型并進(jìn)行相應(yīng)治療,運(yùn)用行為學(xué)、病理學(xué)檢測,評價了BMSC、NT-3、hydrogels 在脊髓損傷神經(jīng)修復(fù)與再生中的治療作用。

首先對SD 大鼠進(jìn)行急性不完全性脊髓損傷造模,脊髓在損傷當(dāng)時由直接外力導(dǎo)致神經(jīng)和血管結(jié)構(gòu)的原發(fā)性損傷[15-17]。 隨后幾小時到幾天[18],大量激活的炎癥產(chǎn)生毒性分子,小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞等形成瘢痕,誘導(dǎo)神經(jīng)元死亡。 同時還分泌硫酸軟骨素蛋白聚糖等抑制損傷脊髓的再生,繼發(fā)性損傷進(jìn)一步產(chǎn)生瀑布式細(xì)胞凋亡、膠質(zhì)瘢痕形成和軸索變性[18-20]。

圖5 SD 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化Note.Growth of bone marrow mesenchymal stem cells after adipogenic and osteogenic differentiation and control morphology.A, Adipogenic differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells.B, Osteogenic differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells.C, Control group of rat bone marrow mesenchymal stem cells induced to undergo adipogenic differentiation.D,Control group of rat bone marrow mesenchymal stem cells induced to undergo osteogenic differentiation.Figure 5 Differentiation of SD rat bone marrow mesenchymal stem cells

圖8 SD 大鼠手術(shù)切除脊髓造模與相應(yīng)治療Note.A, Resection of the lamina.B, Exposed spinal cord.C, Removed part of the spinal cord.D, BMSC + hydrogel + NT-3 rats were implanted with BMSC + hydrogel + NT-3.E, BMSC + NT-3 rats were implanted with BMSC + NT-3.F, Removed part of the spinal cord.Figure 8 Surgical removal of the spinal cord and corresponding treatments

圖9 模型大鼠術(shù)后狀態(tài)Note.SD rats in the spinal cord injury model group were paralyzed on the affected hindlimb after the operation, and both forelimbs and healthy hindlimbs dragged the affected hindlimb when walking.Figure 9 Postoperative status of model rat

圖10 各組SD 大鼠造模、治療前后運(yùn)動行為學(xué)BBB 評分Figure 10 BBB scores of SD rats in each group before and after modeling and treatment

圖11 各組SD 大鼠脊髓損傷區(qū)域NeuN 染色Note.NeuN staining of the rat spinal cord injury area showed the number of neurons in the tissue.A, Sham group.B, SCI model group.C,BMSC + NT-3 group.D, BMSC + hydrogel group.E, BMSC + hydrogel + GFP group.F, BMSC + hydrogel + NT-3 group.Figure 11 NeuN staining of the spinal cord injury area of SD rats in each group

圖12 各組SD 大鼠脊髓損傷區(qū)域NF-H 染色Note.NF-H staining of the injured area of the spinal cord in rats showed the number of nerve fibers in the tissue.A,Sham group.B, SCI model group.C, BMSC+NT-3 group.D, BMSC + hydrogel group.E, BMSC + hydrogel + GFP group.F, BMSC + hydrogel + NT-3 group.Figure 12 NF-H staining of the spinal cord injury area of SD rats in each group

圖13 各組SD 大鼠脊髓損傷區(qū)域GFAP 染色Note.GFAP staining of the rat spinal cord injury area showed the number of astrocytes in the tissue.A,Sham group.B,SCI model group.C, BMSC + NT-3 group.D,BMSC + hydrogel group.E,BMSC + hydrogel + GFP group.F,BMSC+ hydrogel + NT-3 group.Figure 13 GFAP staining of the spinal cord injury area of SD rats in each group

圖14 各組SD 大鼠脊髓損傷區(qū)域神經(jīng)元、神經(jīng)纖維和星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目統(tǒng)計(jì)Note.The numbers of neurons, nerve fibers, and astrocytes were counted and analyzed.Sham group compared with the SCI model group,****P＜0.0001.BMSC + NT-3 group compared with the BMSC + hydrogel + NT-3 group, BMSC + hydrogel + NT-3 group compared with the BMSC + hydrogel + GFP group, #P＜0.05, ###P＜0.005, ####P＜0.0001.A, NeuN.B, NF-H.C, GFAP.Figure 14 Statistics of the number of neurons, nerve fibers and astrocytes in the spinal cord injury area of SD rats in each group

眾多證據(jù)表明,BMSC 在脊髓損傷的修復(fù)過程中通過分泌細(xì)胞因子、增加脊髓新生血管、促進(jìn)軸突再生重建受損脊髓,并且抑制氧自由基產(chǎn)生,可以控制炎癥、抑制凋亡、減少瘢痕形成[20-21]。 但只有一小部分骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能穿越血脊髓屏障[22],且存活率較低[22-24]。

圖15 各組大鼠主要臟器病理變化Note.The main organs of rat were fixed and sected for HE staining to observe their fine structure and morphology.A, Brain.B, Kidney.C, Spleen.D, Heart.E, Lung.F, Liver.Figure 15 Pathological changes of the major organs of rats in each group

免疫組織化學(xué)顯示,BMSC+hydrogels+NT-3 組與BMSC+NT-3 組相比神經(jīng)元、神經(jīng)纖維數(shù)目有顯著增多,星形膠質(zhì)細(xì)胞減少,膠質(zhì)瘢痕減少。 眾多證據(jù)表明水凝膠作為可降解組織工程學(xué)支架,為細(xì)胞和因子提供生長三維空間和緩釋載體,持續(xù)發(fā)揮促進(jìn)神經(jīng)再生的作用。 并橋接脊髓損傷區(qū)域,為神經(jīng)的長距離生長提供條件。 水凝膠具有良好的生物相容性和可降解性,并且可以根據(jù)脊髓損傷的區(qū)域制作成適當(dāng)?shù)慕Y(jié)構(gòu)[25]。 由于脊髓封閉性的結(jié)構(gòu)和損傷后壞死組織的溶解和清除導(dǎo)致空洞形成,創(chuàng)造一種可注射水凝膠并搭載細(xì)胞和因子在損傷后持續(xù)治療中具有可觀的前景。 BMSC+hydrogels+NT-3 組與BMSC+hydrogels+GFP 組相比神經(jīng)元、神經(jīng)纖維數(shù)目同樣增多,而星形膠質(zhì)細(xì)胞形成的膠質(zhì)瘢痕增生減少。 文獻(xiàn)證據(jù)表明,NT-3 通過抑制c-fos 和c-jun 表達(dá)減少脊髓神經(jīng)細(xì)胞凋亡；降低TNF-α、IL-1β,減少炎癥；并增強(qiáng)Trk C 在皮質(zhì)脊髓束表達(dá),維持運(yùn)動神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的存活,減少膠質(zhì)瘢痕形成,促進(jìn)神經(jīng)-肌突觸的成熟,促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞激活,從而促進(jìn)精細(xì)運(yùn)動功能的恢復(fù)[26]。 但在軸突再生過程然中,NT-3 吸收率低,亦不能持續(xù)作用。 而BMSC+hydrogels+GFP 組相比BMSC+hydrogels 組神經(jīng)元數(shù)目有一定的減少、星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目增加,神經(jīng)纖維數(shù)目無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 且BMSC+hydrogels+GFP 組行為學(xué)評分略差于BMSC+hydrogels 組,但細(xì)胞生長曲線說明基因修飾前后BMSC 的活性和增殖能力并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 由此可見細(xì)胞經(jīng)過慢病毒轉(zhuǎn)染GFP 后,病毒載體對于BMSC 的神經(jīng)修復(fù)作用可能有一定的影響,但NT-3對神經(jīng)修復(fù)的作用仍然在聯(lián)合治療組中顯著體現(xiàn)。這提示我們可進(jìn)一步改善新的病毒載體,例如腺病毒、腺相關(guān)病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒等,并嘗試探索更佳的基因修飾方式對細(xì)胞和因子進(jìn)行結(jié)合。

運(yùn)動行為學(xué)檢測中,各組大鼠治療后與SCI model 組相比,運(yùn)動行為學(xué)評分有不同程度的升高,BMSC+hydrogels+NT-3 組最為顯著。 可能是因?yàn)镹T-3 促進(jìn)了大鼠后肢精細(xì)運(yùn)動能力的恢復(fù),BMSC 增加損傷區(qū)域血供并進(jìn)一步促進(jìn)NT-3的分泌與表達(dá),hydrogels 填補(bǔ)脊髓缺損區(qū)域并持續(xù)釋放BMSC 和NT-3[27],共同促進(jìn)大鼠后肢運(yùn)動協(xié)調(diào)能力的恢復(fù)。 而這一點(diǎn)也在免疫組化染色神經(jīng)元、神經(jīng)纖維數(shù)和星形膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)目中得到了驗(yàn)證。

綜上所述,本研究在建立脊髓損傷大鼠模型基礎(chǔ)上,通過植入骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、神經(jīng)營養(yǎng)因子-3和水凝膠支架進(jìn)行治療,提升了大鼠后肢運(yùn)動水平,同時提升了損傷區(qū)域神經(jīng)元、神經(jīng)纖維數(shù)目,減少膠質(zhì)瘢痕形成,驗(yàn)證了其在神經(jīng)再生中的作用。這種細(xì)胞+因子+支架的綜合治療方式可作為脊髓損傷的一種潛在治療方案。 希望可以通過進(jìn)一步研究,加快臨床轉(zhuǎn)化,從而提升脊髓損傷患者的生活質(zhì)量。