婦科千金膠囊的抗炎作用與其調(diào)節(jié)NF-κB信號(hào)通路的關(guān)系

張?zhí)曳? 張凱強(qiáng) 李亞梅 粟倩 伊美瑾 龔云 張鵬 廖端芳

〔摘要〕 目的 研究婦科千金膠囊總浸膏（Fuke Qianjin capsule extract， FKE）體外抗炎活性及其抗炎作用機(jī)制。方法 采用MTT法檢測(cè)不同濃度FKE單獨(dú)使用和FKE疊加100 ng/mL脂多糖（lipopolysaccharide， LPS）使用時(shí)對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞（RAW 264.7）活性的影響;采用ELISA法檢測(cè)不同濃度FKE對(duì)LPS刺激后RAW 264.7細(xì)胞炎癥因子一氧化氮（NO）、白介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α （TNF-α）釋放的影響;通過RT-PCR法檢測(cè)不同濃度FKE對(duì)炎癥相關(guān)蛋白環(huán)氧合酶2 （COX-2）、IL-6、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）、TNF-α轉(zhuǎn)錄水平的影響;采用Western blot檢測(cè)不同濃度FKE對(duì)炎癥相關(guān)蛋白IκBα、iNOS表達(dá)的影響;利用激光共聚焦技術(shù)檢測(cè)FKE對(duì)NF-κB p65核轉(zhuǎn)位的影響;采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)不同濃度FKE對(duì)核轉(zhuǎn)錄因子-κB （nuclear factor-κB， NF-κB）的影響。結(jié)果 MTT測(cè)定結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，F(xiàn)KE在50～800 ？滋g/mL濃度范圍內(nèi)對(duì)RAW 264.7細(xì)胞活性的影響無顯著差異（P>0.05）; ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，F(xiàn)KE能明顯降低LPS刺激誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞NO含量，在400 ？滋g/mL濃度時(shí)，呈現(xiàn)出對(duì)IL-6、TNF-α的抑制作用（P<0.05）;Western blot檢測(cè)結(jié)果表明，F(xiàn)KE對(duì)IκBα的表達(dá)無影響，但對(duì)iNOS活性具有一定的抑制作用;激光共聚焦檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，F(xiàn)KE部分抑制p65核轉(zhuǎn)位;FKE在400 ？滋g/mL時(shí)，可明顯抑制NF-κB的激活（P<0.05）。結(jié)論 FKE具有明顯減輕細(xì)胞炎癥反應(yīng)的作用，其機(jī)制可能與FKE抑制炎癥通路關(guān)鍵信號(hào)分子NF-κB激活從而導(dǎo)致TNF-α、IL-6、iNOS等釋放減少有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕 婦科千金膠囊;炎癥因子;RAW 264.7;NF-κB

〔中圖分類號(hào)〕R285.5 ? ? ? 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A ? ? ? 〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2020.07.011

〔Abstract〕 Objective To evaluate the in vitro anti-inflammatory and action mechanism of anti-inflammatory effect of Fuke Qianjin Capsule extract （FKE）. Methods MTT assay was used to detect the effects of different concentrations of FKE alone and FKE plus 100 ng/mL lipopolysaccharide （LPS） on the activity of mouse macrophages RAW 264.7 cells. ELISA method was applied to examine the effects of FKE with different concentrations on the release of inflammatory cytokines， like nitric oxide （NO）， interleukin-6 （IL-6）， and tumor necrosis factor α （TNF-α） in RAW 264.7 cells after LPS stimulation. The effects of FKE with different concertrations on the transcription levels of inflammatory-related proteins， such as COX-2， IL-6， iNOS， and TNF-α were observed by RT-PCR. Western blot was used to analyze the effects of FKE with different concentrations on the expression of inflammatory-related proteins of IκBα and iNOS. The effect of FKE with different concentration on nuclear translocation of NF-κB p65 was detected by laser confocal technology. The effect of FKE with different concentrations on nuclear factor-kB （NF-κB） was detected by the dual-luciferase reporter system. Results MTT measurement showed that FKE had no significant effect on the activity of RAW 264.7 cells in the concentration of 50～800 μg/mL when compared with the control group （P>0.05）. ELISA detecation showed that FKE can significantly reduce the NO content of RAW 264.7 cells induced by LPS. FKE with 400 μg/mL showed an inhibitory effect on IL-6 and TNF-？琢 levels （P<0.05）; Western blot detection showed that FKE significently inhibited the activity of iNOS， but without effects on IκBα. Laser confocal analysis showed that FKE partially inhibited the nuclear transpotation of p65 when compared with the control group. FKE at 400 μg/mL could obviously inhibit the activation of NF-κB （P<0.05）. Conclusion FKE showed an obvious effect on alleviating inflammation， whose mechanism might be related to FKEs inhibition of activation of NF-κB， a key signaling molecule in the inflammatory pathway， resulting in reduced release of TNF-α， IL-6， iNOS， etc.

〔Keywords〕 Fuke Qianjin Capsules; inflammatory factors; RAW 264.7; NF-κB

婦科千金膠囊屬于國(guó)家中藥保護(hù)品種，是由千金拔、金櫻根、穿心蓮、單面針、功勞木、雞血藤、當(dāng)歸、黨參這八味中藥材組成的中藥復(fù)方制劑，目前收載于2015版《中華人民共和國(guó)藥典》一部[1]。近年臨床研究表明，婦科千金膠囊用于治療急慢性盆腔炎、慢性宮頸炎、老年性陰道炎、子宮內(nèi)膜炎、慢性附件炎等各種婦科炎癥療效顯著，此外，用于治療慢性前列腺炎、急慢性喉炎、流行性出血性結(jié)膜炎、牙周炎、非特異性潰瘍性結(jié)腸炎等其他多種炎癥也具有很好的療效[2]。婦科千金膠囊作用于炎癥的研究多集中于臨床療效觀察，對(duì)其具體作用機(jī)制研究較少。前期研究發(fā)現(xiàn)，婦科千金膠囊揮發(fā)油部位抗炎作用機(jī)制與抑制NF-κB通路的激活有關(guān)[3]，因此，本實(shí)驗(yàn)采用脂多糖（LPS）誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞炎癥模型，觀察婦科千金膠囊的抗炎作用與其調(diào)節(jié)NF-κB信號(hào)通路的關(guān)系。

1 材料

1.1 ?細(xì)胞株

小鼠單核巨噬細(xì)胞系RAW 264.7購(gòu)于中南大學(xué)湘雅醫(yī)院細(xì)胞中心。

1.2 ?主要藥物與試劑

婦科千金膠囊總浸膏（Fuke Qianjin capsule ex？鄄tract，F(xiàn)KE），由株洲千金藥業(yè)提供;DMEM高糖培養(yǎng)基（SH30022.01）、雙抗（SV30010）、胰蛋白酶（SH40003.01）、PBS磷酸鹽緩沖液（SH30256.01）均購(gòu)于美國(guó)Hyclone公司;胎牛血清FBS（S-FBS-SA-015）購(gòu)于德國(guó)Serana公司;SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（CW0022S）購(gòu)于康為世紀(jì)生物公司;FITC熒光二抗（70-GAR001）、小鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α）（70-EK2822/2）、小鼠白介素-6（IL-6）（70-EK2062/2）ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)于聯(lián)科生物技術(shù)公司;LPS（L2880）、4，6-二脒基-2苯基吲哚（DAPI，D9542）、四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT，M5655）、DMSO（D2650）均購(gòu)于美國(guó)Sigma公司;β-actin（CSB-MA000194）一抗購(gòu)于武漢華美生物工程有限公司;NO檢測(cè)試劑盒（S0021）購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)公司;α-tublin（AB7291）一抗購(gòu)于上海 Abcam公司;抗IκBα抗體（L35A5）、抗iNOS抗體（D6B6S）購(gòu)于Cell Signaling公司;羊抗兔二抗（SA00001-2）、羊抗鼠二抗（SA00001-1）購(gòu)于武漢三鷹生物有限公司;PVDF膜（ISEQ00010）、ECL顯影液（WBLUR0500）均購(gòu)于Millipore公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于天根公司;SYBRR染料法熒光定量PCR試劑盒（CW0957）購(gòu)于康為世紀(jì)生物公司;NF-？資B RE螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒（E8491）、pRL-SV40海腎熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒（E6911）、ViaFectTM（E4981）轉(zhuǎn)染試劑、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒（E1910）購(gòu)買于Promega公司。

1.3 ?主要儀器

AL104電子分析天平（Mettler Toledo公司）;Milli-Q Biocel超純水儀（Millipore公司）;CO2培養(yǎng)箱（Sheldon Manufacturing公司）;冷凍離心機(jī)（Eppendorf公司）;DMLB2多功能顯微鏡（LEICA公司）;多功能酶標(biāo)儀（Thermo Scientific公司）;TC20全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀、熒光定量PCR儀、蛋白印跡系統(tǒng)（Bio-Rad公司）;Tanon6200全自動(dòng)數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)（上海天能科技公司）。

2 方法

2.1 ?細(xì)胞培養(yǎng)

小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7用DMEM高糖培養(yǎng)基（含10%FBS以及1%雙抗）于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%左右，用含0.25%的胰酶消化傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 ?藥物制備

藥物用含0.1% FBS的DMEM配置成2 mg/mL的母液，LPS以PBS緩沖液配置成1 mg/mL，MTT以DMEM配置成5 mg/mL，均用0.2 μm微孔濾膜過濾，-20 ℃避光保存?zhèn)溆谩?shí)驗(yàn)組分別設(shè)置為：（1）對(duì)照組：生理鹽水處理。（2）模型組：僅100 ng/mL LPS刺激。（3）FKE組（100、200、400 μg/mL）。

2.3 ?MTT法檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞活性的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期RAW 264.7細(xì)胞消化后，以每孔1×104個(gè)細(xì)胞濃度種于96孔板中，培養(yǎng)貼壁，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%～90%后，取出孔板，棄去上清，藥物組分別加入濃度為50、100、200、400、800 μg/mL的FKE藥液，對(duì)照組僅加入含0.1% FBS的DMEM培養(yǎng)基，每組五個(gè)復(fù)孔，每孔200 μL。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，棄去上清，每孔加入0.5 mg/mLMTT 100 μL，培養(yǎng)箱中孵育4 h，棄去上清，加入150 μL DMSO，搖床振搖10 min，酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)量各孔吸光度值[4]。

2.4 ?藥物疊加LPS毒性實(shí)驗(yàn)

采用MTT法，評(píng)價(jià)藥物與LPS 100 ng/mL造模聯(lián)合使用時(shí)對(duì)細(xì)胞活力的影響。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期RAW 264.7細(xì)胞消化后，以每孔1×104個(gè)細(xì)胞濃度種于96孔板中，培養(yǎng)貼壁，按“2.2”實(shí)驗(yàn)組別給藥。孵育2 h后除正常組外其它各組均加入LPS使其終濃度為100 ng/mL，每組5個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，后續(xù)按“2.3”項(xiàng)下方法法做MTT檢測(cè)。

2.5 ?ELISA法檢測(cè)LPS刺激后細(xì)胞炎癥因子的釋放

將RAW 264.7細(xì)胞消化后以每孔1×105個(gè)細(xì)胞濃度種于6孔板中，培養(yǎng)貼壁。按“2.2”分組給藥孵育2 h后除對(duì)照組外其它各組均加入LPS使其終濃度為100 ng/mL，每組3個(gè)復(fù)孔，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，刺激3 h后，收集細(xì)胞上清2250×g離心10 min，取上清根據(jù)TNF-α ELISA試劑盒說明書進(jìn)行測(cè)量;刺激18 h后，收集細(xì)胞上清2250×g離心10 min，取上清根據(jù)IL-6 ELISA試劑盒說明書進(jìn)行測(cè)量;刺激24 h后收取細(xì)胞上清，2250×g離心10 min，取上清按照NO檢測(cè)試劑盒（Griess法）說明書進(jìn)行操作。

2.6 ?RT-PCR法檢測(cè)炎癥相關(guān)蛋白轉(zhuǎn)錄水平

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期RAW 264.7細(xì)胞消化傳代于60 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中并按“2.2”分組給藥。藥物孵育2 h后除正常組外其它各組均加入LPS使其終濃度為100 ng/mL，刺激6 h后，TRAzol法提取細(xì)胞總RNA，用Nanodrop紫外分光法檢測(cè)所提RNA濃度以及純度并采用瓊脂糖水平電泳檢測(cè)所提RNA完整性[5]。所得總RNA采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA于-20 ℃保存。按照染料法實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒說明書，進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)目的基因表達(dá)水平，結(jié)果分析采用2-△△Cq法來分析數(shù)據(jù)，PCR引物序列由上海生工合成，β-actin正向引物：CAACGAGCGGTTCCGATG，反向引物：GCCACAGGATTCCATACCCA;IL-6正向引物：CTGCAAGAGACTTCCATCCAG，反向引物：AGTGGTATAGACAGGTCTGTTGG;TNF-α正向引物：TCTACTCCCAGGTTCTCTTC，反向引物：GCAGAGAGGAGGTTGACTTT;iNOS正向引物：ACTACTAAATCTCTCTCCTCTCC，反向引物：TCTCTGCTCTCAGCTCCAA;COX-2正向引物：GCGACATACTCAAGCAGGAGCA，反向引物：AGTGGTAACCGCTCAGGTGTTG。溶解擴(kuò)增條件為：95 ℃持續(xù)3 min預(yù)變性;95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸10 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán);再于95 ℃持續(xù)10 s，65 ℃持續(xù)15 s，95 ℃持續(xù)10 s。

2.7 ?Western blot檢測(cè)炎癥相關(guān)蛋白的表達(dá)

實(shí)驗(yàn)設(shè)置對(duì)照組、模型組和FKE低、中、高劑量組（40、80、160 μg/mL），每組3皿細(xì)胞。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW 264.7細(xì)胞消化后在細(xì)胞培養(yǎng)箱中貼壁過夜。按上述分組加入含藥完全培養(yǎng)液（含0.1% FBS，1%雙抗DMEM），孵育2 h后，除對(duì)照組外，其他組均加入LPS使其終濃度為100 ng/mL，孵育30 min后收集蛋白檢測(cè)IκBα[6];孵育18 h后收集蛋白檢測(cè)iNOS[6]。孵育完成后，移除上清，用4 ℃預(yù)冷的PBS洗3遍后將培養(yǎng)皿置于冰上，向每皿細(xì)胞中加含1%磷酸酶混合抑制劑和含1% PSMF的RIPA強(qiáng)裂解液（現(xiàn)配）150 μL，冰上裂解30 min，細(xì)胞刮刀充分刮取細(xì)胞并收集后離心（9 000×g，10 min），取上清;BCA法蛋白定量后，取等量蛋白加上樣緩沖液在100 ℃煮沸6 min，電泳（10%分離膠用于IκBα，8%分離膠用于iNOS）;應(yīng)用三明治濕法轉(zhuǎn)膜;5%脫脂牛奶搖床輕微搖動(dòng)，室溫封閉1 h，一抗4 ℃孵育過夜（輕搖）;洗膜后，二抗室溫封閉1 h（輕搖）;再次洗膜加入顯影液曝光顯影。

2.8 ?激光共聚焦技術(shù)檢測(cè)NF-κB p65核轉(zhuǎn)位

采用激光共聚焦技術(shù)檢測(cè)NF-κB p65的核轉(zhuǎn)位情況[7]，實(shí)驗(yàn)設(shè)置正常組、模型組和FKE組（160 μg/mL），每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW 264.7細(xì)胞以1×105個(gè)/孔種于24孔板爬片上過夜貼壁，按實(shí)驗(yàn)分組給藥孵育2 h后加入LPS（使終濃度為100 ng/mL），刺激20 min后，取出爬片用預(yù)冷的PBS浸洗（5 min/次，3次）;用4%多聚甲醛固定爬片15 min，PBS浸洗;加入0.1% Triton-100室溫透膜20 min;PBS浸洗爬片，加入5% BSA（TBST配置）室溫封閉1 h;加入稀釋的抗p65一抗，4 ℃孵育過夜;TBST浸洗爬片后加入FITC標(biāo)記的熒光二抗37 ℃避光孵育1 h;TBST浸洗爬片后，加入1 μg/mL DAPI（PBS配置）避光孵育5 min染核;TBST浸洗（5 min/次，4次）;取出爬片，用含抗熒光淬滅劑封片液封片后在共聚焦顯微鏡下觀察（采用488 nm波長(zhǎng)的激光激發(fā)熒光二抗上標(biāo)記的FITC，采用358 nm波長(zhǎng)的激光激發(fā)染核的DAPI染料）[8]。

2.9 ?轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化

在96孔板中種上RAW 264.7細(xì)胞，每孔細(xì)胞液為100 μL，貼壁融合至60%左右，去除細(xì)胞上清，加入100 μL含1% FBS且不含抗生素的DMEM培養(yǎng)基;設(shè)置轉(zhuǎn)染試劑（μL）∶轉(zhuǎn)染內(nèi)參質(zhì)粒pRL-SV40（ng）配比分別為1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1，用DMEM（無血清無雙抗）配好質(zhì)粒終濃度10 ng/mL后室溫靜置20 min;通過控制加入體積（5、8、11、14、17 μL）分別向每孔中加入50、80、110、140、170 ng質(zhì)粒量的轉(zhuǎn)染復(fù)合物;置于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，棄去細(xì)胞上清，PBS清洗后，于多功能酶標(biāo)儀中進(jìn)行熒光值測(cè)定。

2.10 ?雙熒光素酶報(bào)告基因評(píng)價(jià)NF-κB激活抑制作用

在RAW 264.7細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染條件優(yōu)化后，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行NF-κB RE質(zhì)粒以及pRL-SV40海腎熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)設(shè)置正常組、模型組和FKE低、中、高組（100、200、400 μg/mL）給藥，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。將RAW 264.7細(xì)胞接種在96孔板中，每孔細(xì)胞液為100 μL，貼壁融合至60%左右，去除細(xì)胞上清，加入100 μL不含抗生素的DMEM培養(yǎng)基（含1% FBS）。

共轉(zhuǎn)染NF-κB RE螢火蟲熒光素酶質(zhì)粒以及pRL-SV40內(nèi)參海腎熒光素酶粒（比例為50∶1）于RAW 264.7細(xì)胞，置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育24 h。給藥后將細(xì)胞置于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1.5 h后，除正常組外，其他各組均加入LPS使其終濃度為100 ng/mL，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中再培養(yǎng)6 h[9]。取出細(xì)胞，棄去上清，PBS清洗后，用Promega雙熒光報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒在多功能酶標(biāo)儀中檢測(cè)熒光強(qiáng)度。

3 結(jié)果

3.1 ?FKE對(duì)RAW 264.7細(xì)胞活性影響

采用MTT法初步篩查FKE對(duì)RAW 264.7細(xì)胞的細(xì)胞毒性，如圖1a所示，用50～800 μg/mL FKE處理后，與對(duì)照組相比，細(xì)胞活性未被抑制（P>0.05），說明在此濃度范圍內(nèi)，藥物無細(xì)胞毒性;圖1b表明，F(xiàn)KE疊加LPS使用時(shí)在100～400 μg/mL劑量下均未出現(xiàn)細(xì)胞毒性（P>0.05）。故后續(xù)抗炎活性實(shí)驗(yàn)可在400 μg/mL濃度下進(jìn)行。

3.2 ?FKE對(duì)LPS刺激后細(xì)胞炎癥因子釋放的影響 ? 采用ELISA的方法對(duì)藥物的抗炎活性進(jìn)行初步檢測(cè)，如圖2，結(jié)果表明：在100 ng/mL LPS刺激后，NO、IL-6和TNF-α的胞外釋放均顯著增加，與模型組相比，F(xiàn)KE在100 μg/mL能明顯降低LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞產(chǎn)生的NO的含量（P<0.01），在高劑量400 μg/mL時(shí)，F(xiàn)KE呈現(xiàn)出對(duì)IL-6和TNF-α的抑制作用（P<0.05）。

3.3 ?FKE對(duì)炎癥相關(guān)蛋白轉(zhuǎn)錄水平的影響

為了驗(yàn)證FKE在RAW 264.7細(xì)胞系中的體外抗炎效果，RT-PCR用于檢測(cè)FKE對(duì)炎癥相關(guān)蛋白COX-2、IL-6、iNOS、TNF-α轉(zhuǎn)錄水平的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在RAW 264.7細(xì)胞中，F(xiàn)KE能有效降低由LPS刺激引起的炎癥相關(guān)因子及蛋白（COX-2、IL-6、iNOS）的高表達(dá)（P<0.05，P<0.01），且呈現(xiàn)出良好的劑量關(guān)系;同時(shí)，我們觀察到，F(xiàn)KE反而升高了TNF-α的轉(zhuǎn)錄水平，其具體原因有待進(jìn)一步研究。

3.4 ?Western blot法檢測(cè)FKE對(duì)炎癥相關(guān)蛋白的影響

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中（圖4）得知，僅給予LPS刺激后，IκBα的含量顯著降低（P<0.01），說明模型成功，但FKE的作用不明顯（P>0.05）;對(duì)照組中，無LPS刺激下，細(xì)胞內(nèi)幾乎不表達(dá)iNOS，而在LPS刺激后，細(xì)胞內(nèi)iNOS的表達(dá)顯著升高（P<0.01），說明模型成功。與模型組相比，F(xiàn)KE組對(duì)iNOS具有一定的抑制作用（P<0.05）。

3.5 ?激光共聚焦檢測(cè)FKE對(duì)NF-κB p65轉(zhuǎn)核的影響

采用激光共聚焦顯微鏡觀察給藥后p65的轉(zhuǎn)核情況，由圖5可知，對(duì)照組在無LPS刺激下，p65主要分布于細(xì)胞質(zhì)中，而與對(duì)照組比較，LPS刺激組可觀察到明顯的p65轉(zhuǎn)核。FKE組中p65有大部分分布在細(xì)胞質(zhì)中，說明FKE部分抑制了p65的轉(zhuǎn)核。

3.6 ?FKE對(duì)NF-κB的激活抑制作用

圖6中NF-κB激活程度由螢火蟲熒光素酶數(shù)值與海腎熒光素酶數(shù)值比值表示。在LPS刺激后，模型組相比對(duì)照組NF-κB顯著激活（P<0.01）;FKE組NF-κB激活被抑制，當(dāng)給藥濃度為400 μg/mL時(shí)，NF-κB激活被抑制的程度與模型組有明顯差異（P<0.05）。

4 討論

在正常生理或異常病理過程中，“炎性機(jī)制”對(duì)盆腔炎等婦科疾病均起了重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，女性生殖系統(tǒng)在排卵、受精著床、月經(jīng)等過程中，存在白細(xì)胞浸潤(rùn)并釋放PGE2、IL-6、炎癥趨化因子等多種細(xì)胞因子，以達(dá)到修復(fù)和重塑卵巢表面上皮、維持胎兒的發(fā)育以及促進(jìn)子宮內(nèi)膜的脫落、重塑及增殖等作用[10]。然而，當(dāng)生殖系統(tǒng)受到支原體、衣原體或者細(xì)菌的感染時(shí)，生殖道或周圍組織上皮細(xì)胞首先成為靶向感染目標(biāo)，其通過分泌炎癥趨化因子誘導(dǎo)機(jī)體天然免疫應(yīng)答以抵抗感染，而這種保護(hù)方式同時(shí)也誘導(dǎo)了炎癥的發(fā)生[11]。持續(xù)性炎性因子的釋放和炎癥相關(guān)細(xì)胞的激活損傷卵巢、輸卵管和子宮等生殖系統(tǒng)上皮表面，從而導(dǎo)致周圍形成組織粘連、結(jié)締組織增生、瘢痕形成以及盆腔充血和積液，進(jìn)而促進(jìn)盆腔炎的形成和發(fā)展[12]。本實(shí)驗(yàn)采用LPS作為誘發(fā)因素刺激RAW 264.7細(xì)胞，檢測(cè)FKE對(duì)細(xì)胞炎癥因子釋放的影響，結(jié)果表明，F(xiàn)KE能顯著降低LPS誘導(dǎo)的COX-2、TNF-α、IL-6、NO的釋放，說明FKE不僅能調(diào)節(jié)細(xì)胞的免疫功能，而且可以抑制炎性因子的浸潤(rùn)，進(jìn)而達(dá)到保護(hù)生殖系統(tǒng)損傷等作用。

以往研究表明，盆腔炎等婦科疾病中子宮內(nèi)膜細(xì)胞炎癥相關(guān)因子的表達(dá)受NF-κB通路的調(diào)控，NF-κB通路的激活是下游促炎因子過量釋放的重要原因[13]。NF-κB是調(diào)節(jié)細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵因子之一，活化后的NF-κB可直接啟動(dòng)和調(diào)節(jié)眾多參與炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，調(diào)控大量細(xì)胞因子、黏附分子的表達(dá)。同時(shí)，NF-κB又能夠被這些細(xì)胞因子進(jìn)一步活化，這樣在它們之間構(gòu)成了正負(fù)反饋通路并形成相互調(diào)節(jié)的作用力，從而誘使炎癥反應(yīng)進(jìn)一步發(fā)展導(dǎo)致組織損傷[14]。其中，NF-κB的激活需要兩個(gè)重要活性因子，即IκBα和p65。當(dāng)細(xì)菌等感染源侵襲子宮內(nèi)膜時(shí)，上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞等內(nèi)膜細(xì)胞首先受到侵襲，細(xì)菌等通過LPS作用于內(nèi)膜細(xì)胞膜上的MD2蛋白和膜受體TLR4，形成LPS-MD2/TLR4復(fù)合體，激發(fā)髓性分化蛋白88（MyD88）依賴的信號(hào)傳遞，激活NF-κB?；罨腘F-κB與IκBα解離后轉(zhuǎn)位入核與COX-2 等靶基因上的AP-1（Activator protein 1，AP-1）位點(diǎn)結(jié)合，導(dǎo)致TNF-α、IL-6等炎癥細(xì)胞因子的大量生成，啟動(dòng)炎癥應(yīng)激級(jí)聯(lián)事件[15]。在本研究中，F(xiàn)KE雖然對(duì)LPS刺激后IκBα蛋白水平無影響，但FKE可顯著抑制NF-κB p65亞基的核轉(zhuǎn)位，說明FKE可抑制NF-κB激活，下調(diào)NF-κB介導(dǎo)的下游因子轉(zhuǎn)錄來抑制iNOS表達(dá)和NO產(chǎn)生，進(jìn)而發(fā)揮抗炎作用。若抑制NF-κB通路的活化，能有效阻斷COX-2/PGE2與IL-6、IL-8等炎癥因子間的分子信號(hào)傳遞，阻止炎癥反應(yīng)的級(jí)聯(lián)擴(kuò)大及其對(duì)生殖系統(tǒng)的損傷，抑制PID以及后遺癥的進(jìn)一步發(fā)展，與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果一致[16]。

婦科千金膠囊作為市場(chǎng)上應(yīng)用最廣泛的婦科用藥之一，具有廣泛的應(yīng)用前景和社會(huì)效益，本研究結(jié)果為深入探討婦科千金膠囊的抗炎機(jī)制提供了新的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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