腦泰方對腦出血急性期大鼠神經(jīng)細胞過氧化損傷的干預作用及機制研究

曾勁松 李弘 廖君 劉林 黃娟 喻堅柏 葛金文

〔摘要〕 目的 研究腦泰方對腦出血急性期大鼠神經(jīng)細胞過氧化損傷的干預作用及其機制。方法 采用自體血注射法構建SD大鼠腦出血模型，隨機分為假手術組、模型組、N-乙酰半胱氨酸（NAC）對照組、腦泰方常規(guī)劑量（NTFC）組、腦泰方高劑量（NTFH）組，各組于造模并給藥7 d后取材;采用HE染色觀察腦組織病理形態(tài)，采用Zea Longa 5級評分法進行大鼠神經(jīng)功能缺失評分，采用生物試劑盒檢測病灶腦組織脂質(zhì)活性氧（lipid-ROS）含量，采用免疫組化及Western blot技術檢測谷胱甘肽過氧化物酶-4（GPX-4）及鐵死亡標志物環(huán)氧合酶-2（COX-2）的表達。結(jié)果 與假手術組比較，模型組大鼠腦組織病理損傷明顯加重，神經(jīng)功能缺失評分明顯升高，病灶腦組織GPX-4表達明顯降低，lipid-ROS含量、COX-2表達明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01）;與模型組比較：NAC組及腦泰方各劑量組病理損傷明顯減輕，神經(jīng)功能缺失評分明顯降低，腦組織GPX-4表達明顯升高，lipid-ROS含量、COX-2表達明顯降低（P<0.05，P<0.01）;NTFH組GPX-4表達與NTFC組無顯著差異，但NTFH組Lipid-ROS含量及COX-2表達水平均明顯低于NTFC組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結(jié)論 腦泰方可提高腦出血急性期大鼠GPX-4表達，減輕神經(jīng)細胞的過氧化損傷，其干預機制和效果與鐵死亡生化過程及其抑制劑一致，且腦泰方高劑量的干預效果優(yōu)于常規(guī)劑量。

〔關鍵詞〕 腦出血;過氧化損傷;鐵死亡;腦泰方;神經(jīng)保護

〔中圖分類號〕R285.6 ? ? ? 〔文獻標志碼〕A ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2020.07.008

〔Abstract〕 Objective To study the intervention effect and mechanism of Naotaifang on neuronal peroxidation injury in rats with acute intracerebral hemorrhage. Methods The model of cerebral hemorrhage in SD rats was established by autogenous blood injection， which was divided into a sham operation group， a model group， a N-acetylcysteine （NAC） control group， a Naotaifang conventional dose （NTFC） group and a Naotaifang high dose （NTFH） group. Materials were taken in 7 days after model establishment. HE staining was used to observe the pathological morphology of brain tissue， and Zea longa 5 grade scoring method was used to assess the neurological deficit of rats. Lipid-ROS was detected by biochemical kit. The expression of glutathione peroxidase-4 （GPX-4） and ferroptosis marker cyclooxygenase-2 （COX-2） were detected by immunohistochemistry and Western blot. Results Compared with the sham operation group， the pathological damage of brain tissue in the model group was significantly aggravated， and the neurological deficit score was significantly increased. The expression of GPX-4 was significantly decreased， and the lipid-ROS content and the expression of COX-2 were significantly increased. The difference was statistically significant （P<0.01）. Compared with the model group， the pathological damage of NAC group and Naotaifang groups was significantly alleviated， and the neurological deficit score was significantly decreased. The GPX-4 expression in brain tissue was significantly increased， and the lipid-ROS content and COX-2 expression were significantly decreased （P<0.05， P<0.01）. There was no significant difference in GPX-4 expression between the NTFC group and the NTFH group， but the lipid-ROS content and COX-2 expression levels were significantly lower than the NTFC group. The difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion Naotaifang can improve the expression of GPX-4 in rats with acute ICH， so as to reduce the peroxidation injury of nerve cells. Its intervention mechanism and effect are consistent with the biochemical process of ferroptosis and its inhibitor， and the intervention effect of Naotaifang in high dose is better than that in conventional dose.

〔Keywords〕 intracerebral hemorrhage; peroxidation injury; ferroptosis; Naotaifang; neuroprotection

腦出血（intracerebral hemorrhage， ICH）是一種高致殘率和致死率的常見腦血管疾病。大量ICH患者遺留嚴重的神經(jīng)功能障礙，給家庭和社會帶來沉重的負擔。谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase-4， GPX-4）是細胞內(nèi)抗過氧化損傷的關鍵調(diào)控分子。研究表明，GPX-4功能失調(diào)將導致細胞內(nèi)脂質(zhì)活性氧（lipid-ROS）蓄積，從而導致細胞發(fā)生鐵死亡[1-2]。鐵死亡是一種以細胞內(nèi)鐵超載為主要誘發(fā)因素，以細胞抗氧化能力耗竭而致lipid-ROS累積為特征的新型細胞死亡方式[3]。研究證實，ICH后血腫周圍存在神經(jīng)細胞鐵死亡病理改變，鐵死亡抑制劑可減輕繼發(fā)性腦損傷[4-5]。因此，探索有效的藥物抑制神經(jīng)細胞鐵死亡，成為ICH治療的新靶向。腦泰方是本研究團隊負責人葛金文教授防治中風的專利處方（專利號：ZL201110178359.4）。前期研究表明，腦泰方可提高血紅蛋白誘導的大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元細胞抗氧化損傷能力[6]，并可調(diào)節(jié)腦缺血大鼠神經(jīng)細胞鐵代謝而發(fā)揮神經(jīng)保護作用[7-8];可降低血管內(nèi)皮細胞脂質(zhì)過氧化程度而發(fā)揮抗動脈粥樣硬化作用[9]。此基礎上，本研究通過對ICH急性期大鼠腦組織病理形態(tài)觀察并進行神經(jīng)功能缺失評分，同步檢測抗氧化分子GPX-4和過氧化損傷標志分子lipid-ROS以及鐵死亡標志分子環(huán)氧合酶-2（COX-2）的變化，并以鐵死亡抑制劑N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）為陽性對照藥物，進一步探討腦泰方對ICH大鼠神經(jīng)細胞過氧化損傷的干預作用及其機制。

1 材料

1.1 ?動物

健康清潔級SD大鼠，體質(zhì)量200～250 g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物許可證號：SCXK（湘）2016-0002。大鼠飼養(yǎng)于SPF動物實驗中心，溫度22～24 ℃，濕度50%～60%，純凈水及高溫高壓滅菌飼料飲食，各組單籠喂養(yǎng)，12 h晝夜節(jié)律交替。本研究經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院實驗動物倫理委員會審核通過（批準編號：ZYFY20190522），實驗方案考慮安全和公平原則。

1.2 ?藥物

腦泰方由黃芪40 g，川芎10 g，僵蠶15 g，地龍15 g組成，原藥材購于湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院（湖南春光總匯現(xiàn)代中藥有限公司，貨號分別為：ZY1359、ZY1448、ZY4834、ZY3917，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院中藥飲片檢驗室鑒定驗收）。將中藥置于煎藥器中，加10倍量蒸餾水，室溫浸泡30 min后，武火煮沸，文火繼續(xù)煎煮60 min，煎煮完畢后過濾;濾渣繼續(xù)加8倍量水，武火煮沸后，文火繼續(xù)煎煮40 min，過濾;合并兩次濾液，轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮（80 r/min，70 ℃），濃縮至流浸膏，再轉(zhuǎn)移至真空干燥箱中，制成浸膏粉，每克浸膏粉相當于4 g生藥（操作由湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院制劑室完成）。臨用時用0.9%氯化鈉溶液調(diào)配成2 g/mL濃度。陽性對照藥NAC購于美國Sigma公司，貨號：WXBCOO11V。

1.3 ?主要試劑

lipid-ROS試劑盒（南京建成生物工程研究所，貨號：E004-1-1）;GPX-4一抗（貨號：PAB31461）、COX-2一抗（貨號：PAB31107）均購自于武漢貝茵萊生物科技有限公司;poly-HRP anti Rabbit IgG（美國GBI公司，貨號：E-IR-R211）; Protein G Magnetic Beads（美國Cell Signaling 公司，貨號：9006S）;蛋白質(zhì)Marker（美國Thermo公司，貨號：26634）;十二烷基硫酸鈉（貨號：151-21-3）、TEMED（貨號：110-18-9）、過硫酸銨（貨號A6761）均購自于美國Sigma公司;PVDF 轉(zhuǎn)移膜（貨號：IPVH00010）、化學發(fā)光試劑（貨號：WBKLS0010）均購自于美國Millipore公司;Tween-20（美國Amresco公司，貨號：P-1379）。

1.4 ?主要儀器

WP8025型腦立體定位儀（瑞沃德生命科技有限公司，深圳）;NIKON Eclipse ci型倒置顯微鏡（OLYMPUS公司，日本）;AUW120D型精密電子天平（Shimadzu公司，日本）;DW-HL-3985型美菱超低溫冰箱（中科美菱低溫科技股份有限公司）;Z32HK型臺式高速冷凍離心機（英斯特科技有限公司，杭州）;KS400型圖像分析儀（ZISSE公司，德國）;Tanon-5200型全自動化學發(fā)光分析儀（上海天能科技有限公司）。

2 方法

2.1 ?造模、分組和取材

2.1.1 ?造模 ?SD大鼠經(jīng)水合氯醛腹腔注射麻醉，俯臥位固定于腦立體定位儀上（前囟和后囟處于同一水平）。常規(guī)備皮、消毒，參照文獻方法[10]，沿前囟旁開3 mm處作10 mm縱行切口，切開頭皮及骨膜后暴露前囟，在前囟后1 mm、旁開3 mm處用微型鉆作直徑1 mm的小孔。消毒鼠尾，距末端0.5 cm處剪斷，取自體血50 ？滋L，經(jīng)定位儀上的微量注射器沿所鉆骨孔進針6 mm，即為右側(cè)尾狀核的位置。在10 min內(nèi)注入自體血50 ？滋L，注射完畢后停針5 min，緩慢退針，縫合切口。假手術組模型：制備步驟同上，不注入自體血，向大鼠尾狀核注入生理鹽水50 ？滋L。造模后3 h根據(jù)Zea Longa 5級評分法[11]進行模型評價并持續(xù)觀察至造模后24 h，評分1～3分判定為造模成功。出現(xiàn)以下情形予以剔除：取腦組織標本時發(fā)現(xiàn)蛛網(wǎng)膜下腔出血者、未到實驗取材時間死亡者，因上述原因致實驗動物數(shù)量不足時，通過隨機抽樣原則及時補齊。

2.1.2 ?分組 ?符合以上ICH模型標準的60只大鼠分為5組，每組12只。分別為：假手術組、模型組、N-乙酰半胱氨酸（NAC）組、腦泰方常規(guī)劑量（NTFC）組、腦泰方高劑量（NTFH）組，各組分別于造模并給藥干預7 d后取材。

2.1.3 ?給藥 ?以60 kg成年人每日劑量80 g生藥為依據(jù)，按體表面積換算，NTFC組給予2倍成人劑量，即20 g生藥/kg，NTFH組給與3倍成人劑量，即30 g生藥/kg，按所調(diào)配的浸膏粉濃度，分別為10、15 mL/kg;NAC組予以等效劑量NAC，5 g NAC用生理鹽水稀釋成100 mL，按200 mg/kg腹腔注射;腦出血模型組和假手術組均給予等量生理鹽水灌胃;各組大鼠于造模后24 h開始給藥，每日1次，連續(xù)給藥7 d。

2.1.4 ?取材 ?于各組預定時間點將大鼠作常規(guī)灌注固定，斷頭取材。以注血針道為中心，冠位作厚約5 mm的切片標本，用4%多聚甲醛固定1 h，置于75%的乙醇中于零度以下冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 ?指標檢測

2.2.1 ?腦組織病理學觀察 ?取大鼠腦組織，常規(guī)制片后，行HE常規(guī)染色，光鏡下觀察腦組織病理改變。

2.2.2 ?神經(jīng)功能缺失評分 ?根據(jù)Zea Longa 5級評分法評定[11]。0分：無神經(jīng)損傷癥狀;1分：不能完全伸展對側(cè)前爪;2分：向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈;3分：向?qū)?cè)傾倒;4分：不能自發(fā)行走，意識喪失。

2.2.3 ?lipid-ROS含量 ?腦組織勻漿液制備：按腦組織重量（g）：體積（mL）=1∶9的比例加入9倍體積的生理鹽水，冰水浴條件下機械勻漿，2 500 r/min，離心10 min，取上清液按照試劑盒要求加樣進行顯色反應并測定OD值。Lipid-ROS計算：以標準物的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，在坐標紙上繪出標準曲線，根據(jù)樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度;再乘以稀釋倍數(shù)，即為lipid-ROS的實際濃度。

2.2.4 ?GPX-4、COX-2蛋白表達測定 ?免疫組化：嚴格按照試劑盒或說明書操作，制作封片后置于顯微鏡下觀察，使用IPP圖像分析儀軟件分析觀測的圖像，隨機選取4個高倍視野進行蛋白平均光密度值測定，作為蛋白的表達量。Western blot：采用RIPA快速裂解液處理組織碎片后進行蛋白提取和定量。配取5%濃縮膠12%分離膠并插好梳子，常規(guī)配膠與電泳（濃縮膠80 V，40 min，分離膠120 V，50 min）后進行轉(zhuǎn)膜，90 V轉(zhuǎn)膜50 min，常溫封閉2 h后按說明書稀釋抗體，GPX-4（1∶1 000）、COX-2（1∶1 000）、β-actin（1∶1 000）一抗與膜4 ℃孵育過夜，洗膜后加入HRP標記的二抗（1∶10 000），與膜室溫孵育1 h，洗膜后用ECL化學發(fā)光試劑盒顯影，通過TANON GIS軟件讀取相關條帶灰度值，各蛋白目的條帶灰度值與β-actin條帶灰度值的比值作為各蛋白質(zhì)的相對表達水平。

2.3 ?統(tǒng)計學方法

各組所得計量數(shù)據(jù)采用“x±s”表示，用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計分析，采用One-Way ANOVA檢驗比較各組間的顯著性差異，其中方差齊者采用LSD檢驗，方差非齊者采用Dunnetts T3檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義，P<0.01表示差異有顯著統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 ?各組大鼠腦組織病理形態(tài)改變

HE染色結(jié)果顯示：假手術組大鼠術區(qū)腦組織未見明顯病理損傷，神經(jīng)細胞排列緊密整齊，細胞體大、胞核淡染、大而圓;模型組大鼠血腫周圍腦組織出現(xiàn)明顯水腫、壞死，細胞排列不規(guī)則、疏松，細胞外間隙增大，呈網(wǎng)狀結(jié)構，大量炎性細胞浸潤;NAC組及腦泰方各劑量組較模型組病理損傷明顯減輕。見圖1。

3.2 ?各組大鼠神經(jīng)功能缺失評分

與假手術組比較，模型組大鼠的神經(jīng)功能缺失評分明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）;與模型組比較，NAC組及腦泰方各劑量組大鼠的神經(jīng)功能缺失評分均明顯降低（P<0.05，P<0.01）;NTFH組與NAC組神經(jīng)功能缺失評分明顯低于NTFC組（P<0.05）。結(jié)果見圖2。

3.3 ?各組大鼠腦組織lipid-ROS含量

與假手術組比較，模型組大鼠病灶腦組織lipid-ROS含量明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）;與模型組比較，NAC組及腦泰方各劑量組lipid-ROS含量明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01）;NTFH組與NAC組lipid-ROS含量明顯低于NTFC量組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05，P<0.01）。結(jié)果見圖3。

3.4 ?各組大鼠GPX-4、COX-2免疫組化檢測

免疫組化觀察顯示，GPX-4與COX-2主要在細胞質(zhì)中表達，蛋白平均光密度檢測顯示：與假手術組比較，模型組大鼠病灶腦組織GPX-4表達明顯降低，COX-2表達明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01）;與模型組比較，NAC組及腦泰方各劑量組GPX-4表達明顯升高，COX-2表達明顯降低（P<0.05，P<0.01）;NAC組GPX-4含量高于NTFC組（P<0.01）;NTFH組GPX-4含量與NTFC組差異無統(tǒng)計學意義（P<0.05）;NAC組與NTFH組COX-2表達均明顯低于NTFC組（P<0.05）。結(jié)果見圖4-5。

3.5 ?Western blot檢測GPX-4、COX-2蛋白表達

與假手術組比較，模型組大鼠病灶腦組織GPX-4表達明顯降低，COX-2表達明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01）;與模型組比較，NAC組及腦泰方各劑量組GPX-4表達明顯升高，COX-2表達明顯降低（P<0.05，P<0.01）;NTFH組和NAC組GPX-4表達與NTFC組無顯著差異（P>0.05），而其COX-2表達明顯低于NTFC組（P<0.05）。結(jié)果見圖6-7。

4 討論

中醫(yī)藥防治中風歷史悠久，療效肯定[12]。氣虛血瘀、痰瘀阻絡為ICH的主要病機之一[13]。臨床研究表明，益氣活血中藥復方可促進ICH患者顱內(nèi)血腫的吸收，減輕腦水腫，改善神經(jīng)功能缺損，提高臨床療效[14]。腦泰方中黃芪大補脾胃之氣，為君藥;川芎活血行氣，是為臣藥;地龍、僵蠶通經(jīng)活絡、化痰熄風，兩者均為佐藥;全方共奏益氣活血、化痰通絡之效，對證“虛、痰、瘀”為核心的中醫(yī)病機。本研究通過觀察ICH急性期大鼠腦組織病理學改變，并進行神經(jīng)功能缺失評分，結(jié)果顯示：NTFC與高劑量腦泰方均可明顯減輕大鼠腦組織腦水腫、壞死程度，減少神經(jīng)元變性死亡，降低神經(jīng)功能缺失評分，這與前期腦泰方在缺血性腦損傷中的研究結(jié)果一致[7-8]。進一步分析發(fā)現(xiàn)，高劑量腦泰方對大鼠腦組織病理損傷和神經(jīng)功能缺失評分的改善作用優(yōu)于腦泰方常規(guī)劑量，說明高劑量腦泰方的療效優(yōu)于其常規(guī)劑量腦泰方的療效。

自2012年命名以來，鐵死亡被證實與神經(jīng)退行性病變、腫瘤、腦卒中等疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關[15]。ICH后血腫的融解導致神經(jīng)細胞鐵超載，細胞內(nèi)超載的鐵離子通過fenton反應產(chǎn)生大量活性氧自由基，使細胞內(nèi)谷胱甘肽氧化還原體系中GPX-4大量消耗，細胞有氧代謝產(chǎn)生的脂質(zhì)氧化物不能被GPX-4清除，繼而以類似Fenton反應的方式進一步產(chǎn)生大量lipid-ROS而使細胞發(fā)生鐵死亡。研究證實，在ICH急性期抑制神經(jīng)細胞鐵死亡可發(fā)揮持久的腦保護效應[16]，GPX-4是ICH后神經(jīng)細胞鐵死亡的關鍵調(diào)控分子，lipid-ROS是鐵死亡發(fā)生的直接原因，COX-2可作為ICH后神經(jīng)細胞鐵死亡的標志物[5，17]。本研究結(jié)果顯示，ICH模型組大鼠病灶腦組織GPX-4表達明顯降低，lipid-ROS含量明顯升高，說明ICH急性期大鼠腦組織GPX-4被大量消耗，lipid-ROS大量累積，導致神經(jīng)細胞發(fā)生過氧化損傷;與此同時，神經(jīng)細胞鐵死亡標志物COX-2表達明顯升高，研究結(jié)果與前期研究證實的鐵死亡生物學過程吻合。因此，探索有效的藥物減輕神經(jīng)細胞過氧化損傷而抑制細胞鐵死亡，是ICH潛在的治療靶向。

研究表明，抗氧化劑NAC可上調(diào)胱氨酸/谷氨酸逆向轉(zhuǎn)運體的活性，提高細胞抗氧化能力而抑制鐵死亡[18]。本研究以NAC為陽性對照藥物，結(jié)合腦泰方前期研究基礎，進一步探討腦泰方對ICH大鼠神經(jīng)細胞過氧化損傷的保護作用及其機制。研究結(jié)果顯示：腦泰方常規(guī)劑量和高劑量均可明顯提高GPX-4的表達水平，降低lipid-ROS含量和COX-2表達，其作用與鐵死亡抑制劑NAC一致;腦泰方高劑量組GPX-4的表達與NTFC組無顯著差異，而其Lipid-ROS含量及COX-2表達水平均明顯低于與常規(guī)劑量組，說明大劑量的腦泰方還可通過其他途徑增強神經(jīng)細胞的抗氧化損傷能力。

綜上所述，腦泰方可通過提高神經(jīng)細胞抗氧化體系中GPX-4的表達，減少lipid-ROS的累積，從而減輕神經(jīng)細胞過氧化損傷，其作用機制與鐵死亡抑制劑一致，提示腦泰方可抑制神經(jīng)細胞鐵死亡而發(fā)揮神經(jīng)保護作用。高劑量腦泰方的作用優(yōu)于常規(guī)劑量，推測腦泰方對鐵死亡其他信號分子亦具有調(diào)控作用，如前期研究證實腦泰方可降低腦組織內(nèi)興奮性氨基酸毒性而發(fā)揮腦保護作用[19]，與新近研究證實細胞內(nèi)過多谷氨酸鹽的分解可促進lipid-ROS的產(chǎn)生而誘發(fā)鐵死亡相吻合[20]，其多靶點神經(jīng)保護機制有待進一步研究。

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