枸杞子加丹參對RCS(rdy-/-,p-/-)大鼠視網(wǎng)膜勻漿中cAMP、cGMP含量的影響

徐劍 周亞莎 彭俊 潘坤 吳權龍 李建超 劉悅 王英 彭清華

〔摘要〕 目的 探討枸杞子加丹參對視網(wǎng)膜色素變性模型大鼠RCS（rdy-/-， p-/-）視網(wǎng)膜勻漿中cAMP含量、cGMP含量以及cAMP/cGMP值的影響。方法 實驗動物隨機分為5組：空白組為RCS（rdy+/+， p+/+）大鼠8只，模型組、枸杞子組、丹參組及枸杞子加丹參組（杞參組）為RCS（rdy-/-， p-/-）大鼠各8只，每組均雌雄各半。5組大鼠分別給予生理鹽水、生理鹽水、枸杞子、丹參、枸杞子加丹參灌胃。灌胃28 d后，ELISA法測定視網(wǎng)膜組織勻漿中cAMP、cGMP含量及cAMP/cGMP值。結果 與空白組比較，模型組大鼠視網(wǎng)膜勻漿組織中cAMP、cGMP含量及cAMP/cGMP值均增高，差異有顯著統(tǒng)計學意義（P<0.01）;與模型組比較，杞參組視網(wǎng)膜勻漿組織中cAMP、cGMP含量及cAMP/cGMP值均明顯降低，差異有顯著統(tǒng)計學意義（P<0.01）。結論 “補虛活血”代表中藥枸杞子加丹參可以降低RCS（rdy-/-，p-/-）大鼠視網(wǎng)膜組織勻漿中cAMP、cGMP含量及cAMP/cGMP值，改善其“虛”證指標。

〔關鍵詞〕 視網(wǎng)膜色素變性;枸杞子;丹參;RCS大鼠;cAMP;cGMP

〔中圖分類號〕R276.7 ? ? ? 〔文獻標志碼〕A ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2020.07.002

〔Abstract〕 Objective To study the effects of Fructus Lycii and Radix Salviae Miltiorrhizae on the content of cAMP， cGMP and cAMP/cGMP retinal homogenate of RCS （rdy-/-，p-/-） rats. Methods The experimental animals were randomly divided into 5 group. The blank group had 8 RCS （rdy+/+，p+/+） rats. Each of the Fructus Lycii group， the Radix Salviae Miltiorrhizae group， the Fructus Lycii and Radix Salviae Miltiorrhizae （Qishen） group had 8 RCS （rdy-/-， p-/-） rats. Each group had half male and half female rats. The 5 groups were respectively filled the stomach with normal saline， normal saline， Fructus Lycii， Radix Salviae Miltiorrhizae， Fructus Lycii and Radix Salviae Miltiorrhizae by gavage. After 28 days gavage， the content of cAMP， cGMP and cAMP/cGMP in retinal homogenate were determined by ELISA. Results Compared with the blank group， the content of cAMP， cGMP and cAMP/cGMP in the retinal homogenate tissue of the model group were increased， and the difference was statistically significant （P<0.01）; Compared with the model group， the content of cAMP and cGMP and the value of cAMP/cGMP in the retinal homogenate tissue of Qishen group were significantly reduced， and the difference was statistically significant （P<0.01）. Conclusion The representative Chinese materia medica for “tonifying deficiency and activating blood circulation” Fructus Lycii and Radix Salviae Miltiorrhizae can reduce the contents of cAMP， cGMP and cAMP/cGMP in the retinal homogenate tissue of RCS （rdy-/-，p-/-） rats and improve the index of “deficiency”.

〔Keywords〕 retinitis pigmentosa; Fructus Lycii; Radix Salviae Miltiorrhizae; RCS rats; cAMP; cGMP

視網(wǎng)膜色素變性（retinitis pigmentosa， RP）是以夜盲和視野逐漸縮窄為特征的眼底疾病。中醫(yī)學認為該病主要由先天稟賦不足、肝腎虧虛、脾臟虛弱和血脈瘀滯等導致[1]。上世紀90年代，本研究團隊成員經(jīng)過大量的臨床觀察和機制研究證實RP患者的病機為本虛標實、虛中夾瘀，且血瘀貫穿本病始終[2]，由此創(chuàng)造性提出以“補虛活血”為基本治則治療RP患者。

基于團隊前期對RP病機及治法的認識[3-8]，我們選用兩味具有補虛活血作用的代表性中藥——枸杞子和丹參，來研究補虛活血法對RP模型大鼠的影響。枸杞子有滋補肝腎、益精明目之效;丹參可活血調經(jīng)、祛瘀止痛，常用治各種瘀血病證。兩藥合用可共奏益腎養(yǎng)肝、活血明目之功。

為了深入地闡明枸杞子加丹參對RP的作用機制，本實驗以已驗證的“虛中夾瘀”證RP模型大鼠RCS（rdy-/-， p-/-）[3]為研究對象，分組給予生理鹽水、枸杞子、丹參、枸杞子加丹參灌胃，觀察不同藥物干預后RCS大鼠視網(wǎng)膜組織勻漿中環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate， cAMP）含量、環(huán)磷酸鳥苷（cyclic guanosine monophosphate， cGMP）含量及cAMP/cGMP值的變化，以探討補虛活血法對RP虛中夾瘀證模型中“虛證”證候的影響。

1 材料

1.1 ?動物

RCS（rdy+/+，p+/+）大鼠8只，雌雄各半，體質量200～240 g，鼠齡28～42 d，SPF級;RCS（rdy-/-，p-/-）大鼠，32只，雌雄各半，體質量140～160 g，鼠齡28～42 d。均由昭衍（蘇州）新藥研究中心有限公司提供，動物許可證號：SCXK（蘇）2013-003。均飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學實驗動物中心，室溫（22±2） ℃，濕度50%～55%。

1.2 ?主要藥物及試劑

枸杞子中藥配方顆粒，每袋裝3.0 g（相當于臨床使用量飲片10 g），生產(chǎn)廠家：廣東一方制藥有限公司，許可證號：粵20110214，產(chǎn)品批號：5103761。丹參中藥配方顆粒，每袋裝1.8 g（相當于臨床使用量飲片10 g），生產(chǎn)廠家：廣東一方制藥有限公司，產(chǎn)品批號：5100631。苯巴比妥鈉由湖南中醫(yī)藥大學病理實驗室提供。cAMP-ELISA試劑盒、cGMP-ELISA試劑盒均由武漢華美生物工程有限公司提供。

1.3 ?儀器

TGL-16臺式高速冷凍離心機（湖南湘儀離心機儀器有限公司）;PW-812全自動酶標洗板機、MB-530酶標儀（深圳市匯松科技發(fā)展有限公司）;-80 ℃冰箱（中科美菱公司）;常規(guī)手術臺、手術器械、移液槍等均由湖南中醫(yī)藥大學中醫(yī)診斷學實驗室提供。

2 方法

2.1 ?動物分組

采用隨機數(shù)字表法將32只RCS（rdy-/-， p-/-）大鼠隨機分為4組，分別為：模型組、枸杞子組、丹參組及枸杞子加丹參組（簡稱杞參組）。RCS（rdy+/+，p+/+）大鼠即為空白組。每組8只大鼠，均雌雄各半。

2.2 ?動物干預

所有大鼠適應性飼養(yǎng)1周后給予灌胃。

給藥劑量按“人-動物體表面積等效劑量比值表”折算，折算系數(shù)W=0.018，折算公式：W×成人用量（g）/動物體質量（kg）。

枸杞子組大鼠灌胃劑量為1.08 g/（kg·d）;丹參組大鼠灌胃劑量為1.35 g/（kg·d）;杞參組大鼠灌胃劑量為2.43 g/（kg·d）;空白組、模型組大鼠灌胃等量生理鹽水。連續(xù)灌胃28 d后進行相應指標檢測。

2.3 ?視網(wǎng)膜組織勻漿中cAMP、cGMP含量的測定

1%苯巴比妥鈉3.5 mL/kg腹腔注射麻醉，麻醉滿意后，眼科顯微剪分離球周組織，剪斷視神經(jīng)后摘除眼球。將眼球用PBS溶液沖洗后放于玻璃皿中，在解剖顯微鏡下沿角鞏膜緣剪開眼球，去除眼前節(jié)及玻璃體，用顯微鑷子剝離出視網(wǎng)膜組織并稱重。顯微剪剪碎視網(wǎng)膜，用PBS溶液配制成10%的勻漿，5 000 r/min離心5 min，取上清液，將視網(wǎng)膜勻漿樣品標本分裝，-80 ℃冰箱凍存。檢測時室溫自然解凍，采用ELISA法測定視網(wǎng)膜勻漿中cAMP及cGMP的含量。

2.4 ?統(tǒng)計學處理

采用統(tǒng)計學軟件SPSS 23.0分析實驗數(shù)據(jù)，計量資料實驗數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布，用“x±s”表示，單因素設計，多組間計量資料比較采用單因素方差分析，滿足方差齊性，多重比較用LSD檢驗，方差不齊用Dunnet T3檢驗。計量資料不服從正態(tài)分布的，則采用秩和檢驗。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義，P<0.01為差異有顯著統(tǒng)計學意義。所有的結果分析圖由GraphPad Prism 6.0軟件制作完成。

3 結果

與空白組相比，模型組、枸杞子組、丹參組大鼠視網(wǎng)膜組織勻漿中cAMP、cGMP含量和cAMP/cGMP值均增高，差異均有顯著統(tǒng)計學意義（P<0.01）。與模型組相比，杞參組視網(wǎng)膜組織勻漿中cAMP、cGMP含量和cAMP/cGMP值均明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。見表1、圖1-3。

4 討論

RP是一種以進行性視細胞損害為特點的危害視功能的遺傳性眼病，多為雙眼發(fā)病，預后不良。本病確切發(fā)病原因與發(fā)病機制不明，尚無特效療法，一般應用血管擴張藥、營養(yǎng)神經(jīng)藥物等治療，但效果不明顯。隨著國內外多年來對RP的深入探討，干細胞治療、基因治療、視網(wǎng)膜移植等療法取得了很大進展[9]。干細胞治療是將特定的干細胞分化誘導為感光細胞，理論上可以恢復患者視覺功能，但是如何確保順利將干細胞誘導并輸送到人體的靶組織是一項極其艱巨的任務。基因治療是將外源性正?；驅氚屑毎_到糾正或補償缺陷和異?；虻哪康摹ｋm然動物實驗研究取得較好的療效且國外有報道用基因療法治療Leber遺傳性視神經(jīng)病的病例[10-11]。但是，目前已知的與RP發(fā)病相關的基因有200余個[12]，更不用說未知的基因，加上人和動物基因突變表型不一定相同，這些都加劇了基因療法在應用過程中的危險性，限制了它的推廣。視網(wǎng)膜移植則由于治療價格昂貴、移植物來源稀缺及保存技術不成熟等問題，目前在臨床應用較為困難。

中醫(yī)藥治療RP不良反應小、價格低廉，在改善患者視野及視力方面有較好的療效，值得臨床推廣。RP屬于中醫(yī)學“高風內障”范疇，從明代著作《證治準繩》起就有對本病的記載。經(jīng)過幾個世紀的認識，廣大中醫(yī)學者普遍認為本病病機為虛，包括肝腎陰虛、脾氣虛弱、腎陽不足。本課題組自1987年以來，采用中醫(yī)綜合療法治療本病的同時，從微量元素、免疫學、眼電生理、性激素、球結膜及甲皺微循環(huán)、血液流變學、舌下靜脈等多種角度對RP發(fā)病機制進行了研究，發(fā)現(xiàn)本病雖以虛為本，但以實（瘀）為標，血瘀病理貫穿其發(fā)病的整個病理過程[2，13-18]。

現(xiàn)代藥理學研究表明，枸杞子含有豐富的胡蘿卜素，胡蘿卜素轉化的維生素A對促進視網(wǎng)膜內視紫質的合成、調節(jié)視神經(jīng)、維持正常視力有重要意義;丹參具有擴張血管、增加視網(wǎng)膜微血管血流量的作用[19]。本研究即選用滋補肝腎和活血化瘀中藥里的代表性藥對枸杞子-丹參探討補虛活血中藥對RP大鼠“虛”證的影響。研究認為cAMP類似中醫(yī)的陽，而cGMP類似中醫(yī)的陰。cAMP能促使脂肪分解、糖原分解、心肌收縮、溶酶體酶和組織胺減少，而cGMP的作用則相反[20]。本研究在補虛活血治則指導下，對RP大鼠分別給予枸杞子、丹參治療，選取RCS大鼠視網(wǎng)膜組織勻漿中cAMP及cGMP的含量作為評價陰陽虛證的生化指標。研究結果顯示：相對于模型組大鼠，杞參組灌胃28 d后視網(wǎng)膜勻漿組織cAMP、cGMP含量和cAMP/cGMP值減少，由此，本研究認為枸杞子加丹參灌胃改善了RP經(jīng)典動物模型RCS（rdy-/-，p-/-）大鼠的陰陽兩虛證候，為進一步開展補虛活血法治療虛中夾瘀證PR模型鼠實驗研究提供了支撐。

參考文獻

[1] 邢 ?玥，李 ?霄.視網(wǎng)膜色素變性的中醫(yī)藥文獻研究[J].生物技術世界，2012，9（2）：88-89.

[2] 彭清華，李傳課.視網(wǎng)膜色素變性虛中夾瘀的機理研究小結[J].中國醫(yī)藥學報，1993，8（6）：7-10.

[3] 徐 ?劍，周亞莎，彭 ?俊，等.RCS（rdy-/-， p-/-）大鼠虛中夾瘀證實驗評價[J].中華眼視光學與視覺科學雜志，2018，20（9）：519-524.

[4] XU J， YANG Y J， QIN G Y， et al. Effects of lyciiFructuas and salviaeMiltiorrhizae on the syndrome of deficiency with blood stasis in RCS （rdy-/-， p-/-） rats with retinitis pigmentosa an Intervention study[J]. Digital Chinese Medicine， 2019， 2（3）： 157-165.

[5] 彭清華.視網(wǎng)膜色素變性的中西醫(yī)結合治療概況[J].中西醫(yī)結合雜志，1989，9（8）：512-513.

[6] 蔣鵬飛，彭 ?俊，曾志成，等.益氣明目丸對視網(wǎng)膜色素變性患者眼部血流動力學的影響[J].南京中醫(yī)藥大學學報，2020，36（1）：24-27.

[7] 劉家琪，王 ?英，蔣鵬飛，等.枸杞子丹參對視網(wǎng)膜色素變性大鼠視網(wǎng)膜組織形態(tài)學及CRYAB mRNA的影響[J].中國醫(yī)藥導報，2019，16（14）：13-15，22.

[8] 蔣鵬飛，王 ?英，潘坤，等.益氣明目丸對視網(wǎng)膜色素變性大鼠視網(wǎng)膜Fas、FasL蛋白表達的影響[J].中醫(yī)雜志，2019，60（4）：327-332.

[9] XU J， PENG Q H. Retinitis pigmentosa treatment with western medicine and traditional Chinese medicine therapies[J]. Journal of Ophthalmology， 2015，2015：1-6.

[10] CIDECIYAN A V， HAUSWIRTH W W， ALEMAN T S， et al. Human RPE65 gene therapy for leber congenital amaurosis： Persistence of early visual improvements and safety at 1 year[J]. Human Gene Therapy， 2009，20（9）：999-1004.

[11] SIMONELLI F， MAGUIRE A M， TESTA F， et al. Gene therapy for leber's congenital amaurosis is safe and effective through 1.5 years after vector administration[J]. Molecular Therapy， 2010， 18（3）： 643-650.

[12] ALI M U， RAHMAN M S U， CAO J， et al. Genetic characterization and disease mechanism of retinitis pigmentosa; current scenario[J]. 3 Biotech， 2017， 7（4）： 1-20.

[13] 彭清華，胡欣平，曾自明，等.視網(wǎng)膜色素變性辨證論治與血清性激素關系的初步研究[J].中國中醫(yī)眼科雜志，1993，3（2）：80-83.

[14] 彭清華，胡欣平，朱惠安，等.男性視網(wǎng)膜色素變性及其辨證分型與血清性激素關系的初步研究[J].遼寧中醫(yī)雜志，1993，20（12）： 1-5.

[15] 彭清華，胡欣平.男性視網(wǎng)膜色素變性患者的血清性激素改變[J]. 眼科新進展，1993，13（2）：8-10.

[16] 彭清華，羅 ?萍，江曉芬，等.視網(wǎng)膜色素變性血淤機理的初步研究[J].國醫(yī)論壇，1993，8（1）：37-40.

[17] 彭清華.視網(wǎng)膜色素變性228例的舌象觀察[J].遼寧中醫(yī)雜志， 1991，18（5）：20-25.

[18] 彭清華.38例日本籍視網(wǎng)膜色素變性舌下脈的臨床觀察[J].江蘇中醫(yī)，1990，22（5）：43-45.

[19] 宋厚盼，曾梅艷，彭 ?俊，等.枸杞子-丹參藥對治療視網(wǎng)膜色素變性的分子機制探討[J].中國實驗方劑學雜志，2019，25（14）：199-206.

[20] 占阮娟，陳素紅，呂圭源，等.三味甘涼歸肺經(jīng)中藥對肺陰虛模型大鼠cAMP、cGMP的影響[J].中藥藥理與臨床，2012，28（6）：85-87.