葛根素對(duì)創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙大鼠行為的作用研究

李靄燕 招志輝 關(guān)彩華

1.廣州市番禺區(qū)中醫(yī)院，廣東廣州 511442；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,廣東廣州 511000

創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙（post trauma stress disorder，PTSD）是一種創(chuàng)傷后心理失衡的狀態(tài)。臨床表現(xiàn)包括反復(fù)重現(xiàn)的創(chuàng)傷體驗(yàn)、情緒麻木、回避情緒、過度警覺引起的持續(xù)性焦慮、恐慌逃避和易激惹癥狀。近年來，戰(zhàn)爭、社會(huì)暴力、重大交通事故、自然災(zāi)害頻發(fā)，創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙的發(fā)病率也在不斷上升[1-2]。因此，研究創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙并找到治療靶點(diǎn)具有非常重要的意義。創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙動(dòng)物模型研究發(fā)現(xiàn)，接受創(chuàng)傷應(yīng)激治療的動(dòng)物在生理和行為上與創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙患者有很強(qiáng)的相似性，包括下丘腦-垂體-腎上腺軸系統(tǒng)負(fù)反饋抑制增加，聽覺驚嚇反應(yīng)增強(qiáng)，以及條件性恐懼反應(yīng)持續(xù)存在?？臻g記憶受損。創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙動(dòng)物模型主要通過給予動(dòng)物強(qiáng)烈的厭惡刺激來測(cè)試動(dòng)物行為和生理上的變化。這些變化取決于壓力的強(qiáng)度，可以持續(xù)很長時(shí)間，也可以隨時(shí)間逐漸增加。目前的研究主要集中在聯(lián)想學(xué)習(xí)中的恐懼條件反射和非聯(lián)想學(xué)習(xí)的敏感化行為[3-4]。近年來的研究表明葛根素對(duì)創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙的治療有顯著作用。葛根素是葛根的主要成分，具有促進(jìn)突觸生長、抗神經(jīng)元損傷、抗炎、抗抑郁、抗腫瘤等作用[5-6]。本研究采用動(dòng)物心理應(yīng)激和生理應(yīng)激創(chuàng)傷應(yīng)激障礙模型,探討葛根素對(duì)創(chuàng)傷后應(yīng)激大鼠行為的作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 由廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供SPF級(jí)成年雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量（200±20）g。在溫度為22～24℃，相對(duì)濕度60%的環(huán)境下飼養(yǎng)，正常攝食攝水，飼養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 藥物及儀器 葛根素（購自湖北巨勝科技有限公司，20160806），乙醚（國家標(biāo)準(zhǔn)（GB/T 12591-2002），購自中國醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司），松下微型攝像機(jī)HDC-SD10，Morris 水迷宮（Morris water maze，MWM）視頻分析系統(tǒng)（上海吉量軟件科技有限公司），自制束縛器、游泳缸。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物模型制備 采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為三組：正常組、模型組、葛根素組，每組10只。葛根素組給予15mg/kg葛根素灌胃，正常組、模型組給予相同劑量生理鹽水灌胃。所有大鼠均在早晨8點(diǎn)灌胃，持續(xù)2周。

模型組與葛根素組采用SPS方法構(gòu)建PTSD模型：緊密束縛大鼠2h，然后置于水深45cm、25℃的水箱內(nèi)，使其游泳20min。15min后，用密閉容器乙醚麻醉法麻醉大鼠，置于通風(fēng)處，大鼠蘇醒后放回鼠籠，飼養(yǎng)7d后造模完成[7]。

1.2.2 觀察指標(biāo) 大鼠僵住時(shí)間：將大鼠置于水箱中，記錄 5min內(nèi)大鼠僵住行為時(shí)間。

EPM試驗(yàn)：參照Cohen等的方法[8]，進(jìn)行EPM試驗(yàn)。具體方法為，采用不透明有機(jī)玻璃制成半米高的高架十字迷宮，在迷宮中間放置一個(gè)8cm×8cm的平臺(tái)；將大鼠置于平臺(tái)上，大鼠頭部都朝同一個(gè)方向，在適應(yīng)10s后，記錄大鼠5min內(nèi)的行為，記錄器開臂停留時(shí)間及開臂進(jìn)入次數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS23.0分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以（）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠僵住時(shí)間比較

與正常組比較，模型組及葛根素組大鼠的僵住時(shí)間明顯延長，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；且葛根素組大鼠僵住時(shí)間為（3.25±0.80）s，較模型組（5.82±1.24）s縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

2.2 各組大鼠開臂停留時(shí)間及進(jìn)入次數(shù)比較

模型組開臂進(jìn)入次數(shù)及開臂停留時(shí)間均顯著低于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；葛根素組開臂進(jìn)入次數(shù)及開臂停留時(shí)間均顯著低于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；且葛根素組開臂停留時(shí)間、開臂進(jìn)入次數(shù)分別為（12.36±4.50）s、（30.29±2.54）次，明顯高于模型組的（9.82±1.23）s、（22.56±1.27）次，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表1 各組大鼠僵住時(shí)間比較（x ± s，s）

表2 各組大鼠開臂停留時(shí)間及進(jìn)入次數(shù)比較（x ± s）

3 討論

人類創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙的成因較為復(fù)雜，如生活壓力、家庭暴力等都可能成為原因之一。相關(guān)統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)分析提示，51.2%的女性、60.7%的男性曾經(jīng)歷過創(chuàng)傷性事件[9-10]。對(duì)于受害者而言，創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙的發(fā)病率較高，一旦發(fā)病病情容易遷延難愈。既往相關(guān)研究主要集中在創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙發(fā)病后的管理上，很少有關(guān)于預(yù)防相關(guān)研究報(bào)道。對(duì)于PTSD高危人群，如經(jīng)常目睹或遭受災(zāi)難性事件的消防員、軍人等，應(yīng)有必要采取干預(yù)措施來增強(qiáng)其壓力閾值，降低創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙的發(fā)病率。

SPS動(dòng)物模型可以模擬創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙患者對(duì)創(chuàng)傷后情景和類似焦慮行為的恐懼反應(yīng)。它是國際公認(rèn)的創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙建模方法之一。僵住行為檢測(cè)，本研究中模型組大鼠的僵住時(shí)間較正常對(duì)照組明顯延長，提示SPS方法能誘發(fā)大鼠發(fā)生創(chuàng)傷后行為異常。EPM實(shí)驗(yàn)，利用動(dòng)物對(duì)新環(huán)境的探究和對(duì)高懸臂的恐懼形成沖突，并對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的焦慮品質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)[11-12]。本研究中模型組大鼠在 EPM實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)為開臂進(jìn)入次數(shù)和開臂停留時(shí)間比較正常對(duì)照組顯著降低。這表明，當(dāng)單一的長時(shí)間應(yīng)激作用大鼠后，再被放置在EPM的中心區(qū)域時(shí)，其探究和好奇的性質(zhì)減弱，與外部世界連接的開臂引起的威脅增強(qiáng)，焦慮和恐懼的水平顯著增加[13-16]。大鼠迅速從中心區(qū)域跑開，手臂縮回成閉合狀態(tài)。而空白對(duì)照組大鼠在開臂上停留的時(shí)間更長，對(duì)開臂的探究次數(shù)明顯增多較多。提示SPS可引起大鼠的長期焦慮反應(yīng)，而大鼠探索行為抑制、回避和恐懼，并增加焦慮水平[17-18]。

葛根素又稱為葛根黃素，是一種從中藥葛根素中分離得到的具有擴(kuò)冠作用的異黃酮衍生物[19-22]。葛根素存在于豆科植物和葛根中。葛根素具有鎮(zhèn)靜解熱作用，能增加冠狀動(dòng)脈血流，對(duì)垂體引起的急性心肌出血有明顯的保護(hù)作用[23]。本研究中，在造模完成后，對(duì)小鼠進(jìn)行僵住行為檢測(cè)，結(jié)果顯示葛根素組僵住行為時(shí)間明顯較模型組縮短，提示葛根素具有逆轉(zhuǎn)小鼠創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙僵住行為的作用，對(duì)創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙的僵住行為有明顯抑制作用。在EMP試驗(yàn)中，結(jié)果顯示葛根素組開臂進(jìn)入次數(shù)及開臂停留時(shí)間均顯著高于模型組。提示葛根素具有改善創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙后大鼠焦慮癥狀的作用。

綜上，葛根素對(duì)SPS建成的創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙大鼠行為及異常精神狀態(tài)具有一定的改善作用，證實(shí)葛根素具有有效預(yù)防創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙大鼠焦慮樣行為，能增強(qiáng)大鼠對(duì)創(chuàng)傷后應(yīng)激的適應(yīng)能力。葛根素能減少SPS模型大鼠的僵立行為時(shí)間，說明葛根素對(duì)于預(yù)防創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙大鼠恐懼樣行為具有一定的作用。