曙紅Y與恩諾沙星相互作用的分光光度法研究

恩諾沙星（EN）為動物專用的殺菌性廣譜抗菌藥，適用于牛、豬、禽、犬、貓和水生動物的敏感細(xì)菌及支原體所致的消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)及皮膚軟組織的各種感染性疾病。主要用于支原體病、巴氏桿菌病、大腸桿菌病、沙門氏菌病、鏈球菌病等。目前對恩諾沙星的檢測方法有高效液相色譜法[1]和紫外分光光度法[2]。在原有研究基礎(chǔ)上[3]，本文進(jìn)行了曙紅Y（EY）與恩諾沙星（EN）相互作用的分光光度法研究，建立了曙紅Y測定恩諾沙星的新方法，用于恩諾沙星溶液中恩諾沙星含量的測定，結(jié)果滿意。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑PE公司lamda35型雙光束紫外光譜儀；BT 224S分析天平（Sartorius公司）；恩諾沙星（中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，批號H0081505，含量99.5%）：4.84×102mg·L-1(0.01mol·L-1NaOH)：5.0×10-4mol·L-1曙紅Y溶液；0.01%乙烯吡咯烷酮（PVP）溶液；恩諾沙星溶液（林州中農(nóng)穎泰生物肽有限公司，批號為S190317061，規(guī)格為100ml：5g）；所用水為純化水；其他試劑為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法在10mL容量瓶中依次加入1.00mL曙紅Y溶液、適量恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液或待測液、1.0mL PVP溶液，加0.01mol/L鹽酸6.0mL，用水稀釋至刻度，搖勻，以水為參比立即進(jìn)行光譜掃描或固定波長為536nm進(jìn)行吸光度測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 吸收光譜以水為空白，對體系進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果見圖1。由圖1可知，恩諾沙星（15mg·L-1）最大吸收峰在271nm，曙紅B（5.0×10-5mol·L-1）可見區(qū)最大吸收峰在516nm，加入恩諾沙星后體系在可見區(qū)的最大吸收紅移到536nm，紅移20nm，且吸光度明顯增加。說明體系中應(yīng)該有恩諾沙星與曙紅Y的復(fù)合物生成。

2.2 酸度對體系的影響在10mL容量瓶中，依次加入1.00mL曙紅Y溶液、0.30mL恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)液，分別用1、0.1、0.01、0.001mol/L鹽酸稀釋至刻度，搖勻，以水為參比立即進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用0.01mol/L鹽酸稀釋后體系最大吸收波長紅移最大。隨后考察了0.01mol/L鹽酸加入體積的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)體系中加入4～8.5mL 0.01mol/L鹽酸時，最大吸收波長紅移波長最大、紅移波長數(shù)穩(wěn)定、在536nm波長處體系和曙紅Y吸光度的差值最大，選擇0.01mol/L鹽酸加入量為6.0mL。

2.3 體系吸光度的穩(wěn)定性體系的吸光度隨時間減小，10min后溶液變渾濁并慢慢產(chǎn)出沉淀，為了提高體系的穩(wěn)定性考察了非離子表面活性劑對吸光度的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)加入0.01%PVP1.0mL后體系不再發(fā)生渾濁、吸光度可以穩(wěn)定6h以上。

圖1 吸收光譜

2.4 最大結(jié)合數(shù)的測定固定恩諾沙星濃度為1.65×10-5mol·L-1，改變曙紅Y的濃度，以相應(yīng)的試劑空白為參比測定體系的吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，以n（cEY/cEN）為橫坐標(biāo)作圖，結(jié)果見圖2。由圖可知，n=1時出現(xiàn)一明顯折點(diǎn)。依據(jù)摩爾比法原理，恩諾沙星與曙紅Y的最大結(jié)合數(shù)為1。

圖2 摩爾比法

2.5 離子強(qiáng)度的影響實(shí)驗(yàn)用NaCl考察了離子強(qiáng)度對體系的影響。發(fā)現(xiàn)，體系中加入NaCl后，體系中NaCl濃度為0.02 ～ 0.1mol·L-1時，吸光度隨NaCl濃度增大而緩慢變小。吸光度變小，表明恩諾沙星與曙紅Y可能主要通過靜電引力結(jié)合。

2.6 表面活性劑的影響及反應(yīng)機(jī)理探討加入0.01% PVP 1.0mL，體系吸光度有一定的增大。加入陰離子表面活性劑十二烷基苯磺酸鈉（SDBS，0.1%，0.5mL），體系的吸光度幾乎完全猝滅。加入的陽離子表面活性劑溴化十六烷基三甲基胺（CTMAB，0.1%，0.1mL），體系的吸光度顯著增大。

非離子表面活性劑PVP的存在可能會聚集體系中EN與EY的復(fù)合物，形成膠束增敏體系使體系的吸光度增大。

對EY中加入EN和CTMAB的體系進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果見圖 3。由圖可知，EN（4.84 mg·L-1）與 CTMAB（10 mg·L-1）的加入都能使 EY（5.0×10-5mol·L-1）的最大吸收波長發(fā)生紅移，推測EN、CTMAB與EY的結(jié)合方式是相似的。CTMAB與EY的結(jié)合可能主要是CTMAB分子中的季銨N+正電荷與EY分子中的羧酸基－COO－負(fù)電荷間的作用。EN分子中有叔胺，在酸性條件下，容易形成季銨N+正電荷，可以和EY分子中的羧酸基－COO－負(fù)電荷結(jié)合生成離子復(fù)合物（EN和EY分子結(jié)構(gòu)圖見圖4）。

圖3 吸收光譜

大量SDBS（50mg·L-1）的存在會抑制EY與EB復(fù)合物的形成，因?yàn)殪o電引力是一種非定向性的作用力，在大量SDBS陰離子的存在下，EN大部分可能會與SDBS結(jié)合，生成EN與SDBS的復(fù)合物，從而抑制EN與EY復(fù)合物的生成，而EN與SDBS的復(fù)合物在536nm沒有吸收或有很弱的吸收，從而使體系的吸光度產(chǎn)生嚴(yán)重猝滅。因而，推測恩諾沙星與曙紅Y主要通過靜電引力結(jié)合形成結(jié)合比為1：1的離子復(fù)合物。

2.7 線性范圍、檢出限和精密度恩諾沙星在4.8～14.4 mg·L-1濃度范圍內(nèi)服從比爾定律；回歸方程為：A = 0.0194c（mg·L-1）+ 0.4379，相關(guān)系數(shù)為0.9990。按cL＝3S/K得方法檢出限為 0.4mg·L-1。對濃度為 9.6 mg·L-1的恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行平行測定求得相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD＝0.8%（n=6）。

2.8 樣品測定精密量取樣品恩諾沙星溶液1mL，置100mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻；按實(shí)驗(yàn)方法對樣品進(jìn)行分析，結(jié)果見表1。

表1 恩諾沙星溶液的測定和回收(n=6)