針灸調(diào)沖任法對(duì)輸卵管炎性不孕大鼠NF-κB、TNF-a蛋白表達(dá)的影響

聶婷

（安徽中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，安徽 合肥）

0 引言

近年來隨著環(huán)境的改變及婦科宮腔操作的增多,女性不孕的發(fā)病率呈逐年上升趨勢,其中慢性輸卵管炎性病變導(dǎo)致的不孕約占1/3 左右。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，此過程是由多種炎癥因子參與的輸卵管管壁、內(nèi)膜、纖毛的慢性炎癥性病變，可致輸卵管積水、化膿及與周圍組織粘連，阻礙精卵結(jié)合與運(yùn)送，而致不孕。故抑制炎癥反應(yīng)、恢復(fù)輸卵管功能，是治療輸卵管炎性不孕的關(guān)鍵。西醫(yī)多用抗生素、腹腔鏡、輔助生殖技術(shù)等，但費(fèi)用高、易復(fù)發(fā)。我課題組通過多年的臨床觀察發(fā)現(xiàn)：針灸調(diào)沖任法治療輸卵管炎性不孕療效確切[1-3]。本研究旨在用針灸調(diào)沖任法干預(yù)輸卵管炎性不孕大鼠，探究其治療疾病的機(jī)制，進(jìn)一步指導(dǎo)臨床。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

購置成熟的84 只Wistar 雌性大鼠，體重約（200±20）g，鼠齡在8周-12周。由安徽中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物房飼養(yǎng)，保持室溫、自然光照周期。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)藥品、試劑

1.2.1 藥物

慶大霉素，廣東三才石岐制藥股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H44023277。

1.2.2 試劑

大腸桿菌：菌號(hào)FSCC149006 ；金黃色葡萄球菌：菌號(hào) FSCC223005；溶血性鏈球菌：菌號(hào)FSCC225002，以上購自北京東方賽瑞生物技術(shù)有限公司，由安徽中醫(yī)藥大學(xué)細(xì)菌室培養(yǎng)?；旌暇鷳乙簼舛葹?×109/mL（由大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、溶血性鏈球菌，按2:1:1 以無菌注射用水稀釋）。水合氯醛，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20160709。NF-κB、TNF-a 試劑盒均購買于武漢博士德生物工程有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 造模方法

所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后稱重、編號(hào)，用隨機(jī)數(shù)字表法取20 只作為正常組，剩余64 只造模。使用3%戊巴比妥鈉50mg/kg 對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔注射予以麻醉，待藥物起效后放于手術(shù)臺(tái)上，在脊柱旁兩側(cè)進(jìn)行剃毛，使用碘伏消毒皮膚，在脊柱側(cè)旁開1cm 行橫切口，打開腹腔后，尋找輸卵管和卵巢，將一側(cè)輸卵管和卵巢組織充分暴露在腹腔外，然后將配置好的混合菌懸液0.1mL 注射到輸卵管中，再逐層縫合肌層和皮膚。采用同種方法對(duì)另側(cè)進(jìn)行處理，手術(shù)完畢后常規(guī)消毒皮膚，將造模后的大鼠放于鼠籠內(nèi)，等待蘇醒。分別于造模后第15、20d 各取材兩只，觀察輸卵管炎癥情況，判斷造模成功與否。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組

將造模成功的60 只大鼠隨機(jī)分為3 組：針灸組20 只、西藥組20 只、模型組20 只。加上正常組20 只，共4 組。

2.3 干預(yù)方法

在給藥劑量上，按人和大鼠體表面積折算的劑量給藥，針刺的穴位按照參考《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》及動(dòng)物比較學(xué)方法定位。

1）正常值:正常喂養(yǎng)，灌服生理鹽水，1.8mL/kg·d，灌服20 天。

2）模型組：造模后，正常喂養(yǎng)，灌服生理鹽水，1.8mL/kg·d，灌服20 天。

3）西藥組：造模后，灌服慶大霉素0.72 萬U/kg·d ，灌服 20 天。

4）針灸治療組：造模后，選用蘇州天協(xié)針灸器械有限公司生產(chǎn)的天協(xié)牌1 寸針灸針以及蘇州醫(yī)療用品廠有限公司生產(chǎn)的清艾條，針灸氣海、中極、關(guān)元、中注穴。進(jìn)針約2mm，輕度捻轉(zhuǎn)，得氣后留針 30min，期間更換艾條，1 次/d，針灸 20 天。

以上大鼠治療20 天后禁食水24H，水合氯醛麻醉，脫臼處死。取出雙側(cè)輸卵管，剔除周圍脂肪組織，迅速放入4%多聚甲醛溶液中固定，進(jìn)行免疫組化觀察蛋白含量。

2.4 統(tǒng)計(jì)方法

使用 SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料等級(jí)資料采用Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料樣本率的比較用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

與正常組比較，模型組NF-κB、TNF-a 表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組比較，針灸組與西藥組NF-κB、TNF-a 表達(dá)強(qiáng)度的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與西藥組比較，針灸組NF-κB、TNF-a 表達(dá)強(qiáng)度的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。詳見表1-表2。

表1 各組大鼠輸卵管組織中NF-κB 蛋白表達(dá)的比較

表2 各組大鼠輸卵管組織中TNF-a 蛋白表達(dá)的比較

4 討論

清代陳士鐸在《石室秘錄》中提到：“任督之間，倘有疝瘕之癥，則精不能施，因外有所障?！碧崾竟糯t(yī)家已經(jīng)意識(shí)到病理性阻塞導(dǎo)致的受精障礙是導(dǎo)致不孕的一種病因。輸卵管炎性不孕的中醫(yī)學(xué)發(fā)病機(jī)理可概括為：攝生不慎，邪入血脈并搏結(jié)成瘀，阻滯沖任、胞宮，使陰陽二精難以相搏成孕。其病機(jī)關(guān)鍵為沖任瘀阻，治療大法以調(diào)理沖任，活血化瘀為主。大量臨床研究證實(shí)，針灸對(duì)盆腔炎癥性疾病療效顯著[4-5]。我們選取氣海、關(guān)元、中極均屬任脈經(jīng)穴，關(guān)元是肝脾腎三經(jīng)與任脈交會(huì)穴，與胞宮相連接，同時(shí)與沖任相互聯(lián)系，可固本培元、補(bǔ)益下焦、疏通沖任二脈，《針灸大成》云：“關(guān)元主月經(jīng)不通，絕嗣不生”；氣海穴是“人之元?dú)馑病?，可引氣歸元，通過調(diào)節(jié)氣機(jī)，改善局部血液循環(huán)、新陳代謝；中極穴是“足三陰、任脈之會(huì)”，通于胞宮,可調(diào)理沖任，培元益精、補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)、清熱利濕；中注屬足少陰腎經(jīng)的穴位，是沖脈交會(huì)穴，可疏通經(jīng)氣，調(diào)理氣機(jī)。艾灸[6]可通過刺激穴位、經(jīng)絡(luò)，使局部小血管擴(kuò)張，促進(jìn)局部血液循環(huán)，溫濕化瘀，行氣消癥而抑制炎性反應(yīng)。二者合用，共奏活血化瘀、通調(diào)沖任之功。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：針灸調(diào)沖任法能夠抑制NF-κB、TNF-a 蛋白的表達(dá)，效果等于西藥組。NF-κB、TNF-a 均是TLR4 級(jí)聯(lián)反應(yīng)的下游分子，其中NF-κB 是炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的重要始動(dòng)因素，可通過誘導(dǎo)特定基因表達(dá), 激活細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)反應(yīng)。既往研究表明：NF-κB 可誘導(dǎo)IL-1、細(xì)胞間粘附分子、TNF-a 等炎癥因子的表達(dá)，促使白細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞移動(dòng)、粘附并滲出，參與炎癥反應(yīng)。另外腫瘤壞死因子、白介素等細(xì)胞因子的表達(dá)反過來亦增加NF-κB 的表達(dá)，從而進(jìn)一步加重炎癥反應(yīng)，形成惡性循環(huán)。TNF-a 主要由巨噬細(xì)胞合成和分泌，有著多種生物活性的細(xì)胞激動(dòng)劑，研究表明TNF-a 與輸卵管炎密切有關(guān)[7]。其主要作用是介導(dǎo)輸卵管上皮細(xì)胞凋亡，炎癥發(fā)生時(shí)刺激巨噬細(xì)胞分泌和釋放TNF-a 含量增多，誘導(dǎo)炎性細(xì)胞釋放毒性物，刺激成纖維細(xì)胞增生，促進(jìn)膠原酶釋放，且水平越高損傷越重[8]。

以上研究表明：針灸調(diào)沖任法可通過抑制NF-κB 、TNF-a 蛋白的表達(dá)來抑制炎癥反應(yīng)，達(dá)到受孕的目的，是治療輸卵管炎性不孕的有效方法，且操作簡單、價(jià)格低廉，值得臨床推廣。