野生對(duì)蝦白斑綜合征和早期死亡綜合征病原的流行情況調(diào)查

劉 蘇，郭宜欣 ，張海發(fā)，楊宇晴，吳錦輝，石和榮，黃錦雄，黃培衛(wèi)

（1.廣東省海洋漁業(yè)試驗(yàn)中心，廣東 惠州 516081；2.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，廣東 廣州 510225）

【研究意義】對(duì)蝦泛指甲殼類、十足目、對(duì)蝦科、對(duì)蝦屬內(nèi)各個(gè)品種，其中凡納濱對(duì)蝦、斑節(jié)對(duì)蝦、中國(guó)對(duì)蝦、日本對(duì)蝦是我國(guó)重要的養(yǎng)殖品種。對(duì)蝦具有生長(zhǎng)速度快、營(yíng)養(yǎng)需求低等特點(diǎn)，深受養(yǎng)殖者青睞；而其肉質(zhì)鮮美、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高［1］，頗受消費(fèi)者喜愛。我國(guó)是對(duì)蝦養(yǎng)殖大國(guó)，對(duì)蝦產(chǎn)業(yè)在良種繁育、規(guī)模養(yǎng)殖、加工流通等方面已形成完整的產(chǎn)業(yè)鏈［2］，2018年海水養(yǎng)殖產(chǎn)量達(dá)140.9萬t［3］。對(duì)蝦養(yǎng)殖在增加漁民收入和出口創(chuàng)匯方面貢獻(xiàn)巨大，社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益顯著［4］。由于集約化養(yǎng)殖程度的提高，對(duì)蝦病害日趨嚴(yán)重，成為影響對(duì)蝦養(yǎng)殖產(chǎn)量的主要因素之一。【前人研究進(jìn)展】20世紀(jì)90年代初，對(duì)蝦的白斑綜合征（White Spot Syndrom，WSS）及早期死亡綜合征（Early Mortality Syndrome，EMS）開始暴發(fā)，患病對(duì)蝦死亡率極高，受病害影響，世界對(duì)蝦產(chǎn)量劇減，給養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大損失，嚴(yán)重危害養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展［5-7］。隨著近年對(duì)蝦養(yǎng)殖模式的改進(jìn)及病害防控措施的提升，世界對(duì)蝦產(chǎn)量有所回升，2019年產(chǎn)量達(dá)到330萬t。目前，白斑綜合征及早期死亡綜合征已遍布世界各地的對(duì)蝦養(yǎng)殖國(guó)家，尤其對(duì)亞洲和南美洲等眾多對(duì)蝦養(yǎng)殖主產(chǎn)區(qū)國(guó)家影響嚴(yán)重。有關(guān)上述兩種病害的檢測(cè)方法已建立甚至已成熟應(yīng)用［8-10］，相關(guān)防治方法也開始受到重視［11-14］，但至今仍未找到有效的治療方法。對(duì)白斑綜合征及早期死亡綜合征仍以預(yù)防為主，需從保證蝦苗質(zhì)量、建立良好養(yǎng)殖水環(huán)境等方面來開展工作?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】我國(guó)對(duì)蝦的親蝦資源匱乏，來源主要為捕撈海里的野生對(duì)蝦或從國(guó)外進(jìn)口［15］。調(diào)查大亞灣海域的野生對(duì)蝦白斑綜合征及早期死亡綜合征病原攜帶情況，對(duì)了解海捕親蝦群體的健康情況以及流行病的發(fā)生規(guī)律具有重要意義。【擬解決的關(guān)鍵問題】通過對(duì)兩種病害病原分布規(guī)律的研究分析，以期為保護(hù)野生蝦類的種群穩(wěn)定、維持海洋生態(tài)平衡提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為對(duì)蝦養(yǎng)殖中的病害預(yù)警及防控提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

在2018年8—12月、2019年1—4月以及8—12月期間，每月在大亞灣海域3個(gè)不同地點(diǎn)收集捕撈野生對(duì)蝦，每個(gè)地點(diǎn)取樣20尾左右，共取樣960尾。取每尾對(duì)蝦的肝胰腺置于裝有無水乙醇的樣品管中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

樣品DNA提取采用天根生化科技（北京）有限公司的海洋動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒。白斑綜合征檢測(cè)引物、早期死亡綜合征檢測(cè)引物及十足類通用引物序列［8-9］如表1所示，引物由英濰捷基貿(mào)易有限公司合成。

試驗(yàn)以確認(rèn)為感染白斑綜合征死亡的病蝦提取基因組DNA作為白斑綜合征陽性對(duì)照，對(duì)疑似受白斑綜合征感染死亡的病蝦提取基因組DNA，用白斑綜合征引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將陽性產(chǎn)物送英濰捷基貿(mào)易有限公司測(cè)序；以含早期死亡綜合征引物擴(kuò)增目的基因的載體質(zhì)粒作為早期死亡綜合征陽性對(duì)照，由英濰捷基貿(mào)易有限公司合成。試驗(yàn)均以雙蒸水作為空白對(duì)照。

PCR反應(yīng)試劑采用天根生化科技（北京）有限公司的2×TaqPCR Mastermix試劑盒，反應(yīng)體系為 20 μL：2×TaqPCR Mix 10 μL，樣品DNA或陽性對(duì)照、空白對(duì)照1 μL，正/反向引物各 1 μL，ddH2O 7 μL。PCR 反應(yīng)程序：95℃5 min；95℃ 30 s、55℃ 30 s和 72℃ 2 min，40個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min，4℃保溫。反應(yīng)結(jié)束后，以0.5 μg/mL的4S GelRed核酸染料顯帶，在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，在紫外照膠儀中觀察結(jié)果并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品DNA提取結(jié)果

樣品DNA提取結(jié)果見圖1，在2 000 bp以上均有明顯亮帶。提取的DNA經(jīng)十足目通用引物PCR擴(kuò)增（圖2），在848 bp處有條帶且較亮，表明樣品DNA質(zhì)量較好。

圖1 DNA樣品瓊脂糖電泳結(jié)果Fig. 1 Agarose gel electrophoresis result of DNA samples

2.2 大亞灣海域野生對(duì)蝦白斑綜合征檢測(cè)結(jié)果

圖2 DNA質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果Fig. 2 PCR amplification by primers of decapods

對(duì)蝦白斑綜合征PCR擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果見圖3，陽性樣品在1 447 bp處均有條帶，陰性樣品則無此條帶。從表2調(diào)查結(jié)果可知，2018年8—12月期間，8月所有樣品檢測(cè)均呈陰性，其余月份均有陽性樣品，其中9、10月陽性率較高，分別為47.37%、41.67%，11月陽性率較低（1.67%）。2019年1—4月、8—12月期間，1月及8—10月所有樣品檢測(cè)均呈陰性，其余月份陽性率也均低于10%的水平。結(jié)果表明，大亞灣海域野生對(duì)蝦群體攜帶白斑綜合征病毒的比率在時(shí)間上無特定的分布規(guī)律，無論是夏季還是冬季均有攜帶可能，甚至出現(xiàn)高陽性率。2019年檢測(cè)的陽性率均較低，平均陽性率為2.43%，明顯低于2018年的平均陽性率22.96%。

2.3 大亞灣海域野生對(duì)蝦早期死亡綜合征檢測(cè)結(jié)果

圖3 大亞灣海域野生對(duì)蝦白斑綜合征PCR檢測(cè)結(jié)果Fig. 3 PCR detection result of WSS in wild prawns from Daya Bay

表2 大亞灣海域野生對(duì)蝦白斑綜合征檢測(cè)結(jié)果Table 2 Detection result of WSS in wild prawns from Daya Bay

圖4 大亞灣海域野生對(duì)蝦早期死亡綜合征PCR檢測(cè)結(jié)果Fig. 4 PCR detection result of EMS in wild prawns from Daya Bay

表3 大亞灣海域野生對(duì)蝦早期死亡綜合征檢測(cè)結(jié)果Table 3 Detection result of EMS in wild prawns from Daya Bay

對(duì)蝦早期死亡綜合征PCR擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果見圖4，陽性樣品在284 bp處均有條帶，陰性樣品則無此條帶。從表3調(diào)查結(jié)果可知，2018年8—12月均檢測(cè)到對(duì)蝦早期死亡綜合征病菌，其中陽性率最高為8月份（63.04%），最低為10月份（3.33%）。2019年1—4月、8—12月期間，8月份所有樣品檢測(cè)均呈陰性，其余月份均有陽性樣品，其中3月和12月陽性率較高、分別為92.45%和94.00%，9月和10月陽性率較低、分別為1.70%和1.67%。結(jié)果表明，大亞灣海域野生對(duì)蝦群體攜帶早期死亡綜合征病菌的比率高，2018年所檢測(cè)月份的平均陽性率達(dá)29.93%，2019年達(dá)41.33%。陽性率在時(shí)間上無特定的分布規(guī)律，無論是夏季還是冬季均有攜帶可能，甚至出現(xiàn)高陽性率。

3 討論

我國(guó)對(duì)對(duì)蝦疾病研究得比較晚，雖然近年關(guān)于白斑綜合征及早期死亡綜合征的研究有了很大進(jìn)展，但很多問題仍未得到解決。國(guó)內(nèi)苗種培育的對(duì)蝦親本主要從南海海域捕撈或者從國(guó)外進(jìn)口，而大亞灣是我國(guó)南海的重要海灣，水產(chǎn)資源豐富，因此保護(hù)好大亞灣海域的水資源環(huán)境、生態(tài)環(huán)境是一項(xiàng)重要任務(wù)。通過檢測(cè)了解海區(qū)流行病的發(fā)生規(guī)律，掌握野生對(duì)蝦的健康情況，對(duì)維持和保護(hù)野生對(duì)蝦的種群穩(wěn)定、維持海洋生態(tài)平衡具有重要指導(dǎo)作用。

3.1 切斷病毒感染和傳播源頭，預(yù)防白斑綜合征暴發(fā)

對(duì)蝦白斑綜合征是由對(duì)蝦白斑綜合征病毒引起的對(duì)蝦傳染性疾病，是迄今為止被認(rèn)為是影響最大、危害最大的對(duì)蝦疾?。?6］。該病毒傳染性強(qiáng)，可以水平傳播，發(fā)病的蝦肉和發(fā)病蝦池里的浮游生物都能誘使健康對(duì)蝦發(fā)生急性白斑綜合征［17］；也能垂直傳播，對(duì)發(fā)病對(duì)蝦組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，對(duì)蝦精巢、精莢、卵巢中都有白斑綜合征分布［18］，而且以感染白斑綜合征的親蝦產(chǎn)卵育苗，其仔蝦也攜帶白斑綜合征［19］。白斑綜合征容易導(dǎo)致全池感染，病程短，感染白斑病后3～10 d死亡率高、可達(dá)100%［20］。至今仍沒有該病的有效治療方法，因此要通過早期預(yù)防來減少白斑綜合征感染。一般預(yù)防可從環(huán)境、蝦種本身和藥物等方面進(jìn)行。本調(diào)查結(jié)果顯示，大亞灣海域野生對(duì)蝦群體攜帶白斑綜合征病毒的比率較低，2019年全年陽性率均低于10%的水平。鑒于其攜帶率低的特點(diǎn)，通過對(duì)捕撈的親蝦進(jìn)行調(diào)查篩選，減少對(duì)蝦白斑病垂直傳播，可有效減少養(yǎng)殖生產(chǎn)中白斑綜合征的發(fā)生。為從源頭切斷白斑綜合征病毒的感染和傳播，通過人工選育的方法培育無病毒的親蝦群體，并以此培育無病毒的對(duì)蝦苗種顯得至關(guān)重要［15］。同時(shí)，育苗中應(yīng)做好生物餌料的病原檢測(cè)，確保合格再投入使用；養(yǎng)殖中控制放養(yǎng)密度，并通過在飼料中添加中草藥、粘多糖等制劑提高蝦苗免疫力，以達(dá)到預(yù)防白斑綜合征的暴發(fā)［21］。

3.2 改善養(yǎng)殖環(huán)境，控制養(yǎng)殖容量，實(shí)現(xiàn)早期死亡綜合征生態(tài)防控

早期死亡綜合征又稱急性肝胰腺壞死綜合征（AHPND），2009年該病在亞洲地區(qū)暴發(fā)，之后蔓延至全世界。該病一般在投苗30 d內(nèi)暴發(fā)［22］，發(fā)病急、致死率高、流行范圍廣。對(duì)蝦在投苗初期快速死亡，死亡損失可高達(dá)80%。病蝦顏色發(fā)白且?guī)⒓t，肝胰臟異常腫大且質(zhì)地松軟，游動(dòng)緩慢，通常在水面上或趴在養(yǎng)殖塘邊［22-23］。目前對(duì)早期死亡綜合征的發(fā)病機(jī)理還沒有定論，診斷和防治仍在努力完善中［24-25］。關(guān)于早期死亡綜合征的病因研究，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為該病的主因可能是一種副溶血性弧菌變異釋放出某種毒素［9］，同時(shí)惡劣的養(yǎng)殖環(huán)境促使其暴發(fā)［26］。對(duì)病蝦中的副溶血性弧菌菌株基因組序列進(jìn)行比較，鑒定出兩個(gè)與昆蟲毒素基因同源性很高的基因，是關(guān)鍵的早期死亡綜合征致病因子［9］。但這兩種毒素蛋白如何影響肝胰腺并導(dǎo)致對(duì)蝦發(fā)病尚不清楚。本調(diào)查結(jié)果顯示，大亞灣海域野生對(duì)蝦群體攜帶早期死亡綜合征病菌的比率高，且時(shí)間上呈現(xiàn)全年攜帶的趨勢(shì)，可見導(dǎo)致早期死亡綜合征的副溶血弧菌是環(huán)境中的一種常見菌，在養(yǎng)殖中發(fā)病很大可能是由惡劣環(huán)境所致，防控措施主要從養(yǎng)殖環(huán)境和容量控制兩方面進(jìn)行。養(yǎng)殖初期應(yīng)根據(jù)池塘條件合理控制放養(yǎng)密度，避免后期養(yǎng)殖生物量超出池塘環(huán)境承載力；養(yǎng)殖中后期應(yīng)做好投喂管理，避免過量投喂導(dǎo)致水體富營(yíng)養(yǎng)化，同時(shí)施以光合細(xì)菌、芽孢桿菌等有益微生態(tài)制劑，輔助建立良好的菌相、藻相等微生態(tài)環(huán)境，給蝦苗提供優(yōu)良生長(zhǎng)環(huán)境條件［6］。

4 結(jié)論

大亞灣海域野生對(duì)蝦群體的白斑綜合征病毒攜帶率及早期死亡綜合征病菌攜帶率在時(shí)間上無特定的分布規(guī)律，在夏季或冬季均有攜帶可能，甚至出現(xiàn)高陽性率。白斑綜合征病毒攜帶率總體處于較低水平，所檢測(cè)的14個(gè)月份中有5個(gè)月份未檢測(cè)到陽性樣品，2018年檢測(cè)月份的平均陽性率為22.96%，2019年所檢測(cè)月份的陽性率均低于10%的水平，平均陽性率為2.43%?；谄潢栃月瘦^低的特點(diǎn)，可通過對(duì)捕撈親蝦進(jìn)行調(diào)查篩選，培育無白斑綜合征的親蝦品系和對(duì)蝦苗種，配合餌料中病毒檢測(cè)以及養(yǎng)殖環(huán)境條件的控制，以達(dá)到預(yù)防白斑綜合征暴發(fā)。而早期死亡綜合征病菌攜帶率總體處于較高水平，2018年所檢測(cè)月份平均陽性率達(dá)29.93%，2019年達(dá)41.33%，單月最高陽性率可達(dá)94.00%。其發(fā)病很大可能是由于惡劣環(huán)境所致，因此可通過改善養(yǎng)殖環(huán)境、建立科學(xué)規(guī)范的養(yǎng)殖體系防止其在養(yǎng)殖生產(chǎn)中暴發(fā)。