miR-149靶向調(diào)控CARM1基因?qū)χ蹦c癌細(xì)胞放療敏感性

郭令飛 羅德紅 葛華 王燦

(遵義市第一人民醫(yī)院 1胃腸外科，貴州 遵義 563000；2腫瘤科)

放射治療在腫瘤治療中的地位越來越重要，而提高腫瘤放射治療的敏感性為腫瘤放射學(xué)的重大難題，近幾年用靶向精準(zhǔn)治療或基因治療增強(qiáng)放療的敏感性成為該領(lǐng)域的新方向。直腸癌為常見的消化道惡性腫瘤，其發(fā)病率、死亡率均有明顯上升〔1，2〕。微小RNAs(miRNAs)是由長(zhǎng)度19～24個(gè)核苷酸序列組成的短鏈非編碼微小RNA〔3〕，通過抑制靶基因的mRNA轉(zhuǎn)錄或阻遏蛋白的翻譯發(fā)揮腫瘤調(diào)控作用〔4〕。此外，還可調(diào)節(jié)癌細(xì)胞對(duì)化學(xué)療法和放射療法的敏感性〔5，6〕。共激活相關(guān)精氨酸甲基化轉(zhuǎn)移酶(CARM)1屬于蛋白精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶家族(PRMTs)成員〔7，8〕，在多種癌癥中均表現(xiàn)出促進(jìn)癌癥惡化的作用。但miR-149與CARM1在直腸癌中與放射治療的關(guān)系尚未清楚，本文對(duì)比展開了相關(guān)研究。

1 材料與方法

1.1材料 人結(jié)直腸上皮細(xì)胞HCEpiC、直腸癌細(xì)胞HT29均購(gòu)自ATCC；RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco；胎牛血清(FBS)購(gòu)自上海聯(lián)碩生物科技有限公司；噻唑藍(lán)(MTT)購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司；LipofectamineTM2000購(gòu)自上海陽光生物科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自北京百奧萊博有限公司；聚偏氟乙烯(PVDF)膜購(gòu)自德國(guó)羅氏診斷有限公司；電化學(xué)發(fā)光液購(gòu)自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；放射免疫沉淀法(RIPA)蛋白裂解液購(gòu)自杭州昊鑫生物科技有限公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司；膜聯(lián)蛋白(Annexin)V-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(PI)凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自成都艾為特生物科技有限公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 將結(jié)直腸上皮細(xì)胞HCEpiC、直腸癌細(xì)胞HT29用含10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基在37℃ 5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)、傳代。

1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組 將正常培養(yǎng)的結(jié)直腸上皮細(xì)胞HCEpiC、直腸癌細(xì)胞HT29分別標(biāo)記為HCEpiC組、HT29組。將miR-con、miR-149模擬物(mimics)、miR-149 mimics+pcDNA、miR-149 mimics+pcDNA-CARM1按照脂質(zhì)體LipofectamineTM2000試劑說明書的要求操作轉(zhuǎn)染至HT29，轉(zhuǎn)染8 h后，更換為新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，再用qRT-PCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，確認(rèn)轉(zhuǎn)染成功后將其分別標(biāo)記為miR-con組、miR-149組、miR-149+pcDNA組、miR-149+pcDNA-CARM1。NC組為正常培養(yǎng)的HT29細(xì)胞，此組細(xì)胞未進(jìn)行轉(zhuǎn)染或其他處理。用Siemens Primus直線加速器6MV高能X線室溫照射，劑量率為3 Gy/min，以4 Gy垂直照射10 cm×10 cm范圍，距靶源 30 cm，輻照后置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，標(biāo)記為IR+miR-con組、IR+miR-149組、IR+miR-149+pcDNA組、IR+miR-149+pcDNA-CARM1組，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.4qRT-PCR 收集細(xì)胞，用RNA抽提試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行RNA的提取和cDNA的合成。最后再用qRT-PCR試劑盒進(jìn)行miR-149、CARM1表達(dá)的檢測(cè)。以U6、GAPDH為內(nèi)參，用2-△△Ct計(jì)算miR-149、CARM1的相對(duì)表達(dá)。miR-149上游引物5′-GTTTCTGGCTCCGTGT-3′，下游引物5′-CAGTGCGTGTGGTGGACT-3′；U6上游引物5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，下游引物5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT3-′；CARM1上游引物5′-CAAATTCCCACATGCTGCATT3-′，下游引物5′-TGGCAATAAGCAGACATGACC-3′；GAPDH上游引物5′-AGCCACATCGCTCAGACAC-3′，下游引物5′-GCCCAATACGACCAAATCC-3′。

1.5Western印跡 收集細(xì)胞，用RIPA裂解液在冰上裂解細(xì)胞30 min，再用冷凍離心機(jī)12 000 r/min離心10 min，取上清液。將上清用5×十二烷基硫酸鈉(SDS)上樣緩沖液煮沸10 min進(jìn)行變性，取上清進(jìn)行上樣。電泳結(jié)束后用轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，再用5 %的脫脂奶粉進(jìn)行封膜2 h，洗膜。將膜置于一抗稀釋液中，4℃孵育過夜，洗膜，將膜轉(zhuǎn)移至二抗稀釋液中，室溫下孵育2 h。最后加發(fā)光液并進(jìn)行曝光，測(cè)定CARM1、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)。

1.6雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn) 收集細(xì)胞，按雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒技術(shù)手冊(cè)要求操作。psicheck2通路載體以螢火蟲熒光素酶活性為內(nèi)參，將psiCHECK2-CARM1-3′非編碼區(qū)(UTR)野生型(WT)和psicheck2-CARM1-3′UTR突發(fā)型(MUT)分別于miR-con、miR-149 mimics共轉(zhuǎn)染，培養(yǎng)48 h，檢測(cè)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。海參熒光素酶的熒光活性與螢火蟲熒光素酶熒光活性的比值表示CARM1基因的激活程度。

1.7MTT實(shí)驗(yàn) 收集細(xì)胞，調(diào)整密度至5×106個(gè)/ml，取200 μl，然后加入20 μl MTT(5 g/L)溶液，培養(yǎng)4 h，棄上清，再加入150 μl的DMSO，輕輕晃動(dòng)使結(jié)晶溶解，在490 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)細(xì)胞的吸光度(OD490nm)。

1.8Annexin V-FITC/PI雙染實(shí)驗(yàn) 收集細(xì)胞，用500 μl結(jié)合緩沖液將細(xì)胞懸浮，分別加入5 μl的 Annexin V-FITC和10 μl的PI，室溫下避光反應(yīng)20 min，結(jié)束后立刻上流式細(xì)胞儀分析凋亡情況。細(xì)胞凋亡率(%)=早期凋亡率+晚期凋亡率。

1.9克隆形成實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞使用Siemens Primus直線加速器6MV高能X線室溫照射，劑量率為3 Gy/min，以0、2、4、6 Gy垂直照射10 cm×10 cm范圍，距靶源 30 cm，在放射照射后進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，每2～3 d換液1次，培養(yǎng)10～14 d。當(dāng)能用肉眼觀察到小白點(diǎn)時(shí)進(jìn)行甲醇固定(15 min)和吉姆薩染色(25 min)，最后進(jìn)行克隆計(jì)數(shù)。采用單擊多靶模型和線性二次函數(shù)擬合細(xì)胞放射劑量存活曲線分別求出放射生物學(xué)參數(shù)平均致死劑量(D0)、擬閾劑量(Dq)、外推值(N)和α、β、α/β、癌細(xì)胞在輻射照射后的存活分?jǐn)?shù)(SF)2值。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用GraphPad Prism6.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1結(jié)直腸癌細(xì)胞中miR-149和CARM1的表達(dá) 與HCEpiC組相比，HT29組miR-149表達(dá)量顯著降低，CARM1 mRNA和蛋白表達(dá)量顯著升高(均P<0.001)。見圖1、表1。

圖1 HCFpiC、HT29細(xì)胞中CARM1的表達(dá)

表1 結(jié)直腸癌細(xì)胞中miR-149和CARM1的表達(dá)

2.2miR-149靶向CARM1 在miRcode數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)得到miR-149與CARM1 3′UTR存在結(jié)合位點(diǎn)(圖2)；與miR-con組相比，miR-149組WT-CARM1細(xì)胞中熒光活性顯著降低。見表2；與miR-con組(1.00±0.08)相比，miR-149組細(xì)胞中CARM1表達(dá)(0.17±0.02)顯著降低；與anti-miR-con組(1.03±0.07)相比，anti-miR-149組細(xì)胞中CARM1表達(dá)(1.63±0.11)顯著升高(P<0.05)。見圖3。

圖2 miR-149靶向CARM1的3′UTR

表2 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

圖3 Western印跡檢測(cè)CARM1表達(dá)

2.3過表達(dá)CARM1逆轉(zhuǎn)了過表達(dá)miR-149對(duì)結(jié)直腸癌HT29細(xì)胞活性的影響 與miR-con組相比，miR-149組CARM1顯著降低(P<0.05)，培養(yǎng)后48、72 h細(xì)胞的活性顯著降低(P<0.05)；與miR-149+pcDNA組相比，miR-149+pcDNA-CARM1組CARM1表達(dá)顯著升高(P<0.05)，培養(yǎng)后48、72 h時(shí)細(xì)胞活性顯著升高(P<0.05)。見圖4，表3。

表3 過表達(dá)CARM1逆轉(zhuǎn)了過表達(dá)miR-149對(duì)結(jié)直腸癌HT29細(xì)胞增殖的影響

1～4：miR-con組、miR-149組、miR-149+pcDNA組、miR-149+pcDNA-CRAM1組圖4 結(jié)直腸癌HT29細(xì)胞中CARM1的表達(dá)

2.4過表達(dá)CARM1逆轉(zhuǎn)了過表達(dá)miR-149對(duì)結(jié)直腸癌HT29細(xì)胞凋亡的影響 與miR-con組〔(6.27±0.71)%〕相比，miR-149組HT29細(xì)胞凋亡率〔(18.29±1.23)%〕顯著升高(P<0.05)；與miR-149+pcDNA組〔(17.36±1.45)%〕相比，miR-149+pcDNA-CARM1組細(xì)胞凋亡率〔(10.52±1.03)%〕顯著降低(P<0.05)。

2.5過表達(dá)CARM1逆轉(zhuǎn)了過表達(dá)miR-149對(duì)結(jié)直腸癌HT29細(xì)胞輻照敏感性的影響 與miR-con組相比，miR-149組細(xì)胞SF2顯著降低；與miR-149+pcDNA組相比，miR-149+pcDNA-CARM1組細(xì)胞SF2顯著升高(P<0.05)。miR-149過表達(dá)和CARM1過表達(dá)放射后單擊多靶模型擬合的參數(shù)值見表4。

表4 各組輻照后單擊多靶模型擬合的參數(shù)值

2.6過表達(dá)CARM1逆轉(zhuǎn)了過表達(dá)miR-149對(duì)輻照結(jié)直腸癌HT29細(xì)胞凋亡蛋白的影響 結(jié)果如圖5和表5所示，與miR-con組相比，miR-149組細(xì)胞中B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2蛋白表達(dá)顯著降低，Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)表達(dá)顯著升高(均P<0.05)；與miR-149+pcDNA組相比，miR-149+pcDNA-CARM1組Bax表達(dá)顯著降低，Bcl-2表達(dá)顯著升高(均P<0.05)；與IR+miR-con組相比，IR+miR-149組Bax表達(dá)顯著升高，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低(均P<0.05)；與IR+miR-149+pcDNA組相比，IR+miR-149+pcDNA-CARM1組Bax表達(dá)顯著降低，Bcl-2表達(dá)顯著升高(均P<0.05)。

1～9：NC組、miR-con組、miR-149組、miR-149+pcDNA組、miR-149+pcDNA-CRAM1組、IR+miR-con組、IR+miR-149組、IR+miR-149+pcDNA組、IR+miR-149+pcDNA-CRAM1組圖5 過表達(dá)CARM1逆轉(zhuǎn)了過表達(dá)miR-149對(duì)結(jié)直腸癌HT29細(xì)胞凋亡蛋白Bax、Bcl-2表達(dá)的影響

表5 過表達(dá)CARM1逆轉(zhuǎn)了過表達(dá)miR-149對(duì)結(jié)直腸癌HT29細(xì)胞凋亡蛋白Bax、Bcl-2的表達(dá)量

3 討 論

miRNA在人類各種癌癥中扮演著原癌基因或致癌基因的角色，其在不同癌癥中的功能也存在較大的差異〔9，10〕。研究報(bào)道，miR-149在結(jié)直腸癌中發(fā)揮抑制癌癥惡化的作用〔11〕，但其具體的作用機(jī)制尚未清晰。Zhang等〔12〕在結(jié)直腸癌的研究中報(bào)道，miR-149在結(jié)直腸癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，且上調(diào)miR-149的表達(dá)可抑制細(xì)胞的遷移和侵襲，其直接靶標(biāo)肝配蛋白B受體(EphB)3沉默處理后可在體內(nèi)外抑制腫瘤的生長(zhǎng)，甚至可逆轉(zhuǎn)上調(diào)miR-149對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移侵襲的抑制作用，推測(cè)miR-149可作為結(jié)直腸癌治療的治療靶標(biāo)。本研究雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-149可直接靶向CARM1，為miR-149在結(jié)直腸癌中的機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。miRNA在腫瘤中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)十分復(fù)雜，單個(gè)miRNA可同時(shí)靶向多個(gè)目標(biāo)基因，單個(gè)靶基因又可受多個(gè)miRNA的共同調(diào)控，如miR-149還可通過下調(diào)人附睪蛋白(HE)4增強(qiáng)大腸癌對(duì)放射照射的敏感性〔13〕。因此miRNA的作用機(jī)制仍有待繼續(xù)研究，其在臨床上應(yīng)用還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。miR-149在結(jié)直腸癌中的下游也許還有未發(fā)現(xiàn)的靶基因，本研究為miR-149在結(jié)直腸癌中的調(diào)控機(jī)制提供理論參考。

CARM1具有PRMTs家族催化精氨酸的功能〔14〕，進(jìn)而參與基因的轉(zhuǎn)錄后修飾，在調(diào)控細(xì)胞生存和周期方面的作用尤為突出〔15，16〕。除此之外，CARM1還可作為多種核受體轉(zhuǎn)錄的激活子，也可激活其他的轉(zhuǎn)錄因子〔17，18〕。CARM1在多種癌癥中高表達(dá)，發(fā)揮促進(jìn)癌癥惡性進(jìn)程的作用〔19～21〕。Li等〔22〕在結(jié)腸癌的研究中發(fā)現(xiàn)，miR-195下調(diào)、CARM1上調(diào)，且 miR-195過表達(dá)或CARM1敲低均可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的集落形成，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，促進(jìn)了Bax和磷酸化組蛋白2A變異體(γ-H2AX)的表達(dá)，并抑制了結(jié)腸癌細(xì)胞中Bcl-2的表達(dá)，并驗(yàn)證了CARM1為miR-195的功能靶標(biāo)，更重要的是CARM1的恢復(fù)表達(dá)逆轉(zhuǎn)了由miR-195誘導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞的增強(qiáng)放射敏感性作用，miR-195可增加結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)體內(nèi)輻射的敏感性，提示miR-195通過抑制CARM1增強(qiáng)結(jié)腸癌細(xì)胞的放射敏感性，有望成為結(jié)腸癌放射治療的靶標(biāo)。

綜上，miR-149可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的活性并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)放射治療的敏感性，其機(jī)制可能與靶向CARM1有關(guān)，為基因治療增殖放射的敏感性提供理論支持。