miR-195-5p靶向HMBOX1調控胃癌細胞增殖遷移侵襲及凋亡的機制

田由京 張浩 陳興超 李軍 李合

(海南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院普通外科，海南 ?？?570102)

微小RNA(miRNA)是在18～24個核苷酸組成的人類進化中高度保守的穩(wěn)定遺傳的短鏈miRNA分子，其特征為不編碼蛋白質。miRNA在人類的多種疾病中都可通過抑制靶基因的轉錄或蛋白翻譯而發(fā)揮一定的調控功能，如癌癥、糖尿病及其并發(fā)癥、神經退行性疾病及其他各種疾病〔1〕。miR-195-5p不僅可通過靶向鋅指蛋白(ZNF)139調控胃癌細胞的耐藥性〔2〕，還參與胃癌細胞的細胞表型變化，但是其在胃癌中的作用機制是否與含有1的同源框(HMBOX)1相關尚且未知。HMBOX1在N-末端含有同源框結構域，在C-末端含有HNF1-N結構域，屬于同源框基因家族成員。HMBOX1在不同物種間高度保守〔3〕，并且在人10種正常組織的細胞質和細胞核中檢測到，包括大腦、胰腺、腎和肝〔4〕。最近研究報道，HMBOX1在癌癥中出現(xiàn)異常表達，其中包括胃癌〔5〕。本研究檢測miR-195-5p、HMBOX1在胃癌細胞的表達水平，評估二者對胃癌HGC-27細胞增殖、遷移侵襲和凋亡的影響，并揭示miR-195-5p對HMBOX1的靶向作用，旨在闡明其潛在機制。

1 材料與方法

1.1材料 正常胃上皮細胞(GES)-1、胃癌細胞N87、 SGC-7901、HGC-27均購自ATCC；達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)培養(yǎng)基、噻唑藍(MTT)、胰蛋白酶均購自美國Sellect公司；LipofectamineTM2000、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒、逆轉錄試劑盒購自大連Takara公司；聚偏乙烯(PVDF)膜購自德國羅氏診斷有限公司； 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)試劑盒、ECL發(fā)光液和放射性免疫沉淀法(RIPA)蛋白裂解液均購自碧云天生物技術公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國Promega公司；Matrigel基質膠、Transwell小室購自美國Coming公司；Annexin 異硫氰酸熒光素標記的膜聯(lián)素V/碘化丙啶(V-FITC/PI)凋亡檢測試劑盒購自北京索萊寶公司。

1.2細胞培養(yǎng) 將GES-1、SGC-7901、N87、HGC-27細胞在DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其中包含10%胎牛血清，并置于37℃,5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中孵育，觀察細胞生長至75%融合時，加入胰蛋白酶消化1 min，以1∶3的比例更換新鮮的培養(yǎng)基，每隔1 d傳代一次。

1.3脂質體轉染與細胞分組 將miR-NC、miR-195-5p、si-NC、si-HMBOX1、miR-195-5p和pcDNA、miR-195-5p和pcDNA-HMBOX1遵循脂質體轉染試劑LipofectamineTM2000說明書轉染到HGC-27細胞中，分別標記為miR-NC組、miR-195-5p組、si-NC組、si-HMBOX1組、miR-195-5p+pcDNA組、miR-195-5p+pcDNA-HMBOX1組，用于后續(xù)試驗。

1.4qRT-PCR實驗檢測細胞中miR-195-5p、HMBOX1的表達 Trizol法提取GES-1、SGC-7901、N87、HGC-27細胞樣本總RNA,RNA的定量采用Nano-Drop 2000微量分光光度計進行測定。DNaseⅠ消化RNA中可能污染的DNA。通過逆轉錄試劑盒進行逆轉錄反應，步驟依照試劑盒說明書進行，合成cDNA。以cDNA為模板鏈，按照反應體系進行擴增，反應結束后，收集Ct值，每個樣品收集3次重復的平均值，以2-△△Ct法計算定量結果，測定miR-195-5p、HMBOX1的相對表達水平。

1.5MTT法檢測細胞增殖 取1.3中各分組HGC-27細胞，加入20 μl的MTT溶液(5 g/L)，反應3.5～4.0 h，然后棄去上清，每孔加入150 μl 二甲基亞砜(DMSO)，充分震蕩溶解結晶，檢測490 nm波長下的細胞吸光度(A)。

1.6Western印跡實驗檢測細胞中HMBOX1、survivin、MMP2、MMP9、Bcl-2、Bax的蛋白表達 各分組HGC-27細胞中加入裂解液，在冰上裂解，30 min后12 000 r/min離心10 min。吸取上清于EP管，加入5×SDS上樣緩沖液，沸水變性10 min。電泳后通過轉膜儀將分離的蛋白轉至PVDF膜；將膜在5%脫脂奶粉中封閉，2 h后洗滌膜，加入目的蛋白Ⅰ抗，4℃孵育過夜，次日洗滌膜，加Ⅱ抗，4℃孵育2 h。加增強化學發(fā)光液，曝光。

1.7Transwell 實驗檢測細胞的遷移和侵襲miR-195-5p與HMBOX1 在6孔板中接種HGC-27細胞，密度為106個/孔，常規(guī)培養(yǎng)細胞。當其達到90%融合度時，更換為無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h。之后調整細胞密度為105個/ml，在上室添加100 μl，下室添加600 μl含血清的培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)。24 h后取出小室，用無菌棉簽擦除上室內的HGC-27細胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗2次，加入甲醇固定，30 min后加入0.1%結晶紫，染色20 min，PBS漂洗2次。置顯微鏡下觀察Transwell小室下表面附著的遷移細胞，隨機取3個視野拍照計數，取平均數。

在Transwell小室上室鋪適量基質膠，風干后按照上述檢測步驟進行操作。最后于顯微鏡下觀察并統(tǒng)計小室下表面附著的侵襲細胞。

1.8流式細胞術檢測細胞凋亡 用500 μl的結合緩沖液懸浮HGC-27細胞，分別加入5 μl的 Annexin V-/ FITC和5 μl的PI，避光反應20 min，細胞經300目銅篩過濾，在1 h內立即于流式細胞儀進行檢測。細胞凋亡率(%)= 早期凋亡率(%)+晚期凋亡率(%)。

1.9雙熒光素酶報告基因檢測實驗檢測細胞中miR-195-5p與HMBOX1的結合力 將HMBOX1 3′非編碼區(qū)(UTR)-野生型(WT)(含HMBOX1 3′UTR片段)和HMBOX1 3′ UTR-突變型(MUT)的熒光素酶報告載體，利用LipofectamineTM2000轉染試劑分別與miR-195-5p或miR-NC共轉染，轉染24 h后，按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒技術手冊操作，分別記錄螢火蟲和海腎的熒光素酶激發(fā)值，以二者的比值分析miR-195-5p與HMBOX1之間的結合力。

1.10統(tǒng)計學處理 采用SPSS21.0軟件進行方差分析，t檢驗。

2 結 果

2.1胃癌細胞中miR-195-5p、HMBOX1的表達 與GES-1組相比，SGC-7901組、N87組、HGC-27組細胞中miR-195-5p mRNA表達均明顯減少，而HMBOX1 mRNA和蛋白表達均明顯增加(P<0.05)。最適細胞選定為HGC-27細胞。見圖1，表1。

圖1 HMBOX1在胃癌細胞中的表達

表1 miR-195-5p、HMBOX1在胃癌細胞中的表達

2.2過表達miR-195-5p對胃癌細胞HGC-27增殖、遷移、侵襲及凋亡的影響 與miR-NC組比較，miR-195-5p組胃癌HGC-27細胞中miR-195-5p表達明顯增加，細胞活性顯著降低，細胞遷移和侵襲量明顯減少，細胞凋亡率顯著升高(均P<0.001)。見表2。

表2 過表達miR-195-5p對胃癌細胞增殖遷移侵襲及凋亡的影響

2.3兩組survivin、P21、MMP2、MMP9、Bcl-2、Bax蛋白表達比較 與miR-NC組比較，miR-195-5p組胃癌HGC-27細胞的survivin、MMP2、MMP9、Bcl-2蛋白表達均明顯降低，P21、Bax的蛋白表達則顯著升高(均P<0.001)。見表3，圖2。

表3 兩組survivin、P21、MMP2、MMP9、Bcl-2、Bax蛋白表達比較

圖2 過表達miR-195-5p的HGC-27細胞中相關蛋白的表達

2.4miR-195-5p靶向HMBOX1 生物信息學分析預測結果如圖3所示，miR-195-5p與HMBOX1的部分堿基存在互補配對現(xiàn)象。miR-195-5p組WT-HMBOX1細胞熒光活性顯著低于miR-NC組，而兩組MUT-HMBOX1細胞熒光活性無顯著差異。見表4。Western與anti-miR-NC組(1.01±0.01)相比，anti-miR-195-5p組HGC-27細胞中HMBOX1蛋白表達(3.30±0.43)明顯升高；與miR-NC組(1.00±0.01)比較，miR-195-5p組HGC-27細胞中HMBOX1蛋白表達(0.21±0.02)顯著降低(均P<0.05)。見圖4。

圖3 miR-195-5p與HMBOX1的靶向結合位點

表4 雙熒光素酶報告基因檢測實驗結果

1～4：anti-miR-NC組、anti-miR-195-5p組、miR-NC組、miR-195-5p組圖4 Western印跡檢測HMBOX1蛋白表達

2.5敲減HMBOX1對胃癌細胞HGC-27增殖、遷移、侵襲與凋亡的影響 與si-NC組比較，si-HMBOX1組胃癌HGC-27細胞中HMBOX1表達顯著降低，細胞增殖、細胞遷移和侵襲量均明顯降低，細胞凋亡率顯著增加及survivin、MMP2、MMP9和Bcl-2蛋白表達明顯減少，P21和Bax蛋白表達顯著增加(均P<0.05)。見表5，表6，圖5。

表5 敲減HMBOX1對HGC-27細胞增殖遷移侵襲及凋亡的影響

表6 各組相關蛋白表達比較

圖5 敲減HMBOX1對HGC-27細胞中相關蛋白表達的影響

2.6過表達HMBOX1逆轉了miR-195-5p對胃癌細胞HGC-27增殖、遷移、侵襲與凋亡的影響 與miR-195-5p組比較，miR-195-5p+pcDNA-HMBOX1組HGC-27細胞中HMBOX1表達明顯升高，細胞增殖、細胞遷移和侵襲量均顯著增加，細胞凋亡率明顯降低，且survivin、MMP2、MMP9和Bcl-2蛋白表達均顯著升高，P21和Bax蛋白表達顯著降低(P<0.05)。見圖6，表7、表8。

1～3：miR-195-5p組、miR-195-5p+pcDNA組、miR-195-5p+pcDNA-HMBOX1組圖6 過表達HMBOX1和miR-195-5p的HGC-27細胞中相關蛋白表達

表7 過表達HMBOX1逆轉miR-195-5p對胃癌細胞增殖、遷移、侵襲及凋亡的影響

表8 各組胃癌細胞相關蛋白表達比較

3 討 論

miRNA在人類癌癥中的致癌或抑癌作用得到普遍認可。miRNA可通過抑制信使RNA的轉錄或蛋白翻譯而發(fā)揮調控癌癥進展的作用，但是其調控網絡極其復雜〔6〕。每個miRNA都可調控多個靶基因，而一個靶基因又可同時被多個miRNA調控〔7〕，這在一定程度上增加了miRNA作用機制研究的難度，也為miRNA在癌癥中的治療提供了難度。Wang等〔8〕發(fā)現(xiàn)，miR-195-5p在胃癌細胞中的表達水平下調，且與堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)的表達水平呈負相關，miR-195-5p通過下調bFGF，抑制胃癌細胞的遷移和侵襲及異種移植小鼠模型中的腫瘤生長，這可以通過重新引入bFGF來恢復，揭示miR-195-5p通過抑制bFGF抑制胃癌的腫瘤生長，提示miR-195-5p和bFGF可作為胃癌治療的潛在靶點。Wang等〔9〕研究發(fā)現(xiàn)，miR-195-5p通過靶向三部分基序(TRIM)14基因，并調控蛋白激酶B(AKT)信號通路，從而在胃癌細胞中的上皮間質化及遷移侵襲過程發(fā)揮作用。本實驗結果發(fā)現(xiàn)，miR-195-5p表達明顯下調。過表達miR-195-5p對胃癌細胞HGC-27的增殖、遷移和侵襲能力具有抑制作用，這均與前人報道〔8，9〕相一致；此外，過表達miR-195-5p對胃癌細胞凋亡顯示出促進作用，這是國內外首次報道，為miR-195-5p在胃癌中的功能探索提供更充分的理論依據。進一步的，生物信息學預測、雙熒光素酶報告基因檢測實驗研究表明，miR-195-5p靶向并負調控HMBOX1的表達，這也是首次發(fā)現(xiàn)在胃癌中miR-195-5p可靶向HMBOX1，推測這與miR-195-5p的作用機制關系密切。

HMBOX1在人類的多種癌癥中均出現(xiàn)異常表達，如在高漿液性卵巢癌中低表達并促進癌細胞增殖〔10〕，在肝癌中通過促進自噬、抑制免疫逃避發(fā)揮抑肝癌作用〔11〕。Diao等〔12〕在胃癌的研究中報道，HMBOX1在胃癌組織和細胞系中的表達異常上調，并與胃癌患者的TNM分期、淋巴結轉移和總生存期相關， HMBOX1在胃癌細胞中的過表達通過加速細胞周期、誘導細胞遷移來增強細胞增殖，相反，沉默HMBOX1抑制了這些作用，此外，該研究還發(fā)現(xiàn)CD133的表達與胃癌組織中的HMBOX1呈顯著正相關，HMBOX1和CD133的共表達與胃癌患者預后不良顯著相關，特別是對于Ⅲ和Ⅳ期患者，揭示了HMBOX1在胃癌中上調并與胃癌細胞增殖和遷移的相關性，提示，HMBOX1聯(lián)合CD133可能有助于預測晚期胃癌患者的生存。谷軍保等〔13〕報道，在胃癌細胞中，HMBOX1的表達水平受miR-221的靶向負調控，進而參與胃癌細胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡的調控及裸鼠成瘤的生長。本實驗結果與Diao等〔12〕、谷軍保等〔13〕實驗結果相一致；深入研究發(fā)現(xiàn)，過表達HMBOX1后，miR-195-5p抑制胃癌細胞增殖、遷移、侵襲的作用及促進細胞凋亡的作用被逆轉，這即說明miR-195-5p可靶向調控HMBOX1，更說明了HMBOX1也可逆向調控miR-195-5p的表達及功能。