三氧化二砷聯(lián)合維生素C對(duì)多發(fā)性骨髓瘤患者M(jìn)MP-13、NF-κB-p65、C/EBPα表達(dá)及預(yù)后的影響

付明倜 茍麗 劉珊珊 李莎莎

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院外科醫(yī)學(xué)部,河南 鄭州 450052)

多發(fā)性骨髓瘤好發(fā)于中老年人，發(fā)病率占血液系統(tǒng)惡性腫瘤的10%左右，且緩解率低〔1，2〕。多發(fā)性骨髓瘤一經(jīng)發(fā)現(xiàn)就應(yīng)積極治療，以提高患者生存質(zhì)量，延長(zhǎng)其生存期。當(dāng)前多發(fā)性骨髓瘤的治療可采取化療及骨髓移植等方法。但是化療副作用大，患者耐受程度低，骨髓移植受供體和經(jīng)濟(jì)條件限制，故尋求及時(shí)有效的治療方法尤為重要。近年研究發(fā)現(xiàn)三氧化二砷或與化療聯(lián)合治療多發(fā)性骨髓瘤具有良好的療效〔3〕。研究發(fā)現(xiàn)，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)參與多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)生、發(fā)展〔4，5〕。CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白(C/EBP)α基因表達(dá)降低可促使腫瘤形成及發(fā)展〔6〕。因此，本研究探討三氧化二砷聯(lián)合維生素C對(duì)多發(fā)性骨髓瘤患者M(jìn)MP-13、核因子(NF)-κB-p65、C/EBPα表達(dá)及預(yù)后的影響。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2015年1月至2018年1月鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院收治的符合多發(fā)性骨髓瘤診斷〔7〕的患者102例，隨機(jī)分為觀察組與對(duì)照組。觀察組51例，男37例，女14例；年齡65～78〔平均(72.37±2.46)〕歲；臨床分期：Ⅰ期14例，Ⅱ期23例，Ⅲ期14例；其中初發(fā)15例，復(fù)發(fā)36例。對(duì)照組51例，男35例，女16例；年齡67～75〔平均(71.84±2.32)〕歲；臨床分期：Ⅰ期13例，Ⅱ期25例，Ⅲ期13例；其中初發(fā)16例，復(fù)發(fā)35例。兩組性別、年齡、臨床分期比較無(wú)明顯差異(P>0.05)。

1.2選擇標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)骨髓細(xì)胞學(xué)、免疫球蛋白、血漿蛋白電泳、X線及臨床等確診為多發(fā)性骨髓瘤；②患者年齡≥65歲；③簽訂知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他惡性腫瘤者；②精神疾病者；③化療禁忌者；④合并心肺、肝腎嚴(yán)重異常者。

1.3方法 對(duì)照組：采取常規(guī)化療方案，按照患者具體情況選擇不同治療方案，其中初發(fā)患者選擇MP化療方案，每日注射潑尼松60 mg、左旋苯丙氨酸氮芥(馬法蘭)6 mg；復(fù)治患者選擇VAD化療方案，每日靜滴長(zhǎng)春新堿1 mg、多柔比星10 mg、地塞米松20～40 mg；均以3 w為1個(gè)周期，休息1 w。觀察組：采取采用三氧化二砷聯(lián)合維生素C治療，具體方案：10%三氧化二砷15 ml/d，維生素C每次1 g、每周2次，4 w為1個(gè)療程。兩組療程均為12 w。

1.4療效標(biāo)準(zhǔn) ①完全緩解：患者血液和尿液檢查均無(wú)M蛋白出現(xiàn)，且通過(guò)骨骼X線示漿細(xì)胞比例5%以下；②部分緩解：患者血液和尿液中M蛋白含量減少，并且正常漿細(xì)胞直徑和比例均有所減少；③無(wú)效：患者血液和尿液中M蛋白含量無(wú)明顯變化，甚至增長(zhǎng)。

1.5觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法 ①血漿MMP-13水平變化。分別于治療前后抽取兩組研究對(duì)象靜脈血，分離血漿，離心半徑10 cm，離心10 min，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定MMP-13水平。②NF-κB-p65蛋白陽(yáng)性表達(dá)情況。分別于治療前后對(duì)兩組研究對(duì)象NF-κB-p65蛋白陽(yáng)性表達(dá)情況采用免疫組化法進(jìn)行檢測(cè)，具體方法：于髂后上棘局部麻醉后取骨髓組織，按照免疫組化試劑盒操作步驟檢測(cè)NF-κB-p65蛋白表達(dá)。③C/EBPα mRNA表達(dá)。具體方法：分別于治療前后采集兩組研究對(duì)象的骨髓血3 ml，采用TRIzol試劑提取總RNA，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TakaRa)合成cDNA；反應(yīng)條件：40℃ 20 min、92℃ 10 s；按照RT-PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)配置反應(yīng)體系，共25 μl。反應(yīng)條件：95℃10 s、58℃ 15 s、72℃ 30 s，共32個(gè)循環(huán)，采用2-△△CT法測(cè)定C/EBPα基因相對(duì)表達(dá)水平。④預(yù)后情況。兩組均隨訪12個(gè)月，統(tǒng)計(jì)患者無(wú)進(jìn)展生存時(shí)間(PFS)和總生存期(OS)。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行t及χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1兩組療效比較 觀察組總有效率明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 兩組療效比較〔n(%),n=51〕

2.2兩組治療前后血漿MMP-13水平比較 觀察組與對(duì)照組治療前血漿MMP-13水平比較無(wú)明顯差異(t=0.635，P=4.696)；兩組治療后血漿MMP-13水平較治療前明顯降低(觀察組：t=18.270，P=0.017；對(duì)照組：t=10.805，P=0.024)；且觀察組治療后血漿MMP-13水平明顯低于對(duì)照組(t=10.549，P=0.019)。見(jiàn)表2。

2.3兩組治療前后NF-κB-p65蛋白表達(dá)陽(yáng)性率比較 兩組治療前NF-κB-p65蛋白表達(dá)陽(yáng)性率比較無(wú)明顯差異(χ2=0.048，P=5.622)；兩組治療后NF-κB-p65蛋白表達(dá)陽(yáng)性率較治療前明顯降低(觀察組：χ2=28.990，P=0.347，對(duì)照組：χ2=11.492，P=0.035)；觀察組治療后NF-κB-p65蛋白表達(dá)陽(yáng)性率明顯低于對(duì)照組(χ2=5.830，P=0.022)。見(jiàn)表2。

2.4兩組治療前后C/EBPα mRNA表達(dá)比較 兩組治療前C/EBPα mRNA表達(dá)比較無(wú)明顯差異(t=0.757，P=7.659)；兩組治療后C/EBPα mRNA表達(dá)較治療前明顯升高(觀察組：t=24.277，P=0.011；對(duì)照組：t=8/913，P=0.038)；觀察組治療后C/EBPα mRNA表達(dá)明顯高于對(duì)照組(t=8.570，P=0.016)。見(jiàn)表2。

表2 兩組治療前后血漿MMP-13、NF-κB-p65蛋白及C/EBPα mRNA表達(dá)比較

2.5兩組預(yù)后比較 經(jīng)過(guò)隨訪，觀察組預(yù)后明顯優(yōu)于對(duì)照組，PFS和OS明顯長(zhǎng)于對(duì)照組(均P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 兩組PFS和OS比較個(gè)月)

3 討 論

多發(fā)性骨髓瘤是臨床發(fā)病率較高的一種血液腫瘤疾病〔8，9〕。目前，國(guó)內(nèi)治療多發(fā)性骨髓瘤采取傳統(tǒng)的化療方案仍可發(fā)揮重要作用，但其療效并不十分理想〔10～12〕。因此，尋找安全有效的治療多發(fā)性骨髓瘤方法尤為重要。

腫瘤血管形成與腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)之間存在相互促進(jìn)的關(guān)系。一方面，腫瘤細(xì)胞通過(guò)分泌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，引發(fā)周圍組織的血管形成，另一方面，形成的血管對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)與氧氣支持，二者互相依賴，互為因果〔13〕。血管新生在多發(fā)性骨髓瘤發(fā)病機(jī)制中具有重要作用。三氧化二砷可通過(guò)間接或直接途徑抑制血管生成〔14〕。三氧化二砷一方面可以通過(guò)促進(jìn)腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，干擾內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞之間的相互促進(jìn)作用，而誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)〔15〕。另一方面，有研究表明三氧化二砷可抑制白血病細(xì)胞分泌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，從而誘導(dǎo)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，可引起相關(guān)腫瘤壞死和血管生成減少〔16〕。此外，三氧化二砷還可抑制多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡〔17〕。維生素C一般作為抗氧化劑使用，但在一定條件下也可成為氧化劑，尤其是在由促進(jìn)活性氧(ROS)產(chǎn)生的物質(zhì)存在時(shí)。研究報(bào)道顯示，維生素C可增強(qiáng)三氧化二砷對(duì)耐藥的多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的殺傷作用〔18〕。本研究表明，三氧化二砷聯(lián)合維生素C可提高療效及延長(zhǎng)生存時(shí)間。

近年研究表明多發(fā)性骨髓瘤中MMP-13主要由骨髓瘤細(xì)胞合成分泌，并且是參與溶骨性骨質(zhì)破壞的一種重要破骨細(xì)胞活化因子〔19〕。且相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，MMP-13水平變化在惡性腫瘤的溶骨性骨轉(zhuǎn)移發(fā)揮重要作用〔20〕。本研究表明，多發(fā)性骨髓瘤患者三氧化二砷聯(lián)合維生素C應(yīng)用可下調(diào)血漿MMP-13水平。NF-κB通路可由黏附分子、生長(zhǎng)因子、趨化因子、細(xì)胞因子及其他等激活，主要由p50/p65二聚體參與。研究表明，大部分多發(fā)性骨髓瘤患者存在NF-κB-p65過(guò)表達(dá)現(xiàn)象〔21〕。NF-κB-p65通過(guò)激活的多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞有利于通過(guò)提高血管生成和轉(zhuǎn)移、生長(zhǎng)、存活及黏附而致病〔22〕。此外，骨髓基質(zhì)細(xì)胞中NF-κB通路激活有助于多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)病〔23〕。本研究表明，三氧化二砷聯(lián)合維生素C可降低NF-κB-p65蛋白表達(dá)。C/EBPα基因高表達(dá)可促進(jìn)對(duì)抑癌基因p21的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)一步抑制細(xì)胞分裂。C/EBPα基因表達(dá)上調(diào)能夠削弱多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的侵襲能力，從而提高腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物敏感性〔24〕。本研究表明，多發(fā)性骨髓瘤患者應(yīng)用三氧化二砷聯(lián)合維生素C可上調(diào)C/EBPα基因表達(dá)。