內(nèi)蒙古包頭地區(qū)大腸癌患者K-ras和B-raf基因突變

曹麗婷 岳林 邢少姬 鄭連生 李曉敏 劉澤錦 馬霄

(1包頭醫(yī)學院醫(yī)學技術(shù)學院臨床生物化學檢驗與分子診斷學教研室，內(nèi)蒙古 包頭 014060；2包頭市腫瘤醫(yī)院病理科；3包頭醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院消化微創(chuàng)中心)

大腸癌(CRC)是我國重要的一個公共健康問題。目前，雖然CRC的發(fā)病機制尚不十分清楚，但K-ras基因突變在大腸癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用早已被證實〔1〕。B-raf是Ras-Raf-MEK-ERK細胞信號轉(zhuǎn)導通路中的一種重要轉(zhuǎn)導因子，參與調(diào)控細胞內(nèi)的細胞生長、分化和凋亡等多種生物學事件。近年來出現(xiàn)的以西妥昔單抗為代表的表皮生長因子(EGFR)單克隆抗體靶向抗腫瘤藥物，能夠特異性地針對K-ras基因野生型且B-raf基因不存在V600E突變的CRC患者進行治療，提高了治療的效果。在國內(nèi)有關(guān)CRC患者K-ras和B-raf基因突變的研究中，由于受到了地域、飲食和樣本量等多種因素的影響，使得研究結(jié)果存在較大差異。如范少安等〔2〕發(fā)現(xiàn)，K-ras基因突變頻率隨CRC患者年齡的增大而增加，王璇等〔3〕研究表明，CRC女性患者的 K-ras基因突變率高于男性患者。但也有研究結(jié)果并未發(fā)現(xiàn)K-ras基因突變與患者的性別有關(guān)〔4〕。目前尚未有關(guān)于內(nèi)蒙古地區(qū)CRC患者K-ras和B-raf基因突變情況的報道。本研究旨在了解內(nèi)蒙古包頭地區(qū)CRC患者腫瘤組織中K-ras和B-raf基因的狀態(tài)。

1 資料和方法

1.1一般資料 2015年3月至2018年12月經(jīng)組織病理學確診的632例CRC患者(包括337例結(jié)腸癌和295例直腸癌患者)，其中男367例，女265例，年齡27～87歲，平均(61.74±13.83)歲。受檢者均無放、化療史，且其1～2級親屬無CRC家族史及其他組織器官惡性腫瘤史。入選對象均為漢族，已在內(nèi)蒙古包頭地區(qū)居住10年以上，彼此無血緣關(guān)系。納入對象均對本檢測研究知情同意。

1.2組織DNA的提取 受檢樣本全部來自手術(shù)切除的腫瘤組織標本，均采用中性甲醛溶液固定及石蠟包埋。取一個1.5 ml的無菌離心管，將樣本用手術(shù)刀刮取3張固定厚度約30 mg的待測物放入其中，為了將石蠟溶解要向無菌管中加入1 ml二甲苯，之后嚴格按照購買的試劑盒(北京天根生化科技有限公司)說明書提取組織基因組DNA。提取完畢后，需要用紫外分光光度計測定DNA的濃度和純度，符合要求者進行K-ras和B-raf基因突變的檢測。

1.3K-ras和B-raf基因突變檢測 根據(jù)試劑盒(北京鑫諾美迪基因檢測技術(shù)科技有限公司)說明書配制K-ras基因常見7種突變類型和B-raf基因V600E突變檢測的PCR反應擴增體系。突變檢測PCR反應體系總體積均為25 μl，包含：樣本DNA 2 μl、K-ras或B-raf基因PCR反應液12.5 μl、6.5 μl引物探針混合液及4 μl純化水。檢測反應程序共有三個階段，第一是預變性：溫度95℃，所需時間3 min，第二是變性：溫度95℃，所需時間15 s，第三是退火、延伸、熒光信號采集：溫度60℃，所需時間35 s。反應程序共設(shè)置40個循環(huán)。

1.4質(zhì)量控制與結(jié)果判定 為了避免PCR反應有可能發(fā)生的非特異性擴增和污染，擴增反應前要啟動尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)反應，UDG反應條件是37℃，2 min，1個循環(huán)；擴增反應結(jié)束后做溶解曲線，以驗證PCR擴增產(chǎn)物的特異性。為保證結(jié)果判定的準確性，同一實驗檢測中必須設(shè)置陽性對照、陰性對照、內(nèi)標質(zhì)控品(自身質(zhì)控，檢測DNA提取樣本是否加入)、陰性質(zhì)控品(標準陰性曲線：內(nèi)標通道內(nèi)出現(xiàn)S型擴增曲線，但在靶基因通道內(nèi)不出現(xiàn)S型擴增曲線)、陽性質(zhì)控品(標準陽性曲線：內(nèi)標通道和靶基因通道內(nèi)均出現(xiàn)S型擴增曲線)，所設(shè)對照和質(zhì)控品全部滿足條件要求，且循環(huán)閾值(Ct值)<30時，結(jié)果方可采用。

1.5統(tǒng)計學分析 采用SPSS17.0軟件行χ2檢驗。

2 結(jié) 果

2.1K-ras和B-raf基因突變狀態(tài) 研究人群中K-ras基因常見7種突變形式均有檢出，發(fā)生K-ras基因突變237例，總體突變率為37.50%(237/632)，突變發(fā)生以單一位點為主，在總體突變中占比95.78%(227/237)，突變率最高的三個位點為:Gly12Asp 40.93%(97/237)、Gly13Asp 21.94%(52/237)和Gly12Val17.72%(42/237)；其次為Gly12ser6.33%(15/237)、Gly12Cys5.49%(13/237)、GlyAla2.53%(6/237)、Gly12Arg0.84%(2/237)。兩位點同時發(fā)生突變者9例(3.80%)，兩突變位點均位于12密碼子,其中7例為Gly12Ser+Gly12Asp，1例為Gly12Ala+Gly12Val，1例為Gly12Ala+Gly12Ser；多位點同時發(fā)生突變者1例(0.42%)，突變位點在12和13密碼子上均存在。

2.2K-ras基因突變與CRC患者臨床基礎(chǔ)參數(shù)的關(guān)系 不同腫瘤部位間K-ras基因突變率比較，結(jié)腸〔38.87%(131/337)〕與直腸〔35.93%(106/295)〕差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.580，P=0.446)；不同性別間K-ras基因突變率比較，女性〔(115/265)43.77%〕明顯高于男性〔32.97%(122/367)；χ2=6.769，P=0.009〕。不同年齡間K-ras基因突變率比較，≥60歲老年患者〔43.05%(158/367)〕明顯高于<60歲〔29.81%(79/265)；χ2=11.510，P=0.001〕。

2.3B-raf基因突變與CRC患者臨床基礎(chǔ)參數(shù)的關(guān)系 受檢的632例CRC患者癌組織中B-raf基因發(fā)生突變21例(3.32%)。18例為K-ras基因野生型，3例為K-ras基因突變型，其中1例K-ras突變位點為Gly12ser，另1例為Gly12Asp；腫瘤部位位于結(jié)腸、女性、≥60歲老年患者B-raf基因V600E的突變率分別高于腫瘤部位位于直腸、男性、<60歲患者，但差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。見表1。

表1 B-raf基因突變狀態(tài)及與CRC患者臨床基礎(chǔ)參數(shù)的關(guān)系〔n(%)〕

3 討 論

關(guān)于CRC發(fā)病機制的研究中，目前公認的是，K-ras和B-raf基因點突變在CRC的發(fā)生與發(fā)展及指導其靶向治療、治療效果和預后判斷等方面均具有重要作用。K-ras基因突變主要以堿基置換即點突變的形式存在，且多出現(xiàn)于其第2外顯子的12和13位密碼子，常見的突變位點包括12密碼子上的Gly12Ser(GGT置換為GCT)、Gly12Val(GGT置換為GTT)、Gly12Asp(GGT置換為GAT)、Gly12Ala(GGT置換為GCT)、Gly12Arg(GGT置換為CGT)、Gly12Cys(GGT置換為TGT)和13密碼子上的Gly13Asp(GGC置換為GAC)。多項關(guān)于惡性腫瘤臨床藥物的研究表明，K-ras基因的點突變狀態(tài)與阻斷介導腫瘤發(fā)生、發(fā)展的EGFR下游Ras-Raf-MAPK信號通路的單克隆抗體靶向藥物的療效具有明確的相關(guān)性〔5～8〕。早在2008年，歐美國家已經(jīng)開始對CRC患者進行K-ras基因常見突變位點的檢測，是否突變作為患者是否使用抗EGFR靶向藥物治療的重要指標。

B-raf基因突變主要發(fā)生在其第15外顯子上激活區(qū)的第1 799位氨基酸上(堿基T突變?yōu)锳)，以致由此編碼的氨基酸變?yōu)槔i氨酸(V600E)。B-raf基因V600E突變在人類的多種惡性腫瘤中，如肺癌、大腸癌、甲狀腺癌、胰腺癌等均有不同比例的發(fā)生〔9～11〕。在2010年版美國國立綜合癌癥網(wǎng)路(NCCN)CRC臨床實踐指南中明確指出：K-ras基因為野生型時，需要進一步檢測B-raf基因是否發(fā)生突變，如其發(fā)生了V600E突變，也不應使用抗EGFR單抗藥物進行治療。

本研究發(fā)現(xiàn)，包頭地區(qū)受檢的632例CRC患者癌組織中發(fā)生K-ras基因，B-raf基因V600E突變21例，突變率分別為37.50%和3.32%。K-ras基因這一突變率較國內(nèi)同類研究比較，高于姚輝等〔4〕報道的27.08%，與王璇等〔3〕報道的突變率(38.8%)相近。B-raf基因V600E突變率高于涂露霞等〔12〕報道的1.90%，且與其結(jié)果顯示的“B-raf基因V600E突變者均為K-ras基因野生型”也不相一致。本研究中還發(fā)現(xiàn)了K-ras基因存在兩位點或多位點同時發(fā)生突變者，且突變位點在12和13密碼子上均存在。這與國內(nèi)較多研究〔2～4，13〕顯示的“K-ras基因突變以單個位點發(fā)生，且無12和13密碼子同時突變的個體”的報道有所差異。

有研究報道〔14〕在K-ras 基因突變的大腸癌中轉(zhuǎn)化生長因子激酶1(TAK)1和有絲分裂原活化激酶活化蛋白(MAP4K2)的表達呈正相關(guān)，共同靶向抑制此兩種蛋白可為治療K-ras 基因突變的CRC患者提供可行思路。

此外，在有關(guān)K-ras 基因突變位點與患者預后的研究中，有研究提示12號密碼子突變的預后不良〔15〕。本研究發(fā)現(xiàn)包頭地區(qū)CRC患者K-ras基因突變發(fā)生于12密碼子的共計185例(78.06%)，這些突變患者的預后如何還需進一步深入研究。