循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞對(duì)圍絕經(jīng)期多囊卵巢綜合征胰島素抵抗的影響

楊陽(yáng) 雷秀兵 劉麗君

(1攀枝花學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，四川 攀枝花 617000；2攀枝花學(xué)院醫(yī)學(xué)院；3四川省地礦局四○五醫(yī)院婦產(chǎn)科)

多囊卵巢綜合征(PCOS)是最常見的婦科內(nèi)分泌和代謝性疾病，影響著5%的育齡婦女〔1〕，是導(dǎo)致不孕的重要原因之一。圍絕經(jīng)期女性大約有10%患有PCOS。該病的病因尚不完全清楚，臨床表現(xiàn)極為多變，一般包括臨床或生化性高雄激素血癥、月經(jīng)紊亂和多囊卵巢?；颊咄哂刑恰⒅x異常，是代謝綜合征的高危人群。代謝紊亂還可引起冠心病和糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)增加，帶來嚴(yán)重的遠(yuǎn)期損害。高胰島素血癥和胰島素抵抗(IR)是PCOS自身發(fā)病的關(guān)鍵機(jī)制，研究數(shù)據(jù)表明無論肥胖或非肥胖的患者都有可能存在IR〔2～5〕。糖調(diào)節(jié)障礙與內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)生物學(xué)異常密切相關(guān)，具體機(jī)制包括EPCs循環(huán)數(shù)量減少、骨髓動(dòng)員功能缺陷及EPCs介導(dǎo)內(nèi)皮修復(fù)功能的功能特性受損〔6，7〕。而內(nèi)皮功能受損預(yù)示動(dòng)脈粥樣硬化早期變化，是未來心血管風(fēng)險(xiǎn)增加的顯著標(biāo)志。在2型糖尿病、代謝綜合征患者血液中的EPCs水平降低，而且與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)〔8，9〕。血管干細(xì)胞包括EPCs、平滑肌祖細(xì)胞(SMPCs)、周細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞等4種類型，其中EPCs是骨髓來源的循環(huán)細(xì)胞，表達(dá)造血干細(xì)胞抗原CD34和CD133，有分化為成熟內(nèi)皮細(xì)胞的潛能，參與內(nèi)皮修復(fù)過程。本研究觀察IR對(duì)于肥胖和非肥胖圍絕經(jīng)期PCOS患者血管祖細(xì)胞數(shù)量、功能及其代謝的影響，闡明肥胖和非肥胖PCOS患者的臨床特征。

1 材料與方法

1.1研究對(duì)象 選取2019年1～12月四川省地礦局四○五醫(yī)院婦產(chǎn)科確診為PCOS患者79例，平均年齡(48.5±5.8)歲，體重指數(shù)(BMI)≥25 kg/m2為肥胖組(n=43)，BMI<25 kg/m2為非肥胖組(n=36)；選擇四川省地礦局四○五醫(yī)院同期體檢、年齡匹配的女性30名，作為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合2003年美國(guó)與歐洲生殖協(xié)會(huì)制訂的PCOS診斷標(biāo)準(zhǔn)〔10〕；②近3個(gè)月未服用激素類藥物；③經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。排除條件：①合并肝腎功能不全；②合并有惡性腫瘤、自身免疫性疾病等。用McAuley指數(shù)評(píng)價(jià)IR程度，按照McAuley指數(shù)<5.8和McAuley指數(shù)≥5.8分為IR和非IR。兩組一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2觀察指標(biāo)

1.2.1糖代謝、內(nèi)分泌水平的血清學(xué)檢測(cè) 患者入院后次日清晨抽取靜脈血4 ml，3 000 r/min離心10 min后吸取上清液，置于-80℃?zhèn)溆?。使用日?600-020全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定空腹血糖(FPG)、餐后2小時(shí)血糖(2 hPG)及血清催乳素(PRL)、卵泡刺激素(FSH)、黃體生成素(LH)。免疫透射法檢測(cè)C反應(yīng)蛋白(CRP)水平。比較兩組IR指數(shù)(HOMA-IR)，計(jì)算公式如下：HOMA-IR=〔空腹胰島素(FINS)×FPG〕/22.5，正常值<2.69。

1.2.2EPCs流式細(xì)胞術(shù)計(jì)數(shù) 收集受試者外周血2.4 ml，用氯化銨緩沖液裂解紅細(xì)胞后，從外周血中分離出白細(xì)胞。暗處分別用CD133-PE、CD34-FITC 和CD45-PerCP (R&D System，Abondgon)抗體標(biāo)記，室溫孵育30 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次后重懸于500 μl PBS。在流式細(xì)胞儀貝克曼庫(kù)爾特Navios進(jìn)行檢測(cè)，獲取10 000個(gè)細(xì)胞，以占單個(gè)核細(xì)胞百分比表示。

1.2.3集落形成單位計(jì)數(shù) 取外周血10 ml，1 500 r/min離心15 min棄去上清，加入PBS 10 ml。取50 ml離心管，加入淋巴細(xì)胞分離液10 ml，按照1∶1體積加入細(xì)胞懸濁液。2 000 r/min離心25 min密度梯度離心獲單個(gè)核細(xì)胞后，在6孔板中進(jìn)行體外培養(yǎng)，培養(yǎng)于含有20%胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中。4 d后更換培養(yǎng)液，棄去未貼壁細(xì)胞，加入含有50 ng/ml VEGF的DMEM培養(yǎng)液。7 d后計(jì)數(shù)EPCs集落形成單位。

1.2.4酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定炎性細(xì)胞因子 使用人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)白細(xì)胞介素(IL)-6(R&D，#DVE00，#D6050)等ELISA試劑盒檢測(cè)患者血清中VEGF、IL-6濃度。所有步驟嚴(yán)格按照說明書，使用酶標(biāo)儀在405 nm測(cè)定吸光值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)、Pearson相關(guān)性分析。

2 結(jié) 果

2.1糖代謝和內(nèi)分泌水平比較 圍絕經(jīng)期肥胖組FPG、2 hPG和HOMA-IR均明顯高于非肥胖組，非肥胖組FPG、2 hPG和HOMA-IR均明顯高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。PCOS患者IR總發(fā)生率為41.8%，肥胖組IR發(fā)生率明顯高于非肥胖組，非肥胖組IR發(fā)生率明顯高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。3組PRL、FSH水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，肥胖組與非肥胖組LH水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但均明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 3組糖代謝及內(nèi)分泌水平比較

2.23組EPCs數(shù)量、集落形成單位比較 肥胖與非肥胖PCOS患者EPCs數(shù)量〔(0.04±0.01)%、(0.16±0.01)%〕、集落形成單位〔(49.70±9.21)%、(74.13±11.86)%〕均明顯低于對(duì)照組〔(0.21±0.00)%、(75.35±10.76)%〕，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，組間比較顯示肥胖組EPCs數(shù)量、集落形成單位明顯低于非肥胖組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示肥胖組EPCs數(shù)量明顯減少。

2.33組CRP、VEGF、IL-6水平比較 肥胖組與非肥胖組CRP、VEGF、IL-6水平均明顯高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；且肥胖組水平明顯高于非肥胖組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 3組炎癥因子水平比較

2.4循環(huán)EPCs數(shù)量與HOMA-IR的關(guān)系 PCOS患者循環(huán)EPCs數(shù)量與HOMA-IR呈負(fù)相關(guān)(r=-0.582，P<0.05)。

3 討 論

目前學(xué)者已逐漸認(rèn)識(shí)到IR參與PCOS發(fā)病過程，然而對(duì)于其發(fā)病機(jī)制仍缺乏確切闡明。圍絕經(jīng)期本身與體重增加和心血管風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)，研究顯示肥胖能促使IR狀態(tài)下的PCOS患者的糖尿病發(fā)病率增加〔11〕。本研究證實(shí)圍絕經(jīng)期肥胖和非肥胖PCOS患者均可能存在IR，與既往國(guó)內(nèi)外研究結(jié)果一致。本研究結(jié)果提示肥胖患者更易發(fā)生IR。LH的釋放可促進(jìn)腎上腺和卵巢分泌雄激素增加，加劇IR發(fā)生。

有研究表明，COPD患者循環(huán)EPCs數(shù)量與全身動(dòng)脈內(nèi)皮功能呈負(fù)相關(guān)，即循環(huán)EPCs數(shù)量較多，而血流介導(dǎo)性舒張較少，提示肺或體循環(huán)的血管損傷可能刺激骨髓并促進(jìn)祖細(xì)胞的釋放〔12〕。EPCs參與維持內(nèi)皮細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)，并參與新生血管的形成，這一過程被稱為新生血管形成。這些細(xì)胞保護(hù)心血管系統(tǒng)的機(jī)制尚不清楚，然而，一致的證據(jù)表明，EPCs的損傷和減少是1型和2型糖尿病的顯著特征〔13〕。本研究結(jié)果表明圍絕經(jīng)期PCOS患者存在內(nèi)皮數(shù)量減少。

CRP是急性時(shí)相蛋白，與PCOS女性的IR和內(nèi)皮功能障礙有關(guān)〔14〕。VEGF是炎癥和血管新生過程中的重要因子，該蛋白可由人類卵巢表達(dá)和分泌，在卵巢血管生成的生理調(diào)控中起重要作用〔15，16〕。此外，VEGF作為PCOS臨床特征，在卵巢間膜和間質(zhì)的高血供中起關(guān)鍵作用。減肥手術(shù)后的體重減輕可顯著減少VEGF及其他炎癥因子的產(chǎn)生〔17〕。IL-6在卵巢成熟和植入過程中起重要作用，先前研究表明IL-6與IR、肥胖有關(guān)〔18〕。PCOS大鼠模型中，IL-6升高可上調(diào)卵巢組織中睪酮受體的表達(dá)，間接增加雄激素活性，從而參與PCOS的發(fā)病機(jī)制〔19～21〕。

綜上所述，圍絕經(jīng)期PCOS患者的糖代謝水平異常，以FPG、2hPG和HOMA-IR明顯升高為表現(xiàn)。肥胖型患者糖代謝異常、IR更為嚴(yán)重，與EPCs減少有一定的關(guān)系。