四環(huán)素和銻復(fù)合污染對(duì)底棲生物酶活性的影響

何香廷，楊再福，張琪悅，侯振宇

(東華大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，上海 201620)

重金屬和抗生素是當(dāng)今世界最為嚴(yán)重的污染物。中國(guó)是Sb儲(chǔ)備量和使用量最高的國(guó)家[1]，也是抗生素生產(chǎn)和使用的第一大國(guó)[2]。人們對(duì)汞、鉻、鉛等重金屬的研究頗多，對(duì)重金屬銻的報(bào)道較少。近年來(lái)印染行業(yè)等工業(yè)生產(chǎn)排放的大量Sb導(dǎo)致了多次污染事故[3]，使土壤、水、大氣中的銻濃度顯著增加，如太浦河流域飲用水和廣元銻污染事件等。同時(shí)，具有殺菌消毒作用的四環(huán)素已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、畜禽養(yǎng)殖等行業(yè)[4]。由于抗生素類(lèi)不易吸收，所以動(dòng)物體攝入的大部分抗生素以原藥或其代謝產(chǎn)物形式排出體外，導(dǎo)致耐藥性和抗性基因的污染[5]。近幾年有研究表明，土壤、地表水、底泥中等均已檢測(cè)到了抗生素的存在[6-8],給生存環(huán)境和人類(lèi)健康帶來(lái)了嚴(yán)重危害，但有關(guān)銻和四環(huán)素的聯(lián)合研究未見(jiàn)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)選取四環(huán)素和銻作為目標(biāo)化合物，分析兩種目標(biāo)化合物對(duì)中華圓田螺肝胰臟酶活性的單一及聯(lián)合影響，為水環(huán)境中四環(huán)素和Sb對(duì)底棲生物的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選用中華圓田螺為受試生物。選用大小均勻、行動(dòng)活潑、反應(yīng)靈敏的健康田螺，質(zhì)量為(3.28±0.05)g。田螺經(jīng)5%食鹽水消毒后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室，在2L的大燒杯中馴養(yǎng)5d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 儀器與試劑

儀器：Spectrumlab752S紫外分光光度計(jì)(上海棱光)；FSH-2A組織勻漿機(jī)(上海旌派)；SC-3612低速離心機(jī)(北京格瑞恩)。

試劑：鹽酸四環(huán)素(Signa-Ardrich Co.LLC, USA)，蛋白質(zhì)定量測(cè)試試劑盒，CAT試劑盒，GSH試劑盒(試劑盒均來(lái)自南京建成生物工程研究所)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 田螺急性毒性試驗(yàn)

四環(huán)素單一毒性試驗(yàn)：將中華圓田螺暴露于5個(gè)不同的濃度梯度(0、1、10、100、500mg/L)，并設(shè)置3組平行實(shí)驗(yàn)。每只2L的燒杯中放入10只大小均勻、行動(dòng)活潑的田螺，進(jìn)行96h急性毒性試驗(yàn)并獲得四環(huán)素對(duì)田螺的半致死濃度(LC50四環(huán)素)。

銻單一毒性試驗(yàn)：將中華圓田螺暴露于8個(gè)不同的濃度梯度(0、8、12、18、24、32、64、128mg/L)，并設(shè)置3組平行實(shí)驗(yàn)。每只2L的燒杯中放入10只大小均勻、行動(dòng)活潑的田螺，進(jìn)行96h急性毒性試驗(yàn)并獲得四環(huán)素對(duì)田螺的半致死濃度(LC50銻)。

四環(huán)素和銻聯(lián)合急性毒性試驗(yàn)：將中華圓田螺暴露于9個(gè)不同的濃度梯度，其中四環(huán)素和銻的濃度為(0、12.5+3.38、25.0+6.75、50.0+13.50、100.0+27.00、150.0+40.50、200.0+54.00、300.0+81.00、400.0+108.00mg/L)，并設(shè)置3組平行實(shí)驗(yàn)。每只2L的燒杯中放入10只大小均勻、行動(dòng)活潑的田螺，進(jìn)行96h急性毒性試驗(yàn)并獲得四環(huán)素和銻聯(lián)合對(duì)田螺的半致死濃度(LC50聯(lián)合)。

1.3.2 培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)條件

進(jìn)行目標(biāo)化合物對(duì)田螺體內(nèi)蛋白質(zhì)的影響、目標(biāo)化合物對(duì)田螺肝胰臟GSH活性的影響、目標(biāo)化合物對(duì)田螺肝胰臟CAT活性的影響3組實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)168h。設(shè)置的濃度梯度為0%、10%、40%、70%、90% LC50四環(huán)素，0%、10%、40%、70%、90% LC50銻和0%、10%、40%、70% LC50聯(lián)合。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)，每個(gè)培養(yǎng)缸放入10只大小均勻、行動(dòng)活潑的田螺；實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后，每個(gè)培養(yǎng)缸于24h、72h、168h分別隨機(jī)抽取2只田螺進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 蛋白質(zhì)、GSH、CAT樣本制備

準(zhǔn)確稱(chēng)取各濃度組待測(cè)田螺的重量。按照質(zhì)量(g)∶體積(mL)=1∶9的比例加入9倍體積的生理鹽水，冰水浴條件下用組織勻漿機(jī)研磨均勻，冷凍離心機(jī)4℃、4500rpm條件下離心10min后，取上清液用生理鹽水按1∶9比例稀釋成1%濃度組織勻漿，待測(cè)。

1.3.4 測(cè)定方法

采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量；采用紫外分光光度法測(cè)定GSH和CAT的活性，具體測(cè)定操作和計(jì)算按照南京建成生物工程研究所的試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。GSH和CAT活性分別以mgGSH/gprot、U/mgprot活力單位表示。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用Origin8.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行作圖，SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 田螺急性毒性試驗(yàn)結(jié)果

四環(huán)素單一毒性試驗(yàn)：田螺在72h時(shí)有明顯死亡跡象，根據(jù)田螺的死亡數(shù)采用SPSS22.0處理數(shù)據(jù)得知四環(huán)素的LC50 =100mg/L。

銻單一毒性試驗(yàn)：田螺在48h時(shí)表現(xiàn)出行動(dòng)遲緩等輕微中毒跡象；96h時(shí)田螺縮回殼內(nèi)，幾乎無(wú)行動(dòng)力，根據(jù)田螺的死亡數(shù)采用SPSS22.0處理數(shù)據(jù)得知Sb的LC50 =27mg/L。

四環(huán)素和銻聯(lián)合急性毒性試驗(yàn)：暴露條件為四環(huán)素+Sb(100mg/L+27mg/L)的田螺在72h及96h時(shí)肌肉松軟，部分田螺因中毒而亡，根據(jù)田螺的死亡數(shù)采用SPSS22.0處理數(shù)據(jù)得知聯(lián)合四環(huán)素的LC50 =93.53mg/L、聯(lián)合Sb的LC50 =25.25mg/L。

表1 卡方測(cè)試

由此可知，四環(huán)素和銻的聯(lián)合效應(yīng)為輕微的拮抗作用。

根據(jù)急性毒性試驗(yàn)的結(jié)果設(shè)置各實(shí)驗(yàn)組目標(biāo)化合物的濃度見(jiàn)表2。

表2 實(shí)驗(yàn)組目標(biāo)化合物的濃度

2.2 目標(biāo)化合物對(duì)田螺體內(nèi)蛋白質(zhì)的影響

圖1顯示了田螺體內(nèi)的蛋白質(zhì)含量隨著時(shí)間及暴露條件的變化。由圖可知，隨著時(shí)間的增加，在不同濃度的四環(huán)素、Sb以及四環(huán)素和Sb聯(lián)合條件下暴露的田螺體內(nèi)的蛋白質(zhì)含量均呈現(xiàn)出先增加后減少的趨勢(shì)，在實(shí)驗(yàn)結(jié)束即168h時(shí)測(cè)定的田螺體內(nèi)蛋白質(zhì)含量低于對(duì)照組田螺體內(nèi)的蛋白質(zhì)含量。由此可知，無(wú)論在四環(huán)素暴露條件下，還是重金屬Sb暴露條件下，最終均會(huì)使田螺體內(nèi)的蛋白質(zhì)含量降低。王雅慧[9]等研究發(fā)現(xiàn)在大菱鲆幼魚(yú)的飼料中添加姜黃素后，會(huì)使該種魚(yú)體內(nèi)的蛋白質(zhì)含量有所下降。

該圖還顯示出在同一測(cè)定時(shí)間下，田螺體內(nèi)的蛋白質(zhì)含量隨著目標(biāo)化合物濃度的變化。由圖3可知，在同一測(cè)定時(shí)間，Sb暴露條件下的田螺體內(nèi)蛋白質(zhì)含量隨著濃度的增加呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)；四環(huán)素暴露條件下的田螺體內(nèi)蛋白質(zhì)的含量為先增加后減少而后繼續(xù)增加，在四環(huán)素含量為40mg/L和90mg/L時(shí)，其體內(nèi)的蛋白質(zhì)含量較高；對(duì)于在四環(huán)素和Sb聯(lián)合條件下生長(zhǎng)的田螺，其體內(nèi)的蛋白質(zhì)含量呈現(xiàn)出先降后升的趨勢(shì)，在37.41mg/L四環(huán)素+10.1mg/L Sb條件下生長(zhǎng)的田螺體內(nèi)蛋白質(zhì)含量最低。由此也可以看出，四環(huán)素和重金屬Sb的聯(lián)合效應(yīng)為拮抗。

2.3 目標(biāo)化合物對(duì)田螺肝胰臟GSH活性的影響

GSH是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種重要的酶，具有抗氧化作用和解毒作用，從而維持機(jī)體正常的免疫系統(tǒng)功能。

2.3.1 Sb對(duì)田螺肝胰臟GSH活性的影響

由圖2可知，在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后24h，田螺肝胰臟的GSH活性隨著暴露濃度的增加而降低；隨著暴露時(shí)間的逐漸增長(zhǎng)，在同一測(cè)定時(shí)間下，田螺肝胰臟的GSH活性隨著暴露濃度呈先增加后降低的趨勢(shì)，且在72～168h的增加最為顯著。由此可知，Sb在一定濃度及時(shí)間范圍內(nèi)對(duì)田螺肝胰臟的GSH活性有抑制作用。

林少琴[10]等的研究表明，Zn2+、Fe3+、Mn2+在體外對(duì)蚯蚓體內(nèi)的谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)有抑制作用。唐浩[11]等人的研究發(fā)現(xiàn)，Hg對(duì)土壤球衣體內(nèi)的GSH-Px有先促進(jìn)再抑制作用。因此，不同重金屬對(duì)不同生物體內(nèi)GSH活性的作用效果不同。

2.3.2 四環(huán)素對(duì)田螺肝胰臟GSH活性的影響

由圖2可知，在實(shí)驗(yàn)前72h，暴露在四環(huán)素條件下的田螺肝胰臟的GSH活性隨著暴露濃度的增加呈現(xiàn)先降低后升高而后降低的趨勢(shì)，但在最后96h(即168h)時(shí)，趨勢(shì)變?yōu)榱讼仍龊蠼翟僭黾?。并且各時(shí)間各暴露濃度下的GSH活性均高于對(duì)照組。

2.3.3 四環(huán)素和Sb聯(lián)合對(duì)田螺肝胰臟GSH活性的影響

由圖2可知，暴露在四環(huán)素和重金屬Sb聯(lián)合作用條件下的田螺肝胰臟GSH的活性在40% LC50聯(lián)合(即37.41mg/L四環(huán)素+10.1mg/L Sb)條件下最高，呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)；且在168h時(shí)田螺肝胰臟GSH的活性最高，較72h時(shí)增加了約90%，說(shuō)明此時(shí)田螺體內(nèi)的抗氧化作用最強(qiáng)。

2.4 目標(biāo)化合物對(duì)田螺肝胰臟CAT活性的影響

過(guò)氧化物酶(CAT)是一種抗氧化酶，主要是在活性氧代謝過(guò)程中，將產(chǎn)生的H2O2分解為水和氧氣，有效阻止細(xì)胞的過(guò)氧化損傷[12]。CAT常被作為指示污染脅迫的重要生物標(biāo)志物[13]。

2.4.1 Sb對(duì)田螺肝胰臟CAT活性的影響

由圖3可知，在前72h內(nèi)Sb各濃度暴露條件對(duì)田螺肝胰臟的CAT活性有著低濃度抑制、高濃度促進(jìn)的作用；但隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，在168h時(shí)，Sb對(duì)其CAT活性有著相反的作用——低濃度促進(jìn)、高濃度抑制。其中，Sb濃度為18.9mg/L時(shí)的促進(jìn)作用最為明顯。

郭婷[14]對(duì)水體中的Cr6+對(duì)草魚(yú)肝胰臟CAT活性影響的研究表明，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)和培養(yǎng)濃度的增加，CAT的活性整體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)；王慶偉[15]在水體中的Cu2+對(duì)斑馬魚(yú)CAT活性的研究表明，暴露7d后，斑馬魚(yú)CAT的活性被抑制，隨著暴露濃度的增大，CAT的活性降低且被抑制的程度減弱。

2.4.2 四環(huán)素對(duì)田螺肝胰臟CAT活性的影響

根據(jù)圖3的分析可知，四環(huán)素暴露條件下田螺肝胰臟CAT活性與Sb暴露條件下有著相反的趨勢(shì)，在前24h田螺的CAT活性先增加后降低；而后，隨著時(shí)間的增長(zhǎng)，田螺肝胰臟CAT活性呈現(xiàn)低濃度抑制、高濃度促進(jìn)的趨勢(shì)。說(shuō)明田螺的肝胰臟細(xì)胞對(duì)四環(huán)素的脅迫作用產(chǎn)生了應(yīng)激反應(yīng)。

2.4.3 四環(huán)素和Sb聯(lián)合對(duì)田螺肝胰臟CAT活性的影響

與單一的四環(huán)素或Sb對(duì)田螺的肝胰臟CAT活性的影響不同，四環(huán)素和Sb復(fù)合污染物對(duì)田螺CAT活性的影響為低濃度促進(jìn)，高濃度抑制。在暴露條件為37.41mg/L四環(huán)素+10.1mg/L Sb時(shí)的促進(jìn)效果最為明顯，在24h時(shí)CAT的活性約為對(duì)照組的2倍，而在168h時(shí)約為對(duì)照組的3倍。

四環(huán)素和Sb聯(lián)合暴露條件與單一暴露條件對(duì)田螺肝胰臟CAT活性影響相同的是，在同一濃度條件下，72h時(shí)CAT的活性最低，四環(huán)素對(duì)CAT的活性有低濃度抑制、高濃度促進(jìn)的作用。

3 小結(jié)

(1)四環(huán)素與重金屬Sb有輕微拮抗作用。

(2)暴露在四環(huán)素、Sb污染條件下的田螺體內(nèi)蛋白質(zhì)含量較正常條件下生活的田螺有所減少。

(3)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，各暴露條件下的田螺肝胰臟GSH的活性都有顯著的升高。

(4)田螺肝胰臟CAT活性與培養(yǎng)時(shí)間和暴露濃度都相關(guān)。在前72h Sb對(duì)田螺肝胰臟CAT的活性有著低濃度抑制、高濃度促進(jìn)的作用，隨著暴露時(shí)間的增加有著完全相反的作用；四環(huán)素對(duì)田螺肝胰臟的CAT有著低濃度抑制、高濃度促進(jìn)的作用；而Sb和四環(huán)素聯(lián)合條件對(duì)田螺肝胰臟的CAT活性有著低濃度促進(jìn)、高濃度抑制的作用。