肝細胞癌自噬相關(guān)長鏈非編碼RNA預(yù)后模型的建立與分析

陳圣，趙繼森，李靖華，楊季紅，程樹杰

（1.河北大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，河北 保定 071000；河北大學(xué)附屬醫(yī)院 2.肝膽外科/河北省普通外科數(shù)字醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究重點實驗室，河北 保定 071000）

在全球范圍內(nèi)，肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是常見的癌癥之一，在因癌癥死亡原因中占第4位，并且其發(fā)病率預(yù)計將來還會增加[1]。HCC的主要治療手段為肝癌切除術(shù)[2]，而手術(shù)后較高的轉(zhuǎn)移率和復(fù)發(fā)率嚴(yán)重影響著HCC患者的治療效果和生存期[3-4]。且由于HCC早期無明顯癥狀難以發(fā)現(xiàn)、較早出現(xiàn)肝內(nèi)轉(zhuǎn)移等原因?qū)е略S多HCC患者在診斷時已經(jīng)失去了手術(shù)的機會[5]。因此有效的預(yù)后標(biāo)志模型可能有助于指導(dǎo)個體治療策略的制定從而改善患者生存期。

自噬是溶酶體依賴細胞內(nèi)降解途徑，通過降解不需要的細胞成分在生理、病理生理環(huán)境中對細胞生存、分化、發(fā)育和調(diào)節(jié)細胞穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要的生理過程[6]。在生理情況下，自噬通過細胞內(nèi)降解機制分解受損的細胞器從而維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定[7]。自噬過程同樣參與許多病理過程，如神經(jīng)退行性疾病，衰老和癌癥[8-9]。越來越多的證據(jù)表明自噬失調(diào)與肝臟疾病如脂肪肝、肝硬化和HCC的發(fā)病機理有關(guān)[10]。近些年，許多研究小組試圖將自噬基因確立為癌癥的潛在治療靶標(biāo)[11-12]。有研究[13-14]表明自噬藥物可以用作藥理劑，以克服HCC治療中化療的局限性，例如藥物毒性和耐藥性。但這是否是一個替代性的和正在出現(xiàn)的概念仍然是一個巨大的挑戰(zhàn)[15]。以自噬調(diào)節(jié)為視角和潛在治療目標(biāo)的研究數(shù)目越來越多，自噬可能將成為一種潛在的方法來治療HCC[16]。有研究[17]表明IFN-γ通過誘導(dǎo)自噬體的形成和微管相關(guān)蛋白1輕鏈3蛋白的轉(zhuǎn)化抑制人HCC細胞生長和非凋亡性細胞死亡。越來越多的研究突顯了自噬在HCC中的重要性，其中確定主要的自噬靶標(biāo)研究尤為重要。

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一類無蛋白編碼功能的RNA序列，lncRNA涉及RNA衰變，基因表達的遺傳調(diào)控，RNA剪接，microRNA調(diào)控和蛋白質(zhì)折疊等多種生理過程[18]。其異常表達與多種癌癥的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，并具有診斷及預(yù)后價值[19]。通過lncRNA-mRNA共表達分析可以較好評估lncRNA的功能[20-21]。在HCC發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后中，發(fā)現(xiàn)許多l(xiāng)ncRNA在扮演著重要作用。有研究[22-23]表明，在HCC中存在lncRNA介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄和自噬相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控自噬調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。因此，自噬相關(guān)的lncRNA可能在HCC患者的預(yù)后中具有潛在價值，并且可以作為潛在的治療靶標(biāo)。本研究旨在建立HCC中自噬相關(guān)的lncRNA預(yù)后模型。

1 材料與方法

1.1 材料

HCC患者轉(zhuǎn)錄組測序及臨床數(shù)據(jù)從TCGA數(shù)據(jù)率獲?。╤ttps://cancergenome.nih.gov）。下載的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)包含HCC患者374例癌組織以及50例癌旁組織的mRNA和lncRNA表達數(shù)據(jù)。HCC患者的臨床數(shù)據(jù)包括374例HCC的臨床相關(guān)資料，如生存時間、生存狀態(tài)、年齡、性別、腫瘤分級和病理分期等。

1.2 方法

1.2.1 自噬相關(guān)lncRNA 的篩選從HADb 網(wǎng)站（http://autophagy.lu/clustering/index.html）獲 取自噬基因列表。從374 例HCC TCGA RNA 數(shù)據(jù)集中獲得lncRNA 和自噬相關(guān)基因的表達數(shù)據(jù)。利用Pearson 相關(guān)性分析計算lncRNA 與自噬相關(guān)基因的相關(guān)性。滿足|R2|＞0.3 且P＜0.001 的lncRNA 被認(rèn)為是自噬相關(guān)的lncRNA。

1.2.2 數(shù)據(jù)的預(yù)處理刪除在HCC 患者中生存時間少于30 d 的患者，用于生存分析的數(shù)據(jù)集包括342 例HCC 患者的自噬相關(guān)lncRNA 表達數(shù)據(jù)和臨床資料。利用R 軟件中caret 程序包將用于預(yù)后分析的342 例TCGA 的HCC 數(shù)據(jù)集樣本按70% 與30% 的比例分為訓(xùn)練集（n=242）和內(nèi)部驗證集（n=100）。

1.2.3 風(fēng)險預(yù)后模型的構(gòu)建及分析首先，進行單因素Cox 回歸分析及KM 法以評估自噬相關(guān)lncRNA 的預(yù)后價值。篩選出滿足上述2 種方法P 值均＜0.05 與HCC 患者預(yù)后相關(guān)的lncRNA。使用多因素Cox 回歸分析對具有預(yù)后意義的自噬相關(guān)lncRNA 進行篩選并建立風(fēng)險評分模型。使用風(fēng)險評分計算公式為每個患者計算風(fēng)險評分：風(fēng)險評分=coef基因1×expr基因1+coef基因2×expr基因2+ ...+coef基因?×expr基因?。通過加權(quán)l(xiāng)ncRNA 的表達水平與回歸系數(shù)（coef）得到風(fēng)險評分。coef值是通過多因素Cox 回歸分析得到的回歸系數(shù)；lncRNA 表達定義為expr 基因n。根據(jù)中位風(fēng)險評分劃分高風(fēng)險組和低風(fēng)險組。利用R 3.6.3 軟件中survival 程序包繪制模型預(yù)后的生存曲線，并比較兩組患者之間生存的差異。繪制預(yù)后模型的ROC曲線以評價模型的靈敏度和特異性。使用R 軟件中survivalROC 程序包繪制ROC 曲線并計算其AUC 數(shù)值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

使用Kaplan-Meier法比較高風(fēng)險組和低風(fēng)險組的總生存期（OS），采用對數(shù)秩檢驗計算P值。使用單變量和多變量Cox分析來評估風(fēng)險評分與臨床病理特征或OS之間的關(guān)系。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。自噬相關(guān)lncRNA共表達網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建使用Cytoscape軟件（版本3.6.0）完成。

2 結(jié) 果

2.1 自噬基因-lncRNA 共表達網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

從TCGA數(shù)據(jù)庫中提取了TCGA數(shù)據(jù)集中總共 3888個lncRNA。從HADb中總共提取了256個自噬相關(guān)基因。通過構(gòu)建自噬相關(guān)基因-lncRNA共表達網(wǎng)絡(luò)，鑒定與自噬相關(guān)的lncRNA。最后，347個lncRNA鑒定為自噬相關(guān)lncRNA。

2.2 鑒定HCC 患者的12 種自噬相關(guān)lncRNA 的特征

在242例TCGA訓(xùn)練集中基于347種自噬相關(guān)的lncRNA使用單因素Cox回歸分析和KM法來篩選具有預(yù)后意義的自噬相關(guān)lncRNA。同時滿足Kaplan-Meier法及單因素Cox方法P值均＜0.05的lncRNA被考慮為具有預(yù)后意義的自噬相關(guān)lncRNA。共有26個lncRNA對HCC患者具有預(yù)后價值（P＜0.05）。隨后，進一步使用多因素Cox回歸分析對這些lncRNA進行篩選后構(gòu)建預(yù)后模型，同時依據(jù)赤池信息量準(zhǔn)則（Akaike information criterion，AIC）對模型進行優(yōu)化，最優(yōu)AIC=797.82。最后12個lncRNA被用于構(gòu)建預(yù)后模型（表1）（圖1）。隨后構(gòu)建預(yù)后相關(guān)自噬lncRNA共表達網(wǎng)絡(luò)（圖2）。同時繪制12個自噬相關(guān)lncRNA和自噬相關(guān)基因及對患者總生存期的關(guān)系的組合?；鶊D（圖3）。

2.3 自噬相關(guān)的lncRNA 模型對HCC 的預(yù)后影響

使用風(fēng)險評分公式計算自噬相關(guān)lncRNA模型的風(fēng)險評分（表2），風(fēng)險評分公式：風(fēng)險分?jǐn)?shù)= coef基因1×expr基因1+coef基因2×expr基因2+...+coef基因?×expr基因?。按中位風(fēng)險評分值將訓(xùn)練集HCC患者分為兩組（低風(fēng)險組和高風(fēng)險組）。利用R 3.6.3軟件中的survival程序包根據(jù)患者風(fēng)險評分分析生存差異，繪制風(fēng)險評分曲線、生存狀態(tài)圖及12個lncRNA表達熱圖（圖4）。隨著風(fēng)險評分的升高，高風(fēng)險評分組患者的死亡人數(shù)顯著多于低風(fēng)險評分組，說明高風(fēng)險評分組的患者整體生存率較差。風(fēng)險模型還可以預(yù)測HCC患者的生存時間，其中低風(fēng)險組的總生存時間比高風(fēng)險組的總生存時間更長（圖5）。此外，還通過多元Cox回歸分析探討了風(fēng)險評分簽名是否是HCC患者預(yù)后的獨立預(yù)測因子。在消除了其他因素（如性別，年齡，腫瘤分級和分期）的影響后，該風(fēng)險評分模型仍可顯著預(yù)測HCC患者的生存（HR=1.201，95% CI=1.141～1.264，P＜0.001）（表3）。隨后，利用survivalROC程序包繪制模型的ROC曲線以評價模型的靈敏度和特異性（1、3和5年AUC分別為0.801，0.819和0.787）（圖6）。

表1 12 個與HCC 預(yù)后有關(guān)自噬相關(guān)lncRNATable 1 The 12 autophagy-related lncRNAs significantly associated with the prognosis of HCC

圖1 HCC 中12 個lncRNA 與自噬基因共表達的網(wǎng)絡(luò)圖（lncRNA 為紅色節(jié)點，自噬基因為藍色節(jié)點）Figure 1 Network of the 12 lncRNAs with the co-expressed autophagy genes in HCC (the red nodes indicating the lncRNAs,the blue nodes indicating the autophagy genes)

圖2 訓(xùn)練集中12 個lncRNA 的生存曲線圖Figure 2 Survival curves for the 12 prognostic lncRNAs in the train dataset

圖3 12 個lncRNAs 與自噬基因關(guān)系及對HCC 患者預(yù)后的影響Figure 3 The relationship between 12 lncRNAs and autophagy genes and its effect on the prognosis of the HCC patients

表2 訓(xùn)練集中12 個lncRNA 多因素Cox 回歸分析Table 2 Multivariate Cox regression analysis of the 12 lncRNAs in the train dataset

圖4 訓(xùn)練集中HCC 患者的自噬相關(guān)lncRNA 風(fēng)險評分分析Figure 4 Risk score analysis of the autophagy-related lncRNAs in train dataset

圖5 訓(xùn)練集中不同風(fēng)險評分HCC 患者的生存曲線Figure 5 Survival curves of the HCC patients with different risk scores in the train dataset

表3 訓(xùn)練集HCC 患者臨床特征及風(fēng)險評分的多因素Cox回歸分析Table 3 Multivariate Cox regression analysis of characteristics and risk score of the HCC patients in the train dataset

圖6 訓(xùn)練集中風(fēng)險模型的1、3、5年生存的時間依賴性ROC 曲線Figure 6 Time-dependent ROC curves of the risk model for the 1-,3- and 5-year survival in train dataset

2.4 預(yù)后模型與HCC 患者的臨床病理特征的關(guān)系

隨后分析了12-自噬相關(guān)lncRNA風(fēng)險評分在年齡、性別、分級、分期等方面的臨床價值。結(jié)果顯示，腫瘤分級、腫瘤分期和T分期越高，患者風(fēng)險評分越高，提示該12-自噬相關(guān)lncRNA模型可能與HCC的進展有關(guān)；而在不同年齡和性別間無統(tǒng)計學(xué)差異（均P＞0.05）（表4）。

表4 預(yù)后模型風(fēng)險評分與患者臨床因素的關(guān)系Table 4 The relationship between risk score and clinical factors in patients train dataset

2.5 內(nèi)部驗證集中的驗證

使用相同coef值在內(nèi)部驗證集（n=100）中進一步驗證這些結(jié)果。根據(jù)風(fēng)險評分的中位值將這些患者分為高風(fēng)險和低風(fēng)險組。與從訓(xùn)練集得出的結(jié)果一致，高風(fēng)險患者的中位OS比低風(fēng)險患者的中位OS短（P=0.0236）（圖7）。所構(gòu)建的lncRNA模型在內(nèi)部驗證集中預(yù)測患者1、3、5年生存的時間依賴性ROC曲線的AUC分別為0.694、0.733和0.746（圖8）。

圖7 驗證集中不同風(fēng)險評分HCC 患者的生存曲線Figure 7 Survival curves of the HCC patients with different risk scores in the validation dataset

圖8 驗證集中預(yù)后模型的1、3、5年生存的時間依賴性ROC 曲線Figure 8 Time-dependent ROC curves of the risk model for the 1-,3- and 5-year survival in the validation dataset

3 討 論

隨著高通量測序技術(shù)的成熟，通過檢測lncRNA表達的改變來預(yù)測HCC的預(yù)后的研究也越來，例如UCA1[24]和HOTAIR[25]。已有研究[26]表明可以使用多個自噬相關(guān)lncRNA構(gòu)建模型有效的預(yù)測神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后。目前為止，還沒有可以預(yù)測HCC患者生存的自噬相關(guān)lncRNA模型。因此，有必要建立相關(guān)預(yù)后模型來預(yù)測HCC患者的預(yù)后。

在本研究中，通過TCGA數(shù)據(jù)庫中HCC數(shù)據(jù)集探討HCC患者自噬相關(guān)lncRNA的預(yù)后作用。本研究通過lncRNA-自噬基因共表達網(wǎng)絡(luò)鑒定了347個自噬相關(guān)lncRNA。隨后篩選出12個最具預(yù)后意義的自噬相關(guān)lncRNA。在12種自噬相關(guān)的lncRNA中，CYTOR、DANCR、LINC01138、LUCAT1、MAPKAPK5-AS1、NRAV和NRSN2-AS1的高表達與患者總生存期成負(fù)相關(guān)，而LINC01871、LINC00864、LINC02362、TMEM220-AS1 和PSMB8-AS1 的高表達與患者的總生存期成正相關(guān)。在先前的研究中已經(jīng)報道了這些基因中的大多數(shù)在HCC 或其他惡性腫瘤的預(yù)后密切相關(guān)。LINC01138[27-28]在HCC 組織中表達顯著增加，并且與HCC 的臨床病理特征呈正相關(guān)，可能是HCC患者預(yù)后預(yù)測的潛在有價值的候選標(biāo)志物。DANCR[29]被證明在HCC組織中明顯過表達，并與HCC患者的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，且在體外和體內(nèi)促進HCC細胞中索拉非尼的耐藥性。MAPKAPK5-AS1[30]在HCC中與總體存活率顯著相關(guān)，有可能成為HCC的預(yù)后因子。LUCAT1[31]在HCC組織中高表達，且其與患者年齡、腫瘤組織學(xué)分級、腫瘤T分期和生存狀態(tài)顯著相關(guān)，是HCC患者生存不良的獨立危險因素。本研究和這些有類似的結(jié)果。

使用12-自噬相關(guān)lncRNA構(gòu)建預(yù)后模型，計算風(fēng)險評分，分析風(fēng)險評分與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果顯示，在訓(xùn)練集中風(fēng)險評分與HCC患者腫瘤分級、腫瘤分期和T分期有關(guān)（P＜0.05），在較高的腫瘤分級、分期中，患者的風(fēng)險評分趨于增加，表明該lncRNA模型可能與HCC的進展有關(guān)。通過多變量Cox回歸分析，該風(fēng)險預(yù)后模型是與影響HCC患者預(yù)后的獨立危險因素（P＜0.001）。該風(fēng)險模型對訓(xùn)練集HCC患者的1、3、5年生存的時間依賴性ROC曲線的AUC分別為0.801，0.819和0.787，同時在驗證集中同樣具有較好的預(yù)測能力，其1、3、5年生存的時間依賴性ROC曲線的AUC分別為0.694、0.733和0.746。本研究構(gòu)建的自噬lncRNA預(yù)后模型在內(nèi)部驗證集中同樣具有較好的靈敏度和特異性。根據(jù)這些結(jié)果，該12-自噬相關(guān)lncRNA模型為HCC患者的預(yù)后提供可靠的預(yù)測。而且12-自噬相關(guān)lncRNA是潛在的自噬相關(guān)治療靶點，對于個性化治療方案的制定也可能具有參考價值。

本研究仍存在局限性，首先，這是一項回顧性研究，研究數(shù)據(jù)源自于TCGA數(shù)據(jù)庫，因此可能產(chǎn)生一些誤差。其次，該預(yù)后模型仍有必要在其他獨立的隊列中進一步進行驗證，以明確該模型的穩(wěn)定性，對于該模型基因中未被證實功能性實驗證實與HCC預(yù)后相關(guān)的基因需要進一步實驗揭示其潛在作用機制。

通過構(gòu)建自噬基因-lncRNA共表達網(wǎng)絡(luò)，鑒定了12個自噬相關(guān)的lncRNA的預(yù)測模型，該模型對預(yù)測HCC患者1、3、5年生存率均有較好的靈敏度及特異性。雖然本研究中12-自噬相關(guān)lncRNA風(fēng)險預(yù)后模型可以較準(zhǔn)確的預(yù)測HCC患者的預(yù)后，但仍需要通過前瞻性實驗來進一步驗證。