CD133通過上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的侵襲及轉(zhuǎn)移

韓亞娟,艾力江·卡德爾,張競(jìng)競(jìng),王強(qiáng)強(qiáng),韓正全

(蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科,蚌埠 233000;*通訊作者,E-mail:dochyj@163.com)

乳腺癌發(fā)病率和死亡率居女性惡性腫瘤之首,對(duì)女性的健康和生命構(gòu)成嚴(yán)重威脅[1]。雖然近年來乳腺癌的治療手段取得較大進(jìn)展,但復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是乳腺癌患者總的生存率并沒有明顯提高的主要原因。在最近的研究中發(fā)現(xiàn),腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells,CSCs)在乳腺癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用,其特異性標(biāo)志物CD133[2]又被稱為promin-1,是一種跨膜糖蛋白,首先發(fā)現(xiàn)于白血病細(xì)胞中,后來在正常組織中發(fā)現(xiàn)也有廣泛表達(dá),表達(dá)的細(xì)胞均具有干細(xì)胞的特性。近年來,CD133已被用作結(jié)腸癌[3]、肝癌[4,5]、顱內(nèi)惡性腫瘤[6]、肺癌[7]、前列腺癌[8]等腫瘤干細(xì)胞分類的特異性表面分子標(biāo)記。CD133的表達(dá)與腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及對(duì)化療、放療等傳統(tǒng)療法的耐受性有關(guān),與許多腫瘤預(yù)后不良有關(guān)。O喙匱芯勘礱鰨CD133在發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition, EMT)的乳腺癌組織中更為明顯,表明癌細(xì)胞可以通過EMT獲得干細(xì)胞特性[5]。通過EMT獲得更強(qiáng)的運(yùn)動(dòng)和侵襲能力的乳腺癌細(xì)胞可以在遠(yuǎn)處形成繼發(fā)性轉(zhuǎn)移灶。因此,在深入研究EMT控制乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制的基礎(chǔ)上,尋找調(diào)控乳腺癌細(xì)胞EMT的核心因子,不僅可以作為判斷乳腺癌預(yù)后的重要指標(biāo),而且是一個(gè)重要的研究目的,它將進(jìn)一步發(fā)展有效的干預(yù)和治療方法,以阻止乳腺癌轉(zhuǎn)移。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

收集蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院4對(duì)新鮮乳腺癌組織及配對(duì)癌旁正常乳腺組織,所有患者術(shù)前均未接受化療、放療、內(nèi)分泌治療及靶向治療等輔助治療。患者均簽署知情同意書,研究方案經(jīng)蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 細(xì)胞與試劑

正常人乳腺細(xì)胞MCF-10A和乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231、SKBr3、MCF-7均購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所,DMEM、RPMI-1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自美國Hyclone公司,胎牛血清(FBS)、Materigel膠購自浙江天杭生物科技股份有限公司,siRNA、NC均購自上海吉瑪基因有限公司,Lipofectamin2000及RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒由Thermo Scientific公司購買,總RNA提取試劑盒由博士德生物工程公司購買,TB Green TM primax ex Taq TM試劑盒由TaKaRa公司購買,一抗(E-cadherin、vimentin、N-cadherin、CD133)、β-actin及辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔/鼠二抗均購于Abbkine科技有限公司,Transwell小室及BCA蛋白濃度測(cè)量試劑盒均購自碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

MDA-MB-231和MCF-7在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng),SKBR3在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng),MCF-10A在MCF-10A特殊培養(yǎng)基中培養(yǎng);在37 ℃和5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染對(duì)象為處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,要求轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞融合程度達(dá)到60%。轉(zhuǎn)染步驟嚴(yán)格按照轉(zhuǎn)染說明書進(jìn)行,實(shí)驗(yàn)分為control組(只轉(zhuǎn)染Lipofectamine?2000)、NC組(轉(zhuǎn)染Lipofectamine?2000和NC序列)和si-CD133組(轉(zhuǎn)染Lipofectamine?2000和si-CD133序列)。

1.4 總RNA提取及實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)MDA-MB-231細(xì)胞,至細(xì)胞融合度達(dá)到60%時(shí),按照Lipofectamine2000說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作,轉(zhuǎn)染后48 h,用Trizol法提取細(xì)胞總RNA。將提取的總RNA按RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(reverse-aid-first-strang-cDNA合成試劑盒)說明書反轉(zhuǎn)錄RNA為cDNA,合成的cDNA使用TB GreenTMPrimix Ex TaqTM試劑盒通過PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè),以GAPDH為內(nèi)參檢測(cè)CD133表達(dá)。最終Ct值采用2-ΔΔCt方法分析。實(shí)時(shí)熒光定量PCR采用兩步PCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)程序。引物序列見表1。步驟1:預(yù)變性(95 ℃,30 s);步驟2:PCR反應(yīng)(95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s),共40個(gè)循環(huán)。所有試驗(yàn)均重復(fù)3次。

表1 PCR擴(kuò)增引物序列Table 1 PCR amplification primer sequences

1.5 Western blot檢測(cè)E-cadherin、vimentin、N-cadherin、CD133蛋白表達(dá)

分別將control組、NC組和si-CD133組細(xì)胞裂解提取后提取蛋白,以及將4對(duì)新鮮乳腺癌組織和癌旁正常乳腺組織研碎加入裂解液提取蛋白。使用BCA法測(cè)蛋白質(zhì)濃度,于SDS-PAGE上取等量蛋白樣品進(jìn)行電泳,PVDF膜轉(zhuǎn)膜,快速封閉液封閉15 min,一抗(E-cadherin、vimentin、N-cadherin、CD133、β-actin)按1 ∶1 000稀釋,4 ℃條件下孵育過夜。TPBS溶液洗3次,每次洗10 min,二抗按1 ∶5 000稀釋,室溫下孵育2 h,TPBS溶液洗3次,曝光顯影。

1.6 Transwell檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力

將Materigel膠與無血清DMEM培養(yǎng)基按1 ∶8的比例稀釋,每孔加入60 μl的Materigel膠均勻覆蓋Transwell小室底部,培養(yǎng)60 min使之呈半凝固態(tài)。control組、NC組、si-CD133組分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231細(xì)胞,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔,消化離心后,用無血清培養(yǎng)基重懸計(jì)數(shù)。于37 ℃、5%CO2飽和濕度下培養(yǎng)48 h;取出小室;PBS清洗2次,4%多聚甲醛固定15 min,用結(jié)晶紫染液室溫下染色10 min;PBS漂去多余染料,在200×視野下觀察透膜細(xì)胞數(shù),計(jì)數(shù)并求平均值。侵襲抑制率(%)=(1-si-CD133組侵襲細(xì)胞個(gè)數(shù)/control組細(xì)胞侵襲個(gè)數(shù))×100%。

1.7 Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移能力

無需鋪基質(zhì)膠外分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的control組、NC組、si-CD133組的MDA-MB-231細(xì)胞,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔,消化離心后,用無血清培養(yǎng)基重懸于小室中。于37 ℃、5% CO2飽和濕度下培養(yǎng)24 h;取出小室;PBS清洗2次,4%多聚甲醛固定15 min,用結(jié)晶紫染液室溫下染色10 min;PBS漂去多余染料,在200×視野下觀察透膜細(xì)胞數(shù)。計(jì)數(shù)并求平均值,所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。遷移抑制率(%)=(1-si-CD133組侵襲細(xì)胞個(gè)數(shù)/control組細(xì)胞侵襲個(gè)數(shù))×100%。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,多組間比較采用單因素方差分析及兩因素方差分析,組間兩兩比較則采用LSD-t檢驗(yàn),P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CD133基因在不同乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與MCF-10A相比,乳腺癌細(xì)胞中MDA-MB-231、SKBR3和MCF-7的CD133表達(dá)明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖1)。由于MDA-MB-231細(xì)胞中CD133表達(dá)升高最顯著,因此選擇MDA-MB-231細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)研究。

與MCF-10A細(xì)胞相比,* P <0.05圖1 CD133在正常人乳腺上皮細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)Figure 1 Expression of CD133 in normal breast epithelial cells and breast cancer cells

2.2 Western blot法檢測(cè)乳腺癌組織中CD133蛋白的表達(dá)

Western blot結(jié)果表明,與正常乳腺組織相比,乳腺癌組織中CD133表達(dá)更高(P<0.05,見圖2)。

與相應(yīng)的正常組織相比,* P <0.05;N代表正常乳腺組織,T代表乳腺癌組織圖2 Western blot法檢測(cè)乳腺癌組織中CD133蛋白的表達(dá)Figure 2 Expression of CD133 protein in breast cancer tissues by Western blot

2.3 篩選效果最佳的CD133特異性siRNA序列

Western blot和熒光定量PCR結(jié)果顯示,siRNA-3對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中CD133 mRNA和蛋白的干擾效果最好,與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖3)。因此我們選擇siRNA-3進(jìn)行后續(xù)研究。

與control組比較,* P <0.05圖3 三條靶向不同區(qū)域的特異性siRNA轉(zhuǎn)染48 h對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞CD133干擾效果Figure 3 Transfection efficacy of CD133 in MDA-MB-231 cells after transfected with three specific siRNA transfection targeted at different regions for 48 h

2.4 下調(diào)CD133基因后對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞侵襲、遷移能力的影響

為了解下調(diào)CD133對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞侵襲遷移能力的影響,實(shí)驗(yàn)分為control組、NC組、si-CD133組,下調(diào)CD133表達(dá)后,Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,48 h si-CD133組跨膜細(xì)胞數(shù)少于control組和NC組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖4)。與control組和NC組相比,24 h si-CD133組乳腺癌細(xì)胞的遷移能力降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖4)。以上證明,下調(diào)CD133表達(dá)能抑制MDA-MB-231細(xì)胞侵襲、遷移能力。

與NC及control組比較,* P <0.05圖4 Transwell小室檢測(cè)下調(diào)CD133基因后對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞侵襲、遷移能力的影響Figure 4 Effect of down-regulation of CD133 gene on the invasion and migration ability of breast cancer MDA-MB-231 cells by Transwell

2.5 MDA-MB-231細(xì)胞下調(diào)CD133基因?qū)MT相關(guān)蛋白E-cadherin、vimentin、N-cadherin表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示,si-CD133組vimentin、N-cadherin的表達(dá)率低于NC組和control組。相反,E-cadherin在轉(zhuǎn)染組中的表達(dá)程度高于NC組和control組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖5)。同樣,熒光定量PCR結(jié)果同樣證明了CD133基因在MDA-MB-231細(xì)胞中的低表達(dá)能下調(diào)vimentin、N-cadherin的表達(dá),且上調(diào)E-Cadherin的表達(dá),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖5)。

與NC組及control組比較,* P <0.05圖5 下調(diào)MDA-MB-231細(xì)胞CD133基因?qū)MT相關(guān)蛋白E-cadherin、vimentin、N-cadherin表達(dá)的影響Figure 5 Effect of down-regulating CD133 gene on the expression of EMT-related proteins E-cadherin, vimentin, N-cadherin in MDA-MB-231 cells

3 討論

乳腺癌是一種異質(zhì)性疾病,具有多種風(fēng)險(xiǎn)因素,包括環(huán)境、飲食、遺傳和表觀遺傳等。雖然有統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示,Ⅰ期乳腺癌病人的5年生存率可以達(dá)到97.9%,Ⅱ、Ⅲ期病人的5年生存率也達(dá)到75%和61%,但仍有20%-30%乳腺癌病人發(fā)生復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[9],因此,尋找有效抑制乳腺癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的機(jī)制具有重要的意義。最近的研究為腫瘤干細(xì)胞(CSCs)假說[10]提供了強(qiáng)有力的支持,該假說認(rèn)為許多癌癥,包括乳腺癌,是由具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞亞群驅(qū)動(dòng)的。這些細(xì)胞可能介導(dǎo)轉(zhuǎn)移,并且由于它們對(duì)化療和放療的相對(duì)耐藥性,導(dǎo)致治療復(fù)發(fā)。CD133分子是腫瘤干細(xì)胞的特征性表面標(biāo)志物之一。CD133是Prominin家族的成員之一,又名Prominin-1,是一種跨膜糖蛋白,具有5個(gè)跨膜區(qū)。定位于細(xì)胞膜上表面突起[11,12],是分離腫瘤干細(xì)胞最具代表性的生物標(biāo)志物之一。CD133在胰腺導(dǎo)管腺癌EMT水平的腫瘤轉(zhuǎn)移中起重要作用[13,14],而其在乳腺癌中的功能作用尚不明確。我們觀察到,將正常乳腺上皮細(xì)胞與乳腺癌細(xì)胞中CD133蛋白表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果表明,與正常乳腺上皮細(xì)胞相比,CD133在乳腺癌細(xì)胞中明顯高表達(dá)。為進(jìn)一步驗(yàn)證這個(gè)結(jié)果,通過Western blot檢測(cè)乳腺癌組織及正常乳腺組織中CD133蛋白表達(dá)量,結(jié)果同樣表明,CD133在乳腺癌組織中表達(dá)量明顯升高。由此說明,CD133在乳腺癌中具有表達(dá)差異。為進(jìn)一步探究CD133的生物功能學(xué)作用,我們將CD133-siRNA轉(zhuǎn)染進(jìn)入MDA-MB-231細(xì)胞中,結(jié)果顯示CD133-siRNA組CD133基因和蛋白的相對(duì)表達(dá)量較陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組明顯降低,說明實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)合成的干擾序列能特異性抑制CD133基因的表達(dá)。Transwell實(shí)驗(yàn)顯示CD133-siRNA組細(xì)胞侵襲和遷移能力明顯受到抑制。最終得出結(jié)論,CD133能夠促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的侵襲遷移能力。相關(guān)文獻(xiàn)表明,CD133在三陰性乳腺癌及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織中過度表達(dá),預(yù)示著乳腺癌患者預(yù)后不良,這對(duì)于醫(yī)師及時(shí)給予恰當(dāng)?shù)母深A(yù)治療非常重要[15]。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是指完全分化的上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞分化的過程。EMT在胚胎發(fā)育和創(chuàng)傷愈合中是生理的[16],但在癌癥中是病理的,它賦予細(xì)胞高度侵襲性的特征,促進(jìn)傳播、治療抗性和復(fù)發(fā)[17]。EMT可導(dǎo)致細(xì)胞骨架重組、細(xì)胞間黏附喪失、頂端-基底極性異常,從而增強(qiáng)癌細(xì)胞的活力和侵襲能力。為了確定CD133介導(dǎo)的促進(jìn)MDA-MB-231細(xì)胞侵襲和遷移的機(jī)制,我們研究了與EMT相關(guān)的蛋白E-cadherin、N-cadherin和vimentin。當(dāng)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移時(shí),E-cadherin失去其功能,導(dǎo)致細(xì)胞通過血液循環(huán)[18]轉(zhuǎn)移到其他器官。E-cadherin表達(dá)下調(diào)和N-cadherin表達(dá)上調(diào)在EMT過程中至關(guān)重要,在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中誘導(dǎo)細(xì)胞黏附于基質(zhì)并增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲能力[19,20]。Snail是EMT進(jìn)程中最重要的分子之一,它與E-cadherin啟動(dòng)子的E-box區(qū)域結(jié)合,直接抑制E-cadherin DNA轉(zhuǎn)錄,降低其蛋白表達(dá),促進(jìn)EMT[21]。在EMT過程中,細(xì)胞黏附能力的喪失伴隨著分子類型的改變,包括上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白表達(dá)減少,間充質(zhì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白表達(dá)增加。本研究結(jié)果表明,下調(diào)CD133表達(dá)后,上皮性的表型E-cadherin表達(dá)顯著升高,而間充質(zhì)表型vimentin、N-cadherin等表達(dá)顯著降低。提示CD133通過EMT途徑促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移。

綜上所述,CD133通過EMT途徑促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移。抑制CD133表達(dá)可顯著抑制乳腺癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移能力,因此研發(fā)靶向敲除CD133的藥物可能為乳腺癌的臨床治療提供新的思路。