哺乳動物卵母細胞成熟相關因子研究

張羽芳　陽美霞　湯亞茹　張虹亮　王水蓮

摘要：哺乳動物卵母細胞主要參與動物繁殖活動，其體外成熟技術也是體外受精-胚胎移植（IVF-ET）的關鍵。卵母細胞從胚胎期至青春期前始終維持停滯狀態(tài)，直到青春期減數(shù)分裂恢復，隨后卵母細胞成熟。在此期間，表皮生長因子、馬絨毛膜促性腺激素、人絨毛膜促性腺激素、環(huán)磷酸腺苷、成熟促進因子及卵泡液等因子均參與卵母細胞成熟的調控。本文主要分析上述6種因子對卵母細胞成熟調控的影響，旨在完善卵母細胞成熟的相關理論機制，為卵母細胞體外成熟培養(yǎng)體系提供參考。

關鍵詞：卵母細胞;成熟;表皮生長因子;人絨毛膜促性腺激素;成熟促進因子

中圖分類號：R321? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.14.007

文章編號：1006-1959（2020）14-0017-04

Study on Factors Related to Maturation of Mammalian Oocytes

ZHANG Yu-fang，YANG Mei-xia，TANG Ya-ru，ZHANG Hong-liang，WANG Shui-lian

（Department of Veterinary Medicine，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，Hunan，China）

Abstract：Mammalian oocytes are mainly involved in animal reproduction activities， and their in vitro maturation technology is also the key to in vitro fertilization-embryo transfer （IVF-ET）. Oocytes remain stagnant from embryonic stage to pre-pubertal period， until meiosis in puberty recovers， and then the oocyte matures. During this period， factors such as epidermal growth factor， horse chorionic gonadotropin， human chorionic gonadotropin， cyclic adenosine monophosphate， maturation promoting factor， and follicular fluid are involved in the regulation of oocyte maturation. This article mainly analyzes the influence of the above six factors on the regulation of oocyte maturation， and aims to perfect the relevant theoretical mechanism of oocyte maturation， and provide a reference for the in vitro maturation culture system of oocytes.

Key words：Oocyte;Maturation;Epidermal growth factor;Human chorionic gonadotropin;Maturation promoting factor

近年來，隨著輔助生殖技術、動物胚胎工程的蓬勃發(fā)展以及細胞克隆技術的廣泛應用，卵母細胞體外成熟（Invitromaturation，IVM）的機理研究愈發(fā)重要。卵母細胞是哺乳動物最重要的配子之一，健康的卵母細胞是動物繁殖后代的關鍵。卵母細胞在進入青春期前停滯在第一次減數(shù)分裂中期，其中只有少數(shù)卵母細胞能夠恢復減數(shù)分裂最終達到成熟，這一過程是依賴眾多因子共同調控完成[1]。本文主要闡述影響卵母細胞成熟的因子功能及作用，旨在為揭示卵母細胞成熟機理提供思路，為更好挖掘優(yōu)良母畜潛能以及推進良種家畜繁殖提供理論基礎。

1卵母細胞成熟過程

卵母細胞成熟是一個復雜、動態(tài)的過程，包括細胞核和細胞質的成熟，如在培養(yǎng)基中添加葡萄糖可通過促進細胞核成熟從而提高早期胚胎發(fā)育[2];在培養(yǎng)基中添加大網(wǎng)膜提取物（Activated-omental extract，AOE）處理卵母細胞可促進其細胞質成熟從而提高成熟率[3];而添加糖酵解抑制劑可通過抑制細胞質成熟降低卵母細胞成熟率[4]。

1.1細胞核成熟? 卵母細胞停滯在第一次減數(shù)分裂中期時，核染色質高度疏散，核形態(tài)呈泡狀結構，被稱為生發(fā)泡（Germinal vesicle，GV）。在促性腺激素的作用下細胞恢復減數(shù)分裂，核膜破裂，rRNA合成停止，核仁消失，細胞核致密化，生發(fā)泡破裂（Germinal vesicle break down，GVBD），排出第一極體隨后停滯在第二次減數(shù)分裂中期。卵母細胞胞核成熟最為典型的特征是第一極體的排出[1]。

1.2細胞質成熟? 細胞質成熟涉及細胞器、細胞骨架重組等變化。線粒體為卵母細胞成熟提供能量，在成熟卵母細胞內(nèi)所占體積比重較大;線粒體向高能量消耗區(qū)域的移動對卵母細胞的成熟至關重要，如在小鼠體內(nèi)，未成熟的卵母細胞的線粒體主要聚集在生發(fā)泡的周圍，而生發(fā)泡破裂時線粒體移動并遠離細胞核周圍[5]。真核細胞包含三種主要的細胞骨架：微絲、中間絲和微管。細胞骨架是一種動態(tài)的、適應性強的結構，它可以根據(jù)細胞的需要保持不變或進行修飾，其中微管主要參與紡錘體的形成，而微絲參與形成皮質、建立極性等過程。在小鼠卵母細胞中，微管在GV期呈現(xiàn)相對均勻的分布，發(fā)生GVBD后，微管在染色體周圍凝聚并開始向皮質遷移，而微絲在卵母細胞皮層下區(qū)域密集堆積[6]。研究證實在豬卵母細胞體外培養(yǎng)基中添加丙氨酸、β-巰基乙醇、亮氨酸和異亮氨酸均可通過提高細胞中谷胱甘肽（Glutathione，GSH）表達水平，從而促進后期胚胎發(fā)育，因此，GSH可作為卵母細胞胞質成熟的標志[7]。

2影響卵母細胞成熟的因子

2.1表皮生長因子? 表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）是由53個氨基酸構成的多肽單鏈，其家族包括EGF和類EGF因子，它們具有高度相似的結構和功能，都可結合EGF受體（epidermal growth factorreceptor，EGFR）發(fā)揮其相關作用。EGFR是分子量為170 kDa的細胞膜糖蛋白，屬于酪氨酸激酶受體。類EGF因子包括雙調蛋白（amphiregulin，AREG）、β細胞素（betacellulin，BTC）等11個蛋白質因子[8]。

EGF主要依賴LH來調控卵母細胞的成熟，LH通過作用壁層顆粒細胞的LH受體，激活壁層顆粒細胞EGF作用靶點，再將信號傳遞至卵丘顆粒細胞的EGF受體，從而發(fā)揮LH峰作用促進排卵的發(fā)生[9]。實驗證實使用EGF處理體外培養(yǎng)牛卵母細胞，可顯著提高其GVBD率，促進細胞核成熟，與透明質酸聯(lián)合使用效果更為顯著[10]。通過添加EGF培養(yǎng)不同規(guī)格的豬卵泡，證明EGF通過調節(jié)LH信號從而促進卵泡中卵母細胞核成熟、卵丘擴展及透明質酸的分泌，同時促進微絲F-actin重排[11]。類EGF因子同樣影響卵母細胞成熟，EGFR的抑制劑AG1478可顯著抑制AREG和促卵泡素FSH誘導的減數(shù)分裂恢復，并且EGF可通過旁分泌作用于卵丘顆粒細胞，提高卵丘擴展因子Ptgs2的表達水平從而促進卵丘擴展和卵母細胞成熟，且在卵丘顆粒細胞和排卵前卵泡中，類EGF因子也會瞬時誘導卵丘擴展因子（Has2、Ptx3、Tnfaip6、Ptgs2）mRNA表達水平升高，所以EGF常作為卵母細胞體外成熟培養(yǎng)體系的添加因子之一[9]。同時，EGF還可通過促進卵丘細胞的胞吞和自噬功能影響卵母細胞的成熟[12]。

EGF可多方面參與卵母細胞的調節(jié)，如促進核成熟、上調卵丘擴展因子水平，影響卵丘細胞胞吞、自噬，最終促進卵母細胞成熟。

2.2馬絨毛膜促性腺激素? 馬絨毛膜促性腺激素（pregnant mare serum gonadotropin，PMSG）由懷孕母馬的子宮內(nèi)膜杯（子宮內(nèi)膜表面圍繞著著點的環(huán)狀結構）分泌。PMSG是胎盤哺乳動物中糖基化程度最高的垂體糖蛋白[13]。PMSG常應用于哺乳動物的超數(shù)排卵。在進行小鼠卵母細胞實驗時，為得到更多的細胞，往往會對雌性小鼠進行PMSG腹腔注射超數(shù)排卵。Ryabukha YA等[14]研究顯示，通過在小鼠發(fā)情期腹腔注射10 IU的PMSG較發(fā)情間期可以顯著提高GV期卵母細胞得到的數(shù)量。且發(fā)現(xiàn)PMSG注射組GV期細胞的卵泡和細胞質的直徑明顯低于其它卵母細胞，透明帶的厚度和卵黃周隙也有同樣的情況，表明PMSG對在發(fā)情周期獲取更多優(yōu)質細胞有著重要作用。PMSG除了超數(shù)排卵的作用外，還可促進小鼠卵泡發(fā)育，且PMSG較FSH半衰期長，低劑量PMSG即可等同于高劑量FSH作用，所以常使用PMSG代替FSH的使用[13]。

2.3人絨毛膜促性腺激素? 在輔助生殖技術中，成熟激活是未成熟卵母細胞在受精前的最后分化過程。臨床上常用人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，hCG）來激活卵母細胞成熟。hCG最早于1927年從孕婦的血液和尿液中分離得到，是由胎盤分泌的糖蛋白激素，與LH有類似作用可促進卵泡發(fā)育、卵母細胞的成熟排卵。且hCG的半衰期較LH長，短時間內(nèi)不易降解，與受體的結合更為緊密，所以臨床上通常使用hCG代替LH[15]。Saeedeh D等[16]證明hCG結合FSH可提高人卵母細胞成率。郭劍等[17]在成熟培養(yǎng)基中添加不同濃度的hCG培養(yǎng)小鼠卵母細胞，中、高濃度可明顯提高優(yōu)質胚胎率。邢雅欣等[18]的研究同郭劍的結果一致，在受精液和胚胎培養(yǎng)液中添加一定濃度的hCG可提高囊胚細胞數(shù)及調控胚胎質量相關基因的表達。同樣曹筠青等[19]研究證實在豬卵母細胞體外成熟培養(yǎng)基中添加10 IU/ml的hCG對后續(xù)胚胎發(fā)育起到最佳的促進作用。hCG可促進卵母細胞GVBD，且主要影響卵母細胞發(fā)育為早期胚胎的能力。

2.4環(huán)磷酸腺苷? 環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）是參與生命活動的第二信使。在卵泡中，其來源有兩種方式，一種是顆粒細胞通過縫隙連接傳遞給卵母細胞;第二種是通過G蛋白偶聯(lián)受體激活胞內(nèi)腺苷酸環(huán)化酶（adenylate cyclase， ADCY）。ADCY是一種能將三磷酸腺苷（ATP）轉化為磷酸腺苷和焦磷酸鹽的酶，可合成并產(chǎn)生高水平的cAMP，是維持卵母細胞減數(shù)分裂阻滯的關鍵因素，使卵母細胞停滯在GV期。cAMP的降解是由卵丘卵母細胞復合體（cumulus oocyte complexes，COCs）內(nèi)的環(huán)核苷酸磷酸二酯酶（PDE）激活而發(fā)生[20]。在卵母細胞中，cAMP在促性腺激素的促進下增加到峰值，隨后在胞質胞核中濃度下降，從而導致生發(fā)泡破裂（GVBD）[21]。

細胞內(nèi)高水平的cAMP通過激活cAMP依賴性蛋白激酶（PKA）來維持卵母細胞在GV期的減數(shù)分裂停滯，而PKA又反過來維持細胞減數(shù)分裂周期的成熟促進因子（maturation promoting factor，MPF）的表達[20-22]。cAMP的過早減少會導致胞質胞核成熟不一致，影響后續(xù)發(fā)育潛能，如早期胚胎的形成。實驗證實從青春期前的母豬得到的卵母細胞相對于成年母豬的卵母細胞其積累cAMP的能力較弱，導致后續(xù)囊胚率低于成年母豬[23]。同樣在體外成熟培養(yǎng)體系中添加cAMP類似物雙丁酰環(huán)腺苷（N6，2'-O-dibutyryladenosine 3′，5′-cyclicmonophosphate，dbcAMP）可促進由FSH誘導的卵丘擴展相關基因Has2、Tnfaip6和Ptgs2的表達，以及類EGF因子相關基因AREG和EREG的表達，即cAMP可通過調節(jié)EGF受體信號和卵母細胞卵丘縫隙連接信號交流，促進牛小腔卵泡中卵母細胞的發(fā)育能力[24]。所以環(huán)磷酸腺苷對卵母細胞的成熟及減數(shù)分裂有著決定性的作用。

2.5成熟促進因子? 成熟促進因子（maturation promoting factor，MPF）是主要調控卵母細胞減數(shù)分裂恢復的促進因子。MPF的活性升高，可開啟有絲分裂和減數(shù)分裂。MPF是一種異源二聚體蛋白激酶，由調節(jié)亞基細胞周期蛋白cyclinB和催化亞基細胞周期蛋白依賴性激酶p34cdc2組成。其活性主要由細胞質中的cyclinB在細胞周期中的不斷活化和衰減來調節(jié)，且p34cdc2必須被特異性去磷酸化才能在過程中達到其活性狀態(tài)[25]。現(xiàn)在研究者們通過使用抑制劑來研究MPF的功能與作用，這些抑制劑的抑制途徑是通過干擾p34cdc2的磷酸化或者阻斷其ATP結合點如脫氫亮氨酸（dehydroleuco-dine，DhL）、放線菌酮（cycloheximide，CHX）來實現(xiàn)。Suvá M等[26]分別使用CHX和DhL處理孤雌激活后的卵母細胞，發(fā)現(xiàn)CHX可通過抑制MPF活性而促進第二極體排出、提高原核形成率并且不影響胚胎發(fā)育。而DhL僅能促進第二極體排出，對原核形成無影響。所以MPF在卵母細胞孤雌激活后發(fā)育為胚胎過程中發(fā)揮重要作用。Baek JI等[27]研究顯示，使用玻璃化冷凍卵子進行體外受精，應用MPF促進劑咖啡因，可以維持MPF的高活性，并提高受精卵的囊胚形成率和附植率，但不影響囊胚中的細胞數(shù)量。Li J等[28]研究表明，Cyclin B2可替代Cyclin B1來驅動MPF的激活和第一次減數(shù)分裂的恢復，而Cyclin B2可補償CyclinB1在第二次減數(shù)分裂中期阻滯中的作用。哺乳動物的MPF活性常從GV期緩慢上升，在第一次減數(shù)分裂時達到峰值隨后降低，直到第二次減數(shù)分裂中期再次達到峰值，其活性變化周期與細胞成熟密切相關[25]。生長抑制特異性基因6（growth arrest-specific gene，Gas6）干擾RNA處理卵母細胞可通過下調Cyclin B1蛋白表達從而抑制MPF活化，影響MPF變化周期[29]。在鎘暴露小鼠卵母細胞中，鎘可通過維持MPF高活性，使MPF變化周期紊亂，抑制第一極體的排出，無法完成減數(shù)分裂[30]。MPF對卵母細胞的影響主要集中在卵母細胞減數(shù)分裂恢復以及卵母細胞發(fā)育為早期胚胎的能力兩個方面。

2.6卵泡液? 卵泡液即卵泡中的液體，主要由血漿滲出物和來自壁層顆粒細胞和膜細胞的分泌產(chǎn)物組成，與COCs密切接觸。卵泡液影響卵泡發(fā)育過程、卵子成熟和排卵，是卵母細胞發(fā)育的微環(huán)境，影響其受精及后續(xù)胚胎發(fā)育。同時卵泡液中還含有顆粒細胞和膜細胞分泌的活性產(chǎn)物，如卵母細胞成熟所必須的類固醇激素（雌激素和孕酮）、生長調節(jié)因子等。卵泡液的成分主要由激素、旁分泌和自分泌信號通路直接動態(tài)的調節(jié)，而機體本身的身體狀況只能起間接作用[31]。

研究顯示卵泡液中激素FSH可促進卵母細胞減數(shù)分裂恢復，從而影響其成熟率[32]。在豬卵母細胞的培養(yǎng)基中添加卵泡液可促進細胞成熟、降低多精入卵率從而提高體外受精率[33]。卵泡液中還含有積累在卵母細胞內(nèi)的代謝物，可為卵母細胞的分化提供必要的細胞內(nèi)物質，包括氨基酸、脂類、核苷酸和其他小分子[34]。處于正常周期的卵巢，卵泡液中高濃度的生長分化因子9（growth differentiation factor 9，GDF-9）能夠促進卵母細胞核的成熟并有益于后續(xù)胚胎發(fā)育質量[35];同樣卵泡液中的骨形成蛋白15（bone morphogenetic protein-15，BMP-15）呈現(xiàn)高濃度表達時，受精卵可發(fā)育為最佳形態(tài)的早期胚胎[36]。卵泡液在人類的研究越來越寬泛。卵泡液中成分通過促進胞質胞核成熟和提高早期胚胎發(fā)育能力影響卵母細胞成熟，所以在卵母細胞體外成熟培養(yǎng)體系中添加一定的卵泡液有利于細胞成熟。

3 總結

卵母細胞成熟是一個復雜、動態(tài)的過程，其中EGF、hCG、PMSG、MPF、cAMP、卵泡液均發(fā)揮重要作用，且各調節(jié)因子間存在相互聯(lián)系，共同參與卵母細胞成熟的調控。各因子主要通過影響卵母細胞減數(shù)分裂恢復、細胞核及細胞質的成熟、卵母細胞發(fā)育為早期胚胎的能力等方面參與調控卵母細胞成熟。本文通過闡明影響卵母細胞成熟相關因子的作用及途徑，旨在揭示卵母細胞成熟的機理，可為完善卵母細胞體外成熟培養(yǎng)體系提供一定的參考，最終為推動輔助生殖技術發(fā)展提供理論基礎。

參考文獻：

[1]Conti M，F(xiàn)ranciosi F.Acquisition of oocyte competence to develop as an embryo：integrated nuclear and cytoplasmic events[J].Human Reproduction Update，2018，24（3）：245-266.

[2]Jing W，Guo LW，Hong JY.Effects of glucose metabolism Pathwayson nuclear and cytoplasmic maturation of pig oocytes[J].Scientific Reports，2020，10（1）：2782.

[17]郭劍，羅萌萌，崔靜.HCG對小鼠卵母細胞體外成熟的影響[J].中國煤炭工業(yè)醫(yī)學雜志，2017，20（3）：310-312.

[18]邢雅欣，解其貴，楊志勇，等.HCG在小鼠卵母細胞體外受精胚胎發(fā)育過程中的作用[J].生殖醫(yī)學雜志，2018，27（10）：1000-1005.

[19]曹筠青，汪正鑄，李子義，等.豬卵母細胞體外受精條件的優(yōu)化[J].中國獸醫(yī)學報，2017，37（4）：728-734.

[20]Ramos LG，Santos Monteiro CA，Souza-Fabjan JMG，et al.Role of cAMP modulator supplementations during oocyte in vitro maturation in domestic animals[J].Animal Reproduction Science，2018（199）：1-14.

[21]Ruth A，Tamás S，Dominiek M.Porcine oocyte maturation？in vitro：role of cAMP and oocyte-secreted factors-A practical approach[J].Journal of Reproduction and Development，2016，62（5）：439-449.

[22]Hyemin Y，Hoon J，Eun-Young Kim，et al.Knockdown of PRKAR2B Results in the Failure of Oocyte Maturation[J].Cellular Physiology and Biochemistry，2018，45（5）：2009-2020.

[23]Ruth A，Tamás S，Dominiek M，et al.Porcine Oocyte Maturation in Vitro：Role of cAMP and Oocyte-Secreted Factors-A Practical Approach[J].Journal of Reproduction and Development，2016，62（5）：439-449.

[24]Satoshi S，Tadayuki Y，Maria GP，et al.Effect of pre-in vitro maturation with cAMP modulators on the acquisition of oocyte developmental competence in cattle[J].Journal of Reproduction and Development，2018，64（3）：233-241.

[25]Meenakshi T，Anumegha G，Alka S，et al.Role of mitogen activated protein kinase and maturation promoting factor during the achievement of meiotic competency in mammalian oocytes[J].Journal of Cellular Biochemistry，2018，19（1）：123-129.

[26]Suvá M，Canel NG，Salamone DF.Effect of single and combined treatments with MPF or MAPK inhibitors on parthenogenetic haploid activation of bovine oocytes[J].Biology of Reproduction，2019，19（4）：386-393.

[27]Baek JI，Seol DW，Lee AR，et al.Maintained MPF Level after Oocyte Vitrification Improves Embryonic Development after IVF，but not after Somatic Cell Nuclear Transfer[J].Moleculer Cells，2017，40（11）：871-879.

[28]Li J，Tang JX，Cheng JM，et al.Cyclin B2 can compensate forCyclinB1in oocyte meiosis I[J].Journal of Cell Biology，2018，217（11）：3901-3911.

[29]Kim KH，Kim EY，Kim Y，et al.Gas6 Downregulation Impaired Cytoplasmic Maturation and Pronuclear Formation Independent to the MPF Activity[J].PLoS One，2011，6（8）：e23304.

[30]盧曉麗.鎘抑制卵母細胞MI期進程中MPF的活性及其相關基因的表達[D].福建醫(yī)科大學，2015.

[31]Castiglione Morelli MA，Iuliano A，Schettini SCA，et al.NMR metabolic profiling of follicular fluid for investigating the different causes of female infertility：A pilot study[J].Metabolomics，2019，15（2）：19.

[32]Mitchell PR，AMusa Z，Shehua S，et al.The effect of follicular fluid hormones on oocyte recovery after ovarian stimulation：FSH level predicts oocyte recovery[J].Reproductive Biology Endocrinology，2009（7）：35.

[33]董振國，付博，王嘉博，等.幾種因素對豬卵母細胞體外成熟培養(yǎng)的影響[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2009（23）：44-45.

[34]Laís B，Silveira CF.Human follicular fluid and effects on reproduction[J].Jornal Brasileiro de Reproducao Assistida，2016，20（1）：38-40.

[35]Gode F，Gulekli B，Dogan E，et al.Influence of follicular fluid GDF9 and BMP15 on embryo quality[J].Fertility and Sterility，2011，95（7）：2274-2278.

[36]Wu YT，Tang L，Cai J，et al.High bone morphogenetic protein-15 level in follicular fluid is associatedwith high quality oocyte and subsequent embryonic development[J].Human Reproduction，2007，22（6）：1526-1531.

收稿日期：2020-05-07;修回日期：2020-05-17

編輯/成森

基金項目：1.國家自然科學基金（編號：31672507）;2.湖南農(nóng)業(yè)大學雙一流建設項目（編號：SYL201802017）

作者簡介：張羽芳（1993.12-），女，貴州銅仁人，碩士研究生，主要從事動物生殖調研究

通訊作者：張虹亮（1987.1-），男，河北滄州人，博士，碩士生導師，主要從事動物生殖與發(fā)育調控研究;王水蓮（1973.10-），女，湖南長沙人，博士，博士生導師，教授，主要從事動物生殖調控研究