高糖誘導的視網(wǎng)膜新生血管形成中NLRP3炎癥小體與自噬的關系研究△

姚國敏 李蓉 閆紅林 王莉 蔡天志 周凌霄 鄧穎

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病常見的微血管并發(fā)癥之一，是工作年齡人群致盲的首位病因。臨床上，DR分為早期即非增生型DR(non-proliferative diabetic retinopathy，NPDR)和晚期即增生型DR(proliferative diabetic retinopathy，PDR)。早期視網(wǎng)膜血管通透性增加和毛細血管阻塞，導致視網(wǎng)膜微動脈瘤、出血和硬性滲出，晚期主要病變是視網(wǎng)膜新生血管形成，導致玻璃體積血或牽拉性視網(wǎng)膜脫離，嚴重影響患者視力[1]。DR的發(fā)生機制十分復雜，在視網(wǎng)膜微血管損害的病理過程中，高血糖發(fā)揮了關鍵作用，隨著研究的深入，其他因素在DR中的作用也不可忽視。

炎癥小體是由細胞內的模式識別受體、適配器蛋白質和半胱天冬酶(Caspase)組成的大型細胞質蛋白復合物，導致前炎性細胞因子IL-1β和IL-18的釋放。其中，核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3)炎癥小體是最為典型的受體蛋白，它由 NLRP3、Caspase招募結構域的凋亡相關顆粒樣蛋白(apoptosis-associated speck like protein,ASC)和Caspase-1組成[2]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，NLRP3炎癥小體與DR，尤其是PDR中視網(wǎng)膜新生血管的形成密切相關[3-4]。自噬是將細胞漿內蛋白和功能失調的細胞器轉移到溶酶體進行降解的過程，被認為是一個發(fā)生在基礎水平上的代謝過程，其功能主要是在蛋白質和細胞器更新過程中維持自身的穩(wěn)態(tài)。大量研究證實，自噬在人類健康和多種疾病中起著極其重要的作用[5]，自噬信號通路也參與了DR的病理生理過程[6]。

新近研究發(fā)現(xiàn)，NLRP3炎癥小體與自噬在一些疾病中相互調控，共同參與疾病的發(fā)生發(fā)展，如在糖尿病動物模型中發(fā)現(xiàn)，激活自噬可以抑制NLRP3炎癥小體表達，從而減輕其心肌缺血-再灌注損傷[7]，而NLRP3炎癥小體可負向調控糖尿病腎病的足細胞自噬[8]。然而，二者在不同疾病中的相互關系存在較大差異[9-10]，且目前關于二者在DR中的關系研究仍較少。鑒于此，本研究利用高糖誘導的人視網(wǎng)膜微血管內皮細胞(human retinal microvascular endothelial cells，HRMEC)為疾病模型，觀察NLRP3炎癥小體與自噬在DR視網(wǎng)膜新生血管形成中的關系。

1 材料與方法

1.1 材料HRMEC(上海中喬新舟生物科技有限公司)；M199培養(yǎng)基、胎牛血清及2.5 g·L-1胰蛋白酶(美國Gibco公司)；青、鏈霉素(索萊寶公司)；3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)(S2767)、CY-09(S5774)(美國Selleck公司)； MTT(美國Sigma公司)；二甲基亞砜(DMSO)(美國Amresco公司)；Transwell小室、Matrigel(美國BD公司)；兔多抗NLRP3(相對分子質量為118 000，NBP2-12446，美國Novus公司)；兔單抗ASC(相對分子質量為22 000，ab155970)、兔單抗pro Caspase-1 + p10 + p12(相對分子質量為35 000/45 000，ab179515)、兔單抗Beclin-1(相對分子質量為52 000，ab207612)(英國Abcam公司)；兔多抗LC3-II/LC3-I(相對分子質量為14 000/16 000，AF5402，美國Affinity公司)；辣根過氧化酶標記羊抗兔二抗(BA1054，武漢博士德生物工程有限公司)；兔多抗GAPDH(AB-P-R 001，杭州賢至生物有限公司)；Ad-mCherry-GFP-LC3B (碧云天公司，C3011-1mL)。CO2恒溫培養(yǎng)箱(日本Sanyo公司，型號MCO-15AC)；全自動酶標儀(美國Thermo scientific公司，型號Multiskan MK3)；倒置顯微鏡(日本Olympus公司，型號IX51)；激光共聚焦顯微鏡(日本Nikon公司，型號C2)。

1.2 方法

1.2.1 細胞分組及處理將凍存的HRMEC解凍后離心收集，用含體積分數(shù)10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素的M199培養(yǎng)基懸浮細胞，接種至培養(yǎng)皿中，在37 ℃、含體積分數(shù)5%CO2孵箱中培養(yǎng)。2.5 g·L-1胰蛋白酶消化后收集細胞，用培養(yǎng)基制成單細胞懸液，傳代培養(yǎng)。取生長狀態(tài)良好的細胞制備單細胞懸液，計數(shù)后按照每孔500×103個接種于6孔板，貼壁后將細胞分為高糖組、3-MA+高糖組及CY-09+高糖組，其中高糖組在M199培養(yǎng)基中加入30 mmol·L-1葡萄糖溶液處理48 h；3-MA+高糖組細胞先用5 mmol·L-1的 3-MA 處理2 h，然后更換為含30 mmol·L-1葡萄糖溶液的培養(yǎng)基處理48 h；CY-09+高糖組細胞先用10 mmol·L-1的CY-09處理2 h，然后更換為含30 mmol·L-1葡萄糖溶液的培養(yǎng)基處理48 h。

1.2.2 MTT法檢測細胞活力取生長狀態(tài)良好的HRMEC制備單細胞懸液，調整細胞密度至50×103個·mL-1，將細胞懸液接種至96孔板，按1.2.1分組處理細胞，每組設置3個復孔，每孔100 μL，并設置空白孔，然后每孔加入10 μL MTT，37 ℃孵育4 h，棄去上清液，每孔加入150 μL DMSO，低速振蕩10 min；酶標儀測定各孔在568 nm處的光密度(D)值。計算細胞活力:細胞活力(%)= (D實驗組-D對照組)/(D對照組-D空白組)×100%。其中，空白組僅含有培養(yǎng)基而沒有接種細胞，對照組為用M199培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)的HRMEC。

1.2.3 Transwell檢測細胞的遷移能力取生長狀態(tài)良好的細胞，按1.2.1分組處理后，2.5 g·L-1胰蛋白酶消化后收集細胞，離心，用無血清培養(yǎng)基重懸細胞，將細胞濃度調整至200×103個·mL-1。在24孔板中加入800 μL含體積分數(shù)10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素的M199培養(yǎng)基，然后放入Transwell小室，每組設置3個復孔，在上室加入200 μL各組細胞懸液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。PBS清洗小室，然后用體積分數(shù)70%冰乙醇溶液固定細胞1 h，5 g·L-1結晶紫染液染色20 min，清洗后擦去未穿膜的上室內細胞，封片后在顯微鏡下拍照，隨機選擇 3 個放大200倍視野拍照，計數(shù)平均遷移細胞數(shù)。

1.2.4 Matrigel檢測細胞的管腔形成能力4 ℃條件下融化Matrigel，用預冷的移液器槍頭按每孔200 μL加至預冷的24孔板，37 ℃孵育30 min。按1.2.1分組處理細胞后，以每孔200×103個·mL-1接種于鋪好膠的24孔板內，37 ℃、體積分數(shù)5%CO2條件下培養(yǎng)，當管腔形成時(6～8 h，≥3個細胞/分支)立即在顯微鏡下拍照，隨機選取3 個放大 100 倍的視野，用 Image J軟件計數(shù)平均管腔形成數(shù)。

1.2.5 Western blot檢測各種蛋白表達收集各組細胞，裂解后離心提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。取40 μg總蛋白上樣，在SDS-PAGE凝膠上電泳，轉至PVDF膜，用含50 g·L-1脫脂奶粉的TBST溶液室溫浸泡PVDF膜，搖床上封閉2 h。滴加相應一抗(NLRP3、ASC、Caspase-1、LC3及GAPDH稀釋比例均為11000，Beclin-1稀釋比例為12000)，4 ℃孵育過夜。TBST溶液充分洗膜后加入辣根過氧化酶標記羊抗兔二抗(150 000)，37 ℃孵育2 h，ECL顯色，曝光后掃描膠片，BandScan軟件分析膠片灰度值，以GAPDH為內參照，計算NLRP3、ASC、Caspase-1、LC3-II/LC3-I比值及Beclin-1蛋白相對表達量，每組重復測量3次，取平均值。

1.2.6 轉染Ad-mCherry-GFP-LC3B雙熒光標記腺病毒檢測細胞中自噬流的情況Ad-mCherry-GFP-LC3B是一種可以表達mCherry-GFP-LC3B融合蛋白的腺病毒，感染后能夠在靶細胞中有效表達紅色熒光蛋白mCherry、綠色熒光蛋白(GFP)和LC3B的融合蛋白，呈現(xiàn)明亮的紅色和綠色熒光，可以非常有效地追蹤自噬過程。無菌鑷子從體積分數(shù)75%酒精中取出單張細胞爬片，于酒精燈火焰上過火，酒精蒸發(fā)完全后放入12孔板中；分別加入按照1.2.1分組處理后的細胞，同時每孔加入50 μL Ad-mCherry-GFP-LC3B(滴度100×106pfu)腺病毒，培養(yǎng)48 h后在激光共聚焦顯微鏡下觀察自噬流的情況。

2 結果

2.1 各組細胞活力比較MTT檢測結果顯示，高糖組、3-MA+高糖組和CY-09+高糖組細胞活力分別為(153.56±1.46)%、(115.33±3.26)%和(116.10±1.66)%，各組總體比較差異有統(tǒng)計學意義(F=276.63，P<0.01)。與高糖組比較，3-MA+高糖組和CY-09+高糖組的細胞活力均明顯降低(均為P<0.001)，3-MA+高糖組與CY-09+高糖組細胞活力相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.2 各組細胞遷移數(shù)比較Transwell檢測結果顯示，高糖組、3-MA+高糖組和CY-09+高糖組細胞遷移數(shù)分別為(117.33±7.23)個、(70.00±2.00)個和(71.67±2.52)個，各組總體比較差異有統(tǒng)計學意義(F=103.61，P<0.01)。與高糖組比較，3-MA+高糖組和CY-09+高糖組細胞遷移數(shù)均明顯減少(均為P<0.001)，3-MA+高糖組與CY-09+高糖組細胞遷移數(shù)相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖1。

圖1 倒置顯微鏡下各組細胞遷移情況 A：高糖組；B：3-MA+高糖組；C：CY-09+高糖組

2.3 各組細胞管腔形成數(shù)比較在基質膠中培養(yǎng) 6～8 h，各組細胞均有明顯的管腔樣結構形成，其中，高糖組、3-MA+高糖組和CY-09+高糖組細胞管腔形成數(shù)分別為(88.33±2.08)個、(61.33±1.53)個和(62.00±3.00)個，各組總體比較差異有統(tǒng)計學意義(F=136.23，P<0.01)。與高糖組比較，3-MA+高糖組和CY-09+高糖組細胞的管腔形成數(shù)均明顯減少(均為P<0.001)，3-MA+高糖組與CY-09+高糖組細胞管腔形成數(shù)相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖2。

圖2 倒置顯微鏡下各組細胞管腔形成情況 A：高糖組；B：3-MA+高糖組；C：CY-09+高糖組

2.4 各組細胞中各蛋白相對表達量Western blot檢測結果顯示，與高糖組比較，3-MA+高糖組和CY-09+高糖組細胞中NLRP3炎癥小體及自噬信號通路均受到明顯抑制，NLRP3、ASC、Caspase-1、Beclin-1蛋白相對表達量和LC3-II/LC3-I比值均顯著降低(均為P<0.05)。與3-MA+高糖組相比，CY-09+高糖組中NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白相對表達量均顯著減少，而LC3-II/LC3-I比值和Beclin-1的蛋白相對表達量均顯著增多(均為P<0.05)。見圖3和表1。

圖3 各組細胞不同蛋白表達情況 A:NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白表達；B：LC3-I、LC3-II、Beclin-1蛋白表達

表1 各組HRMEC中炎癥小體和自噬蛋白相對表達量

2.5 各組細胞中自噬流的比較自噬流是檢測自噬活力的可靠指標，在非自噬的情況下，mCherry-GFP-LC3B以彌散的黃色熒光(mCherry和GFP的綜合效果)形式存在于細胞質中；而在自噬的情況下，mCherry-GFP-LC3B則聚集在自噬體膜上，以黃色斑點的形式表現(xiàn)出來；當自噬體與溶酶體融合后，因GFP熒光的部分淬滅而以紅色斑點的形式表現(xiàn)出來。與高糖組相比，3-MA+高糖組及CY-09+高糖組細胞內黃色(自噬小體)和紅色熒光小點(自噬溶酶體)均明顯減少，以紅色熒光小點減少最為顯著(圖4)。

圖4 各組細胞自噬流情況對比 GFP：綠色熒光；Hoechst33342：核；mCherry：紅色熒光；Merge：融合

3 討論

高血糖在糖尿病的微血管損害中發(fā)揮重要作用?，F(xiàn)有研究已證實，高血糖引起的血管損傷涉及多種代謝途徑，包括多元醇途徑、晚期糖基化終末產(chǎn)物積累、蛋白激酶C途徑和己糖胺途徑等[11]。在DR的病理過程中，高糖首先帶來視網(wǎng)膜血管擴張和血流改變[12]，隨后引發(fā)周細胞、內皮細胞凋亡和基底膜增厚。周細胞為毛細血管提供重要的結構支持，它們的缺失致使毛細血管壁局部外突，即形成視網(wǎng)膜微動脈瘤；內皮細胞凋亡和基底膜增厚導致血-視網(wǎng)膜屏障的損害[13-14]，周細胞和內皮細胞丟失導致毛細血管閉塞和缺血，從而帶來缺氧誘導因子1(HIF-1)/血管內皮生長因子(VEGF)信號通路的激活，最終導致內皮細胞增殖，引起視網(wǎng)膜新生血管形成[15]。本研究在體外利用廣泛采用的高糖濃度模擬DR的病理環(huán)境，觀察了與DR密切關聯(lián)的NLRP3炎癥小體與自噬在HRMEC活性、遷移和管腔形成過程中的作用。與既往研究結果一致，高糖條件下，HRMEC具有較強的血管形成能力[16-17]。

大量研究已證實，炎癥在DR的病理機制中也扮演重要角色。在糖尿病動物模型和不同分期DR患者中均廣泛發(fā)現(xiàn)有慢性低度炎癥存在，如患者血漿和眼內液中的多種炎性因子和趨化因子明顯增多[18-19]。NLRP3是在2002年發(fā)現(xiàn)的一種前炎癥信號復合體，除了病原體和其他細胞外的威脅外，它們還可被各種內源性危險信號激活，參與多種疾病的發(fā)生，因此，近年來作為重要的治療靶點備受關注[20-21]。在細胞和DR的動物模型中發(fā)現(xiàn)，NLRP3炎癥小體信號通路的關鍵分子NLRP3、ASC、Caspase-1及IL-1β與細胞凋亡、血管通透性增加、視網(wǎng)膜厚度和功能降低有關[3,22]，進而在臨床患者中發(fā)現(xiàn)，DR患者外周血單核細胞的NLRP3、ASC和Caspase-1 mRNA和蛋白表達均明顯高于正常人，PDR患眼的視網(wǎng)膜纖維血管膜中NLRP3、ASC的表達也明顯高于正常人[23]。DR患者玻璃體內存在NLRP3炎癥小體，在PDR患眼中，Caspase-1 和 IL-18伴隨VEGF均明顯增多；與未發(fā)生視網(wǎng)膜脫離的患者相比，伴有牽拉性視網(wǎng)膜脫離的PDR患眼內NLRP3的水平更高，故認為NLRP3炎癥小體參與了PDR的病理過程[4]。與這些研究相符，本研究也發(fā)現(xiàn)，高糖條件下HRMEC表達較高水平的NLRP3炎癥小體，即NLRP3、ASC、Caspase-1的蛋白相對表達量較高。

自噬是從酵母到人體內的一種細胞遺傳性的程序化機制，在維持細胞存活、更新、物質再利用和內環(huán)境穩(wěn)定等機體生理過程中發(fā)揮重要作用[24]。自噬是目前生物醫(yī)學領域研究的熱點之一，廣泛參與各種生理和病理過程。LC3是酵母自噬關鍵蛋白ATG8在哺乳動物中的同源蛋白，LC3蛋白家族包括LC3A、LC3B、LC3C和GABARAP等亞家族，其中LC3B被認為是細胞自噬信號通路最為關鍵的標志性蛋白。LC3有兩種亞型，當自噬激活時，位于細胞質內的LC3-Ⅰ轉變?yōu)樽允审w膜上的LC3-Ⅱ，通過檢測LC3-Ⅱ/ LC3-Ⅰ比值，并配合自噬抑制劑(如3-MA)干預可以判斷自噬活性[25]。Beclin-1是第一個被鑒定的哺乳動物自噬蛋白，對自噬過程至關重要[26]。mCherry-GFP-LC3B串聯(lián)熒光蛋白腺病毒通過瞬時高效感染細胞，可以對自噬流進行實時監(jiān)測[27]。大量研究已證實，高糖能激活自噬，自噬功能障礙參與了DR及視網(wǎng)膜新生血管的發(fā)病機制[6,16,28]。自噬是一個高度動態(tài)的多步驟過程，需要結合多種方法準確檢測自噬體和整個自噬流的過程來判斷自噬的變化。本研究利用Western blot檢測LC3-Ⅱ/Ⅰ比值、Beclin-1的蛋白表達以及mCherry-GFP-LC3B腺病毒轉染HRMEC，發(fā)現(xiàn)同既往研究結果一致，高糖條件下細胞自噬處于較高水平[17]。

由于多因素疾病的復雜性，任何致病因素與DR之間的聯(lián)系都值得懷疑。因此，本研究探討了NLRP3炎癥小體與自噬在DR發(fā)病機制中的相互作用。結果發(fā)現(xiàn)，高糖條件下3-MA和CY-09預處理均可顯著降低HRMEC細胞活力，抑制細胞遷移和管腔形成，提示激活NLRP3炎癥小體與自噬均可促進DR的視網(wǎng)膜新生血管形成；給予自噬抑制劑3-MA處理后，HRMEC的NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白表達均明顯降低，給予NLRP3炎癥小體抑制劑CY-09處理時，自噬標志蛋白LC3-Ⅱ/ LC3-Ⅰ比值和Beclin-1的蛋白表達均明顯降低，同時自噬流也有不同程度的抑制，提示NLRP3炎癥小體與自噬在高糖條件下互相正向調控。在動物模型和人糖尿病腎病活檢組織中均發(fā)現(xiàn)，激活的NLRP3炎癥小體負向調控足細胞自噬，抑制高糖條件下的NLRP3可以減少細胞損傷[8]。在糖尿病大鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，激活自噬可以抑制NLRP3炎癥小體，從而減輕其心肌缺血-再灌注損傷[7]。以往許多研究表明，自噬可以抑制NLRP3炎癥小體，但近年來的研究發(fā)現(xiàn)，自噬在某些情況下也可以促進NLRP3炎癥小體激活[29]，而NLRP3炎癥小體反過來又會影響自噬[30]。本研究結果與以上這些研究發(fā)現(xiàn)存在異同，可能是由于NLRP3炎癥小體與自噬之間的雙向關系非常復雜，由于不同疾病條件的變化，它們之間可能會產(chǎn)生完全相反的影響。

總之，本研究結果初步提示NLRP3炎癥小體與自噬相互調控，共同參與了DR的視網(wǎng)膜新生血管形成，但二者之間互相影響的調控機制仍需進一步研究。此外，細胞模型不能完全代表體內的真實病理情況，在后續(xù)研究中需要采用DR動物模型及患者組織標本對二者的關系進行深入探討。