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    補精益視片對大鼠慢性高眼壓模型視神經(jīng)PI3K/Akt通路MDM2、p53表達的影響

    2020-08-10 01:56:52劉歡李翔劉紅佶袁銘悅李祥玉
    中醫(yī)眼耳鼻喉雜志 2020年2期
    關(guān)鍵詞:光密度藥組視神經(jīng)

    劉歡 李翔 劉紅佶 袁銘悅 李祥玉

    青光眼是繼白內(nèi)障后的世界第二大致盲性眼病[1],高眼壓為主要的危險因素,將眼壓控制到靶眼壓范圍內(nèi)是目前青光眼的主要治療措施,可即使眼壓降至正常范圍內(nèi),視神經(jīng)的損傷仍在繼續(xù)發(fā)展,最終致視力喪失[2]。而且,臨床上患者首次就診時,病情常常均已至中晚期、視神經(jīng)已明顯損害。因此如何保護視神經(jīng)已成為青光眼研究的重點和難點。本實驗采用烙閉上鞏膜靜脈法[3]建立SD大鼠慢性EIOP模型,觀察補精益視片對SD大鼠慢性EIOP模型視神經(jīng)PI3K/Akt通路MDM2、p53表達的干預作用,探討補精益視片對SD大鼠慢性EIOP模型視神經(jīng)損害的保護機制,為補精益視片治療青光眼視神經(jīng)損害提供實驗依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1材料

    健康清潔級SD大鼠30只,8~12周齡,體重160~200g,檢查無外眼部疾病,瞳孔對光反射、眼壓正常,無歪頸,由成都達碩實驗動物有限公司提供。補精益視片(批號:20170328),購自成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院;MDM2(批號:BIO11033)、p53(批號:BIO14497)抗體試劑盒,均由 BeacomBio公司提供;復合固定液由成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院病理科提供。

    1.2方法

    1.2.1實驗分組及模型建立 30只SD大鼠隨機分為對照組、模型組和給藥組,每組10只。模型組與給藥組予烙閉大鼠右眼3支上鞏膜靜脈造模處理,對照組予暴露鞏膜上靜脈但不行烙閉處理(為假烙閉)。具體方法如下:大鼠稱重、固定、麻醉及消毒鋪巾后,在上穹隆角膜緣剪開球結(jié)膜180°,暴露鞏膜靜脈,用眼科手術(shù)烙閉器烙閉角鞏膜緣后3~4mm近赤道部約10、12和1鐘位的3支上鞏膜靜脈血管,烙閉后近角膜緣端的血管充盈擴張,遠角膜緣端的血管血流消失表示烙閉成功,術(shù)畢術(shù)眼涂金霉素眼膏,待大鼠蘇醒后放回籠內(nèi),氯霉素眼液每天2次滴眼,連續(xù)1周。

    1.2.2給藥方法 造模后3天給藥,對照組、模型組予3mL生理鹽水灌胃;給藥組以1.8 g·kg-1·d-1的標準(相當于成人劑量的20倍)予補精益視片混懸液3ml灌胃。每天同一時間灌胃1次,連續(xù)8周。每2周稱大鼠體重1次,根據(jù)體重調(diào)整給藥量。

    1.3IOP測量

    用TONO-PEN眼壓計每日固定時間測量IOP。測量3組大鼠造模前、造模后即刻、造模后8周IOP。

    1.4取材及固定

    造模8周后以頸椎脫臼法處死大鼠,取眼球及視神經(jīng)在內(nèi)的組織塊,放置于中性甲醛液中固定72小時后,標本采用梯度酒精脫水,石蠟包埋,選取球后2~4mm的視神經(jīng),做常規(guī)4μm連續(xù)切片,烘干備用。

    1.5免疫組織化學法檢測視神經(jīng)MDM2、p53的表達 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水,過氧化氫室溫孵育10min,磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)浸泡5分鐘;10%的正常山羊血清(PBS稀釋)封閉,室溫孵育10min,滴加適當比例稀釋的MDM2或p53,37℃孵育2h,PBS洗滌;滴加生物素標記二抗工作液,37℃孵育30min,PBS洗滌;滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液,37℃孵育30 min,PBS洗滌;DAB顯色,脫水、透明、封片,顯微鏡觀察陽性表達為棕黃色染色。每張切片隨機取5個不同視野,用Mias-2000型圖形圖像分析儀測量視神經(jīng)MDM2和p53陽性染色總面積及積分光密度、平均光密度的均值,作為該玻片的測量值。

    1.6統(tǒng)計學方法

    2 結(jié)果

    2.1IOP 情況

    各組大鼠造模前、造模后即刻及造模后8周IOP情況見表1。由表1可見:造模前3組眼壓比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。模型組和給藥組的造模后即刻、造模后8周均較造模前眼壓高,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。模型組造模后8周與造模后即刻眼壓比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),而給藥組造模后8周較造模后即刻眼壓低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

    表1 造模前、造模后即刻及造模后8周各組大鼠眼壓值統(tǒng)計表(單位:

    2.2補精益視片對大鼠慢性EIOP模型視神經(jīng)PI3K/Akt通路MDM2表達的影響

    各組視神經(jīng)MDM2表達的總面積、積分光密度、平均光密度結(jié)果見表2、圖1。由上可知,造模后模型組和給藥組視神經(jīng)MDM2表達均下降,兩組MDM2陽性染色總面積、積分光密度及平均光密度較對照組低,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。模型組MDM2陽性染色總面積、積分光密度及平均光密度與給藥組相比,明顯偏低,差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

    表2 各組視神經(jīng)MDM2的表達情況

    圖1 各組視神經(jīng)MDM2免疫組化陽性染色(×400)。A:對照組; B:模型組; C:給藥組

    2.3補精益視片對大鼠慢性EIOP模型視神經(jīng)PI3K/Akt通路p53表達的影響

    各組視神經(jīng)免疫組化檢測p53表達的總面積、積分光密度、平均光密度結(jié)果見表3、圖2。由上可知,造模后模型組和給藥組視神經(jīng)p53均上升,兩組p53陽性染色總面積、積分光密度及平均光密度均較對照組高,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。模型組p53陽性染色總面積、積分光密度及平均光密度與給藥組相比,明顯偏高,差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

    表3 各組視神經(jīng)p53的表達情況

    圖2 各組視神經(jīng)p53免疫組化陽性染色(×400)。A:對照組; B:模型組; C:給藥組

    3 討論

    PI3K/Akt信號通路為近年來基因調(diào)控細胞凋亡的研究熱點。PI3K/Akt信號通路有促進神經(jīng)元存活的作用[4-6]。國外已有實驗證明PI3K/Akt信號通路對RGCs的凋亡過程起抑制作用[7],但具體作用機理仍不清楚。研究發(fā)現(xiàn),PI3K/Akt信號通路對于神經(jīng)細胞的存活有著特殊的重要性。我們前期對大鼠慢性高眼壓模型視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導通路中p-Akt的表達進行了分析,證實了通過上調(diào)p-Akt的表達可修復和保護RGCs[8]。MDM2、p53亦為PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導通路中的相關(guān)因子,PI3K為整個信號通路的起點,PI3K被激活后,激活后的產(chǎn)物與Akt的PH結(jié)構(gòu)域結(jié)合,實現(xiàn)激活Akt,激活后的Akt使MDM2的第166位和188位絲氨酸磷酸化,增加MDM2蛋白的穩(wěn)定性,促進p53降解,從而對細胞發(fā)揮作用[5]。MDM2是對細胞生長有調(diào)節(jié)作用的癌基因,對細胞有增強生存活力、延長生存期及促進增生等作用[9]。p53是人體重要的腫瘤抑制因子,具有調(diào)控細胞DNA修復和誘導細胞衰老、自噬、凋亡等作用[10]。MDM2和p53在細胞內(nèi)互相制衡,MDM2抑制p53轉(zhuǎn)錄活性,促進p53降解;p53翻譯MDM2,激活MDM2基因轉(zhuǎn)錄,二者形成負反饋調(diào)節(jié)。病理情況下,當MDM2減少,不能降解或抑制p53轉(zhuǎn)錄活性,使p53在細胞內(nèi)的含量增加,導致細胞周期停滯或凋亡。

    青光眼歸屬于中醫(yī)的“五風內(nèi)障”,多由風火痰虛瘀等導致氣血失和、氣滯血瘀、玄府閉塞、神水瘀積,日久肝腎兩虧、神光衰微甚至泯滅,不睹三光而成青盲(青光眼視神經(jīng)損害),故肝腎不足、脈絡(luò)瘀滯為青光眼視神經(jīng)損害的主要病機。補精益視片(原名益視片),是中醫(yī)眼科名家陳達夫據(jù)古方“駐景丸”加減化裁而成,由菟絲子、楮實子、枸杞子、五味子、茺蔚子、車前子、丹參、三七、青皮、木瓜組成,具有滋養(yǎng)肝腎、活血通絡(luò)的功效,為補腎活血法的代表方?,F(xiàn)代藥理研究表明補精益視片中多種藥物均含各種微量元素、氨基酸等成分,能調(diào)節(jié)免疫,保持機體內(nèi)環(huán)境的平衡[11]。前期研究亦證實:補精益視片能輕度降低眼壓[12],保護SD大鼠慢性高眼壓模型的RGCs[13],抑制感光細胞凋亡,修復視網(wǎng)膜和提高視力[14]等。

    本研究通過觀察補精益視片對SD大鼠慢性EIOP模型視神經(jīng)PI3K/Akt通路MDM2、p53表達的干預作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn),補精益視片能輕度降低SD大鼠慢性EIOP模型的眼壓,上調(diào)視神經(jīng)PI3K/Akt通路凋亡抑制因子MDM2、下調(diào)凋亡促進因子p53的表達,推測補精益視片保護青光眼視神經(jīng)的作用機制可能是通過降眼壓及調(diào)控PI3K/Akt通路的多個相關(guān)因子來實現(xiàn)的。

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