Homer1基因真核表達重組質(zhì)粒構(gòu)建及HT22細胞轉(zhuǎn)染鑒定

曹敏，張曉敏，王培昌，劉靜

首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院，北京100053

Homer1基因定位于人染色體5q14.2，其編碼蛋白是一類突觸后支架蛋白，主要由短類型Homer1a和長類型Homer1b/c組成[1]。Homer1a含有一個高度保守的激活/血管擴張刺激磷蛋白同族體1(EVH1)同源結(jié)構(gòu)域，而Homer1b/c不僅含有EVH1同源結(jié)構(gòu)域，C末端還存在卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域和兩個亮氨酸拉鏈基序[2]。Homer1a C末端缺乏多聚化序列，不具備長類型Homer1b/c的功能，但能競爭性結(jié)合Homer1b/c相關結(jié)合蛋白，從而起到負性調(diào)節(jié)作用[3]。Homer1蛋白主要分布于腦、心肌、骨骼肌等組織[4]，能夠參與突觸形成、神經(jīng)元信號傳導、調(diào)節(jié)細胞內(nèi)外Ca2+水平等[5]。有研究證實，Homer1蛋白在創(chuàng)傷性腦損傷(TBI)、阿爾茨海默病(AD)、抑郁癥等疾病中發(fā)揮重要作用[6]。全基因組關聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)，重度抑郁癥患者存在Homer1基因變異[7]；敲除Homer1基因的小鼠可表現(xiàn)出與抑郁癥小鼠相似的行為，這可能與Homer1蛋白與腦內(nèi)代謝型谷氨酸受體(mGluRs)信號通路有關[8]。在AD小鼠腦組織中發(fā)現(xiàn)Homer1a表達下降，同時發(fā)現(xiàn)在AD小鼠腦組織中Aβ寡聚體可通過與mGluRs5、Homer1蛋白結(jié)合，影響神經(jīng)元內(nèi)外Ca2+水平，從而降低神經(jīng)元興奮性[9]。Homer1a是一種保護性蛋白，TBI發(fā)生后其表達迅速升高，并通過調(diào)節(jié)mGluRs-ERK信號通路，減輕神經(jīng)元水腫，改善神經(jīng)系統(tǒng)功能[10]。Homer1蛋白在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用被廣泛研究，但Homer1蛋白在AD中對Aβ清除的影響及其對神經(jīng)元的保護作用缺乏深入研究。2019年1～8月，本研究構(gòu)建了Homer1基因真核表達重組質(zhì)粒，并在HT22細胞中轉(zhuǎn)染和鑒定，為研究Homer1蛋白對腦內(nèi)Aβ清除的影響及在AD發(fā)病機制中的作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 小鼠海馬神經(jīng)元細胞系HT22(以下稱HT22細胞)，購自賽百慷(上海)生物技術(shù)股份有限公司；大腸桿菌TOP10感受態(tài)細胞，購自天根生化科技(北京)有限公司。APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠，雌雄不限，9月齡，體質(zhì)量25～35 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司。熒光定量PCR儀，購自美國ABI公司。真核表達載體p3×FLAG-CMV-10，由中國科學院生物物理研究所提供；Homer1引物序列，由生工生物工程(上海)股份有限公司設計合成。限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ、EcoRⅠ，購自美國NEB公司。5×All-In-One RT Master Mix，購自加拿大ABM公司；難轉(zhuǎn)染細胞轉(zhuǎn)染試劑jetOPTIMUS，購自法國Polyplus-transfection公司；DNA聚合酶Phanta?Max Super-Fidelity DNA Polymerase，購自南京諾唯贊生物科技有限公司；兔源Flag一抗，購自美國Sigma公司；HRP標記的山羊抗兔IgG二抗，購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 Homer1基因真核表達重組質(zhì)粒構(gòu)建與鑒定

1.2.1 Homer1基因真核表達重組質(zhì)粒構(gòu)建 取APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠海馬組織約50 mg，采用TRIzol法提取組織總RNA，經(jīng)紫外分光光度計鑒定，提取的總RNA濃度和純度合格，可用于后續(xù)實驗。按5×All-In-One RT Master Mix說明，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄條件：25 ℃ 10 min，42 ℃ 15 min，85 ℃ 5 min。依據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中鼠Homer1基因mRNA的序列(NM_001284189.2)，設計巢式PCR引物，并在引物兩端加入酶切位點EcoRⅠ、HindⅢ。第1對引物序列：上游引物5′-CCCAAGCTTATGGGGGAGCAACCTATC-3′，下游引物5′-GGAATTCTTAGCTGCATTCCAGTAGC-3′；第2對引物序列：上游引物5′-CCCAAGCTTATGGGGGAGCAACCTATC-3′，下游引物5′-GGAATTCTTAGCTGCATTCCAGTAGC-3′。按Phanta?Max Super-Fidelity DNA Polymerase說明，以這兩對引物為cDNA模板進行PCR擴增。PCR擴增體系共50 μL：2×Phanta Max Buffer 25 μL，dNTP 1 μL，上下游引物各2 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O補足至50 μL；反應條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s共35個循環(huán)，最后72 ℃ 10 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后，用DNA凝膠回收試劑盒回收，然后用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、Hind Ⅲ分別對Homer1基因擴增產(chǎn)物和p3×FLAG-CMV-10載體進行雙酶切。Homer1基因擴增產(chǎn)物于37 ℃酶切2 h，p3×FLAG-CMV-10載體于37 ℃酶切4～6 h。將雙酶切后的目的基因Homer1與p3×FLAG-CMV-10載體按3∶1混合，加入T4 DNA連接酶，室溫連接1 h。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細胞，37 ℃ 200 r/min搖菌45 min，將轉(zhuǎn)化后菌液涂布于含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基，37 ℃孵育過夜。

1.2.2 Homer1基因真核表達重組質(zhì)粒酶切鑒定 從LB固體培養(yǎng)基上挑取4～6個單克隆菌落，分別接種于10 mL含氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基，37 ℃ 200 r/min搖菌12～14 h，按質(zhì)粒小提試劑盒說明提取質(zhì)粒。將提取的質(zhì)粒收集至離心管中，用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、Hind Ⅲ進行雙酶切。酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，利用凝膠成像系統(tǒng)在紫外燈下觀察DNA條帶，根據(jù)DNA條帶大小判斷真核表達重組質(zhì)粒是否構(gòu)建成功。

1.2.3 Homer1基因真核表達重組質(zhì)粒測序 構(gòu)建成功的Homer1基因真核表達重組質(zhì)粒送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序，并將測序結(jié)果與GenBank中Homer1基因的cDNA序列進行比對。

1.3 Homer1基因真核表達重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染與鑒定

1.3.1 Homer1基因真核表達重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HT22細胞 取HT22細胞約1×106個，接種于含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2的恒溫細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每2天更換1次培養(yǎng)基。當細胞生長融合90%以上時，0.25%胰蛋白酶消化，收集細胞并接種于6孔板，于37 ℃、5% CO2的恒溫細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。隨機將細胞分為p3×FLAG-CMV-10-Homer1重組質(zhì)粒組、p3×FLAG-CMV-10空載體組、空白對照組，每組設3個復孔。當細胞生長融合60%～70%時，根據(jù)難轉(zhuǎn)染細胞轉(zhuǎn)染試劑jetOPTIMUS說明，p3×FLAG-CMV-10-Homer1重組質(zhì)粒組加入p3×FLAG-CMV-10-Homer1重組質(zhì)粒2 μg、jetOPTIMUS Buffer 200 μL、jetOPTIMUS reagent 2 μL，p3×FLAG-CMV-10空載體組加入p3×FLAG-CMV-10空載體2 μg、jetOPTIMUS Buffer 200 μL、jetOPTIMUS reagent 2 μL，空白對照組加入jetOPTIMUS Buffer 200 μL、jetOPTIMUS reagent 2 μL，37 ℃、5% CO2的恒溫細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)5～6 h，棄掉原培養(yǎng)基，加入含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.3.2 轉(zhuǎn)染Homer1基因真核表達重組質(zhì)粒的HT22細胞鑒定 收集上述轉(zhuǎn)染后的HT22細胞，RIPA裂解提取細胞總蛋白，經(jīng)BCA法蛋白定量合格后，加入Loading上樣緩沖液，100 ℃水浴變性。取變性蛋白40 μg，SDS-PAGE(10%分離膠、5%濃縮膠)分離蛋白。電泳結(jié)束后，采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)印至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，分別加入Flag一抗(稀釋比1∶1 000)、GAPDH一抗(稀釋比1∶5 000)，4 ℃孵育過夜。次日，分別加入HRP標記的山羊抗兔或山羊抗小鼠二抗(稀釋比1∶10 000)，室溫孵育1 h，ECL發(fā)光，暗室中曝光、顯影。Image J軟件分析各蛋白電泳條帶灰度值。以目的蛋白電泳條帶灰度值與內(nèi)參蛋白電泳條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 Homer1基因真核表達重組質(zhì)粒構(gòu)建結(jié)果 含酶切位點的Homer1基因序列經(jīng)PCR擴增和1%瓊脂糖凝膠電泳分離發(fā)現(xiàn)，擴增產(chǎn)物片段大小約為1 064 bp，與目的基因片段大小一致。

2.2 Homer1基因真核表達重組質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果 利用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、Hind Ⅲ對重組質(zhì)粒p3×FLAG-CMV-10-Homer1進行雙酶切，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，在凝膠成像系統(tǒng)中紫外燈下可見1 064 bp處的Homer1目的片段和6 200 bp處的p3×FLAG-CMV-10載體片段。

2.3 Homer1基因真核表達重組質(zhì)粒測序結(jié)果 將酶切鑒定陽性的Homer1基因真核表達重組質(zhì)粒送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序，測序結(jié)果與在GenBank中檢索的Homer1基因cDNA序列進行比對，證實Homer1基因中插入了p3×FLAG-CMV-10載體。見圖1。

圖1 Homer1基因真核表達重組質(zhì)粒序列與GenBank中檢索的Homer1基因cDNA序列比對結(jié)果

2.4 各組Homer1蛋白表達比較 p3×FLAG-CMV-10-Homer1重組質(zhì)粒組、p3×FLAG-CMV-10空載體組、空白對照組Homer1蛋白相對表達量分別為4.91±0.87、1.27±0.42、0.80±0.28。p3×FLAG-CMV-10-Homer1重組質(zhì)粒組Homer1蛋白相對表達量明顯高于p3×FLAG-CMV-10空載體組、空白對照組(P均<0.05)，而p3×FLAG-CMV-10空載體組與空白對照組Homer1蛋白相對表達量比較P>0.05。

3 討論

Homer1蛋白是一種常見的骨架蛋白，主要由短類型Homer1a和長類型Homer1b/c組成。Homer1蛋白廣泛存在于腦組織、心肌和骨骼肌中，其在神經(jīng)系統(tǒng)中作為突觸后支架蛋白被廣泛研究[11]。Homer1蛋白可與多種鈣離子通道蛋白結(jié)合，如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣通道蛋白、三磷酸肌醇受體、mGluRs等[12]，能夠改變細胞內(nèi)外Ca2+水平，調(diào)節(jié)突觸膜電位，改變突觸可塑性。研究發(fā)現(xiàn)，谷氨酸過度釋放能夠使神經(jīng)元興奮過度，可能會導致神經(jīng)元死亡，而Homer1a蛋白通過降低Ca2+內(nèi)流，減少氧化應激、降低N-甲基-D天冬氨酸(NMDA)受體下游信號通路活性、改變NMDA受體在細胞膜上的分布，從而對神經(jīng)元起到保護作用[13]。

AD的主要病理改變是神經(jīng)元細胞內(nèi)Aβ沉積和神經(jīng)元細胞外Tau蛋白高度磷酸化形成的神經(jīng)纖維纏結(jié)。Aβ沉積和神經(jīng)纖維纏結(jié)能夠加速神經(jīng)元不可逆性死亡，AD患者逐漸出現(xiàn)記憶力下降、失語、認知功能障礙等，最終發(fā)展為癡呆[14]。目前對AD藥物治療的主要研究方向集中在如何清除腦內(nèi)Aβ沉積，減少神經(jīng)元死亡。最近有研究對AD小鼠腹腔長期注射Ca2+通道抑制劑1，4-二氫吡啶衍生物AP-12后發(fā)現(xiàn)，小鼠空間學習記憶能力顯著改善，其大腦扣帶回和海馬中發(fā)現(xiàn)谷氨酸脫羧酶67和囊泡型γ氨基丁酸轉(zhuǎn)運體表達增加，雖然海馬內(nèi)Homer1表達無明顯變化，但扣帶回Homer1表達明顯升高[15]。這為AD的治療提供了一個新的方向，即利用Ca2+通道抑制劑阻斷大腦Ca2+通道，調(diào)節(jié)突觸可塑性，進而改善記憶功能。

本研究首先構(gòu)建了Homer1基因真核表達重組質(zhì)粒，含酶切位點的Homer1基因序列經(jīng)PCR擴增和1%瓊脂糖凝膠電泳分離發(fā)現(xiàn)，擴增產(chǎn)物片段大小與目的基因片段大小一致；經(jīng)雙酶切和1%瓊脂糖凝膠電泳分離，在凝膠成像系統(tǒng)中紫外燈下可見1 064 bp處的Homer1目的片段和6 200 bp處的p3×FLAG-CMV-10載體片段；酶切鑒定陽性的Homer1基因真核表達重組質(zhì)粒經(jīng)生工生物工程(上海)股份有限公司測序并與GenBank中檢索的Homer1基因cDNA序列進行比對，證實Homer1基因中插入了p3×FLAG-CMV-10載體。以上結(jié)果表明，Homer1基因真核表達重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

HT22細胞是一種永生化的小鼠海馬神經(jīng)元細胞，具有典型的神經(jīng)元形態(tài)和特征，被廣泛用于AD、帕金森病等神經(jīng)退行性疾病的基礎研究[16]。由于小鼠原代神經(jīng)元取材困難且不能傳代培養(yǎng)，通常用HT22細胞代替小鼠原代神經(jīng)元進行實驗。本研究將Homer1基因真核表達重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HT22細胞，使HT22細胞Homer1蛋白過表達，進而研究Homer1蛋白在小鼠海馬神經(jīng)元中對Aβ、Tau蛋白及腦內(nèi)Ca2+通道的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，p3×FLAG-CMV-10-Homer1重組質(zhì)粒組Homer1蛋白相對表達量明顯高于p3×FLAG-CMV-10空載體組、空白對照組，而p3×FLAG-CMV-10空載體組與空白對照組Homer1蛋白相對表達量比較差異無統(tǒng)計學意義，提示本研究構(gòu)建的Homer1基因真核表達重組質(zhì)粒能夠轉(zhuǎn)染入小鼠海馬神經(jīng)元。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了p3×FLAG-CMV-10-Homer1基因真核表達重組質(zhì)粒，并成功轉(zhuǎn)染入HT22細胞，這為研究Homer1蛋白對腦內(nèi)Aβ清除的影響及在AD發(fā)病機制中的作用奠定了基礎。