國內(nèi)人乳頭瘤病毒檢測技術在不同實驗室間的重復性評價研究△

薛鵬，沈潔，韓歷麗#，江宇，陳汶，喬友林

1中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院公共衛(wèi)生學院，北京 100730

2國家癌癥中心/國家腫瘤臨床醫(yī)學研究中心/中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院腫瘤醫(yī)院流行病學研究室，北京 100021

3首都醫(yī)科大學附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院北京婦幼保健院婦女保健科，北京 100026

宮頸癌是女性常見的惡性腫瘤，嚴重威脅女性的生命健康。隨著高危型人乳頭瘤病毒（high riskhuman papillomavirus，HR-HPV）和宮頸癌病因關系的建立，針對HR-HPV的檢測已成為宮頸癌篩查的主要手段[1-2]。由于人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）檢測技術具有較高的靈敏度和陰性預測值，現(xiàn)已被一些國家作為初篩方法納入國家宮頸癌篩查體系[3-5]。2015年，中國國家食品藥品監(jiān)督管理總局（China Food and Drug Administration，CFDA）進一步規(guī)范了HPV檢測試劑盒的臨床功能驗證[6]。盡管中國部分HPV試劑已通過嚴格的臨床性能評價[7]，表現(xiàn)出較高的靈敏度和特異度，但尚缺乏國產(chǎn)HPV試劑在不同實驗室間的重復性評價研究，難以保證其HPV檢測結果的真實可靠，在一定程度上限制了其作為宮頸癌初篩方法的推廣和應用。本研究初步評價國內(nèi)兩種實時熒光聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）方法在不同實驗室間檢測HPV的可重復性，以確保其HPV檢測結果的可靠性，旨在為中國HPV檢測技術的發(fā)展提供數(shù)據(jù)依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選擇2016年11月至2017年5月于中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院和北京大學第一醫(yī)院接受宮頸癌篩查或門診就診的210例患者，年齡為23～65歲，平均（40.2±6.3）歲，無妊娠可疑征兆，無子宮或宮頸外科手術史。本研究經(jīng)中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院倫理委員會批準，所有患者均對本研究知情并簽署知情同意書。

1.2 標本收集和處理

各醫(yī)院婦科醫(yī)師應用宮頸細胞采樣刷收集宮頸脫落細胞標本，并轉移至細胞保存液PreservCyt中保存，嚴格遵守無菌操作原則進行分樣，分別低溫保存并運送至北京洛奇臨床檢驗所實驗室和愛普益醫(yī)學檢驗中心實驗室進行透景HPV檢測，以及運送至北京凱普醫(yī)學檢驗所和朝陽區(qū)婦幼保健院實驗室進行凱普HPV檢測。

1.3 透景HPV 檢測

收集1 ml經(jīng)PreservCyt提取純化后的DNA 5.0 μl，加入含有 20 μl反應液的 PCR 管中，置于ABI7500熒光PCR儀上。設置參數(shù)：95℃10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 35 s，72 ℃ 20 s，共循環(huán)46次，單點熒光檢測在60℃，PCR反應體系的體積為25 μl。采用ABI7500熒光PCR儀的3種熒光通道（VIC、ROX、FAM）分別檢測HPV16、18和其他12種HRHPV（HPV31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68）。當VIC、ROX、FAM熒光通道的Ct值≤30且增長曲線呈光滑型起跳時，則判定為陽性；當Ct值＞30時，則判定為陰性。

1.4 凱普HPV 檢測

取純化后的 DNA 2.0 μl，加入含有 18 μl反應液的PCR管中，置于全自動定量PCR熒光儀上。設置參數(shù)：95 ℃ 10 min；95℃ 10 s，60 ℃ 60 s，38℃5 s，共循環(huán)47次，單點熒光檢測在60℃，PCR反應體系的體積為20 μl。3種熒光通道（FAM、HEX、ROX）可分別檢測HPV16、18和其他12 種 HR-HPV（HPV31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68）。當FAM、HEX、ROX 熒光通道的Ct值≤40時，則判定為陽性；當Ct值＞40時，則判定為陰性。

1.5 統(tǒng)計學分析

采用SAS 9.4軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。采用Kappa檢驗評價不同實驗室檢測技術的可重復性。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同實驗室間透景HPV 檢測結果的比較

透景HPV試劑在不同實驗室間檢測HR-HPV的總一致率為99.52%（95%CI：97.35%～99.92%），Kappa值為 0.99（95%CI：0.97～1.00）；檢測 HPV16和HPV18的總一致率分別為99.52%（97.35%～99.92%）和 100%，Kappa值分別為 0.99（95%CI：0.97～1.00）和1.00；檢測其他12種HR-HPV的總一致率為99.52%（95%CI：97.35%～99.92%），Kappa值為0.99（95%CI：0.97～1.00）。（表1）

2.2 不同實驗室間凱普HPV 檢測結果的比較

凱普HPV試劑在不同實驗室間檢測HR-HPV的總一致率為99.05%（95%CI：96.59%～99.74%），Kappa 值為 0.98（95%CI：0.96～1.00）；檢測 HPV16和HPV18的總一致率分別為98.57%（95%CI：95.88%～99.51%）和100%，Kappa值為0.97（95%CI：0.93～1.00）和1.00；檢測其他12種HR-HPV的總一致率為98.57%（95%CI：95.88%～99.51%），Kappa值為0.97（95%CI：0.93～1.00）。（表2）

2.3 兩種檢測技術在不同實驗室間檢測HPV的不一致結果

對不一致的HPV檢測結果進行分析，透景試劑檢測HPV16有1例不一致樣本，Ct值為26.79，檢測其他HR-HPV有1例不一致樣本，Ct值為25.47。凱普試劑檢測HPV16有3例不一致樣本，Ct值分別為28.96、25.96和34.57，檢測其他HRHPV有3例不一致樣本，Ct值分別為36.58、33.69和39.33。兩種試劑檢測HPV18均未發(fā)現(xiàn)不一致。（表 3）

3 討論

目前，宮頸癌篩查存在多種策略，主要檢測技術包括HPV DNA和薄層液基細胞學[8]。由于細胞學檢查主觀性強，可重復性差，需要經(jīng)驗豐富的細胞學醫(yī)師和專業(yè)設備，同時國內(nèi)細胞學相關技術人員稀缺，難以建立行之有效的宮頸癌篩查體系[9]?；谥袊膰榧皩m頸癌篩查現(xiàn)狀，采用HPV DNA檢測作為宮頸癌的初篩方法更具篩查效能，中國政府已將HPV檢測技術納入國家“兩癌”篩查項目中，而HPV檢測方法的準確性是決定宮頸癌篩查質(zhì)量的關鍵[8,10]。國際上針對HPV試劑能否應用于宮頸癌篩查有具體規(guī)定，新研發(fā)的HPV檢測試劑的靈敏度和特異度不能劣于參照標準HC2或GP5+/GP6+PCR，此外，其實驗室內(nèi)和實驗室間重復性的較低置信區(qū)間界限不低于87%，同時保持Kappa值大于或等于0.5[11]。美國食品藥品管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準上市的HPV檢測試劑包括HC2、Cervista HPV、Cobas HPV、Aptima HPV和BD Onclarity HPV，均經(jīng)過上述嚴格的評價過程，表現(xiàn)出理想的臨床性能和實驗室內(nèi)、實驗室間的重復性[12-13]。但考慮其檢測試劑和儀器設備造價昂貴，推廣至中國宮頸癌篩查體系中受到限制。近年來，國產(chǎn)HPV檢測試劑飛速發(fā)展，由CFDA批準的HPV檢測試劑多達60余種[14]。中國一項研究針對國內(nèi)市場上不同平臺的HPV試劑進行了系統(tǒng)性臨床性能評價，結果表明，84.2%（16/19）的實驗室及HPV試劑的臨床靈敏度均達到了90%以上，特異度為89.1%～65.94%，其中實時熒光PCR方法的臨床性能最佳[15]，但尚不明確其HPV檢測結果是否真正準確及可靠。

表1 不同實驗室間透景HPV檢測結果的比較（n=210）

表2 不同實驗室間凱普HPV檢測結果的比較（n=210）

表3 兩種檢測技術在不同實驗室間檢測HPV的不一致結果

本研究初步評價了國內(nèi)兩種實時熒光PCR方法在不同實驗室間檢測HPV的可靠性。透景和凱普試劑檢測HR-HPV、HPV16、HPV18以及其他HR-HPV在不同實驗室間的重復性均超過98%，甚至兩種方法檢測HPV18的重復性均達到了100%，表明中國透景和凱普HPV試劑的檢測結果穩(wěn)定可靠，但仍有低于2%的樣本不一致。本研究結果顯示，不一致的樣本中有71.4%（5/7）Ct值較高，接近這兩種檢測方法設定的cut-off值，表明有較低水平的HPV載量，即HPV弱陽性。比利時的一項研究評估了Xpert HPV檢測技術在不同實驗室間的重復性，結果證實大部分不一致樣本的Ct值均接近其檢測方法的cut-off值[16]。挪威的一項研究也證實了這一結果[17]。本研究認為HPV檢測技術在不同實驗室間的微小差異主要來自HPV弱陽性結果。雖然HPV弱陽性結果在篩查中的發(fā)生率并不高，但僅憑單次HPV檢測結果將弱陽性結果判定為陽性是不嚴謹?shù)淖龇╗18]。因此，建議對HPV檢測中出現(xiàn)的弱陽性結果予以重視，可考慮對其重新取樣或進行重復性檢測，使用更為精準的檢測手段予以證實，避免漏診和誤診，以保證宮頸癌篩查質(zhì)量。

綜上所述，透景HPV和凱普HPV檢測方法在不同實驗室間檢測HPV的重復性和Kappa值遠超過國際法規(guī)所要求的一致率≥87%，Kappa≥0.5，是可靠的HPV檢測技術，在未來可能用于宮頸癌篩查。但本研究樣本量較少，結果可能存在一定的偏倚。因此，為準確評價兩種實時熒光PCR方法在不同實驗室間檢測HPV的可靠性，尚需要在大規(guī)模篩查中進一步驗證，以提供更為可靠的證據(jù)。