分子對(duì)接模擬法與多光譜法研究鹽酸金霉素與胃蛋白酶的相互作用

王曉霞，于洋洋，馬力通，聶智華，王正德，崔金龍，賽華征，趙文淵

1. 內(nèi)蒙古科技大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014010 2. 中國(guó)石油大學(xué)(華東)化學(xué)工程學(xué)院，山東 青島 266580 3. 清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 100084

引 言

金霉素(chlortetracycline，CTC)是一種能抑制革蘭陽(yáng)性菌和陰性菌的活性四環(huán)素類抗生素。胃蛋白酶(pepsin，PEP)主要存在于胃液中，是一種多肽水解酶[1-2]。當(dāng)CTC經(jīng)口服進(jìn)入胃中后，通常會(huì)與胃液中的酶結(jié)合，由于CTC分子含有多個(gè)具有活性的酚羥基，可能會(huì)與胃蛋白酶上的活性基團(tuán)相互作用，從而使PEP的活性發(fā)生改變。近年來(lái)，藥物小分子與蛋白酶的相互作用吸引了國(guó)內(nèi)外研究學(xué)者的廣泛關(guān)注。Fatemeh S. Mohseni-Shahri[3]使用多光譜法和分子動(dòng)力學(xué)模擬，探究了食品添加劑日落黃與PEP的結(jié)合機(jī)理；Mallika Pathak[4]運(yùn)用多光譜法和熱力學(xué)計(jì)算，研究了二甲雙胍與PEP的結(jié)合反應(yīng)。

使用多光譜法與分子對(duì)接模擬法研究PEP與CTC之間的相互作用，通過(guò)探討CTC與PEP的相互作用機(jī)制，可進(jìn)一步了解CTC對(duì)PEP活性和功能的影響，以及了解CTC在體內(nèi)的藥效動(dòng)力學(xué)和代謝動(dòng)力學(xué)，為改良藥物和開發(fā)新藥提供參考依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

熒光分光光度計(jì)(LS-55，美國(guó)PerkinElmer公司)；紫外可見(jiàn)近紅外分光光度計(jì)(CARY-5000，美國(guó)安捷倫科技有限公司)；圓二色譜儀(Chirascan plus，英國(guó)應(yīng)用光物理公司)。

1.0×10-4mol·L-1金霉素(Chlortetracycline Hydrochloride，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95.3%，中國(guó)藥品生物制品檢定所)溶液；0.1 mol·L-1pH 2.00的三(羥甲基)氨基甲烷(Tris hydroxymethyl aminomethane，Tris，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.0%)0.5 mol·L-1的NaCl溶液；5×10-4mol·L-1胃蛋白酶(porcine stomach mucose，PEP，純度≥98%，上海金穗生物科技有限公司)溶液。

1.2 方法

1.2.1 熒光光譜的測(cè)定

取十支比色管，分別加入1.0 mL的PEP溶液(5.0×10-4mol·L-1)，再分別加入適量的CTC溶液(1×10-4mol·L-1)，定容至10 mL，使管內(nèi)CTC濃度分別為(0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0和4.5)×10-5mol·L-1。充分搖勻后，置入預(yù)先定溫好的恒溫?zé)崴≈?，放?0 min，分別測(cè)量各管溶液的熒光光譜，并記錄波長(zhǎng)范圍內(nèi)發(fā)射峰位置及相應(yīng)熒光強(qiáng)度。根據(jù)上述方法，分別測(cè)定熱力學(xué)溫度為298，303和308 K條件下的所需數(shù)據(jù)。

熒光光度計(jì)的條件設(shè)置: 激發(fā)波長(zhǎng)(λex)為280 nm，發(fā)射波長(zhǎng)(λem)范圍為300～600 nm，掃描速度為1 500 nm·min-1，狹縫寬為9.0 nm。

1.2.2 同步光譜測(cè)定

用熒光光譜法配制比例配制同步熒光所需的待測(cè)液，所得待測(cè)液中PEP濃度均為5×10-5mol·L-1，CTC的濃度分別為(0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5)×10-5mol·L-1。靜置與儀器預(yù)熱完畢，設(shè)置光度計(jì)，調(diào)節(jié)前后狹縫為9.0 nm，掃描速率為1 500 nm·min-1，分別設(shè)置發(fā)射波長(zhǎng)與激發(fā)波長(zhǎng)的波長(zhǎng)差為15和60 nm，分別設(shè)發(fā)射波長(zhǎng)為265和310 nm，激發(fā)波長(zhǎng)范圍為250～550 nm。用比色皿盛取溶液，置入測(cè)量部位，掃描待測(cè)液，得同步熒光光譜。

1.2.3 三維熒光光譜測(cè)定

取兩支比色管，分別加入0.5 mL的PEP溶液(5.0×10-4mol·L-1)，再取其中一支加入1.0 mL的CTC溶液(1×10-4mol·L-1)。放入298 K的恒溫水浴鍋，靜置20 min，待測(cè)。

熒光光度計(jì)預(yù)熱20 min，再調(diào)至三維熒光功能區(qū)，設(shè)置前后狹縫為7.0 nm，激發(fā)波長(zhǎng)范圍為200～400 nm，間隔為5.0 nm，掃描200～500 nm范圍內(nèi)的發(fā)射光譜，掃描速度為1 500 nm·min-1。待測(cè)溶液放入比色皿，測(cè)出光譜后導(dǎo)出數(shù)據(jù)。

1.2.4 紫外可見(jiàn)吸收光譜的測(cè)定

取十支比色管，分別移取1.5 mL的PEP溶液(5.0×10-4mol·L-1)，再分別加入適量的CTC溶液(1×10-4mol·L-1)，使管內(nèi)CTC最終濃度分別為(0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5)×10-5mol·L-1。搖勻后靜置20 min，置入25 ℃恒溫水浴鍋中20 min。設(shè)置掃描吸收波長(zhǎng)范圍為190～500 nm，掃描速度為300 nm·min-1。記錄CTC和PEP體系的紫外光譜。

1.2.5 結(jié)合距離的測(cè)定

在三支比色管中，分別配制PEP的濃度1.0×10-5mol·L-1、 CTC濃度為1.0×10-5mol·L-1和PEP和CTC濃度均為1.0×10-5mol·L-1的溶液。放入298 K的恒溫水浴鍋，靜置20 min。對(duì)CTC溶液進(jìn)行紫外測(cè)定，對(duì)PEP溶液和CTC-PEP混合液進(jìn)行熒光測(cè)定。熒光光度計(jì)參數(shù): 激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm，發(fā)射波長(zhǎng)掃描范圍為290～550 nm，狹縫設(shè)為8.0 nm，掃描速度為500 nm·min-1。紫外可見(jiàn)吸收光度計(jì)參數(shù): 掃描范圍為190～500 nm，掃描間隔為0.5 nm。掃描速度為300 nm·min-1。

1.2.6 圓二色光譜的測(cè)定

在兩支比色管中，準(zhǔn)確移取1.0 mL的PEP溶液、 1.0 mL的PEP溶液加4.0 mL的CTC溶液，蒸餾水定容至10 mL，得到溶液中PEP濃度均為1×10-5mol·L-1，CTC的濃度分別為0和4.0×10-5mol·L-1，待測(cè)。

儀器狹縫寬度調(diào)為10.0 nm，設(shè)掃描波長(zhǎng)范圍為180～260 nm，掃描時(shí)長(zhǎng)為0.5 s。以Tris-HCl溶液為參比，記錄CTC和CTC-PEP體系的圓二色光譜。

1.2.8 分子對(duì)接模擬技術(shù)

蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)RCSB Protein Data Bank(http://www.rcsb.org/pdb/ home/home.do)選取PEP晶體結(jié)構(gòu)(蛋白質(zhì)編碼: 3utl)，由Chem office 15.1軟件畫出CTC的分子結(jié)構(gòu)式，利用分子對(duì)接軟件DS2016Client作出分子對(duì)接模擬圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 CTC對(duì)PEP的熒光猝滅光譜

PEP是由多種氨基酸脫水縮合而成，其中三種芳香氨基酸(色氨酸、 酪氨酸、 苯丙氨酸)使PEP具有內(nèi)源性熒光[5]。圖1(a,b,c)分別為298，303和308 K溫度時(shí)，固定濃度的PEP隨CTC濃度增大的熒光強(qiáng)度變化情況。由圖1(a,b,c)可知，在激發(fā)波長(zhǎng)280 nm下，PEP的最大發(fā)射波長(zhǎng)為344 nm，隨著CTC濃度的增加，PEP的熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)出有序的下降，而發(fā)射光譜峰位置移動(dòng)不明顯，由此可知CTC對(duì)PEP的熒光強(qiáng)度產(chǎn)生了猝滅效應(yīng)，兩者之間發(fā)生了反應(yīng)。

圖1 不同溫度下CTC-PEP體系的熒光發(fā)射光譜圖Fig.1 Fluorescence emission spectra of CTC-PEP system under different temperature(a)：298 K；(b)：303 K；(c)：308 Kc(PEP)=5.0×10-5 mol·L-1；c(CTC)(1—10)：(0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5)×10-5 mol·L-1；pH 2.00

2.2 CTC對(duì)PEP的熒光猝滅類型的判斷

動(dòng)態(tài)熒光猝滅中，猝滅分子與熒光分子發(fā)生碰撞或能量轉(zhuǎn)移，使熒光分子不發(fā)射熒光就直接返回基態(tài)，故猝滅效果與激發(fā)的單個(gè)熒光分子壽命、 猝滅劑實(shí)際濃度和所處溫度有關(guān)，相關(guān)運(yùn)算可使用Stern-Volmer方程[6]

F0/F=1+KSV[Q]=1+Kqτ0[Q]

(1)

式(1)中：F0是無(wú)CTC存在時(shí)熒光體PEP的熒光強(qiáng)度；F是加入CTC溶液后熒光體PEP的熒光強(qiáng)度；[Q]是CTC溶液的實(shí)際最終濃度；KSV是動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)；KLB是靜態(tài)猝滅常數(shù)；Kq為動(dòng)態(tài)熒光猝滅速率常數(shù)；τ0是無(wú)猝滅劑時(shí)生物體內(nèi)大分子的內(nèi)源性熒光壽命，生物大分子的τ0約為10-8s[6]。假設(shè)CTC對(duì)PEP引起的猝滅方式是動(dòng)態(tài)猝滅，則CTC對(duì)PEP的猝滅規(guī)律適用于Stern-Volmer方程。本實(shí)驗(yàn)研究了在298，303和308 K三個(gè)溫度下CTC對(duì)PEP熒光猝滅的影響。以CTC濃度[Q]為橫坐標(biāo)、F0/F為縱坐標(biāo)進(jìn)行作圖，得到Stern-Volmer曲線見(jiàn)圖2，并求得KSV及Kq值列入表1。

圖2 三個(gè)溫度CTC-PEP體系的熒光猝滅的Stern-Volmer曲線Fig.2 Fluorescence quenching of Stern-Volmer curve of CTC-PEP system at three temperatures

根據(jù)表1中298，303和308 K下的Kq≈1013L·(mol·s)-1，都遠(yuǎn)大于動(dòng)態(tài)猝滅最大速率常數(shù)2.0×1010L·(mol·s)-1[7]，表明CTC主要通過(guò)靜態(tài)猝滅的途徑來(lái)減弱PEP的熒光強(qiáng)度。靜態(tài)猝滅中，溫度升高會(huì)使其猝滅常數(shù)KSV降低。由表1可知，在不同溫度下CTC-PEP體系的猝滅常數(shù)KSV(L·mol-1)：9.425×104(298 K)>8.795×104(303 K)>7.915×104(308 K)，由于KSV隨著溫度增加逐漸減小，可進(jìn)一步說(shuō)明CTC對(duì)PEP的猝滅類型為靜態(tài)猝滅。

表1 Stern-Volmer線性方程和相關(guān)系數(shù)Table 1 Stern-Volmer linear equations and correlation coefficients

2.3 CTC與PEP的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)

利用靜態(tài)猝滅雙對(duì)數(shù)公式[8]求兩者的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)

lg[(F0-F)/F]=lgKA+nlg[Q]

(2)

式(2)中：KA是CTC與PEP的結(jié)合常數(shù)；n是CTC與PEP的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。以lg[Q]為橫坐標(biāo)、 lg[(F0-F)/F]為縱坐標(biāo)作雙對(duì)數(shù)圖(圖3)，擬合直線的斜率是兩者的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)lgKA，與縱坐標(biāo)的截距數(shù)值為n，計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表1。

圖3 不同溫度下lg[(F0-F)/F]-lg[Q]圖Fig.3 Polt of lg[(F0-F)/F] against lg[Q] at different temperature

由表1可知，在298 K時(shí)，CTC-PEP體系的結(jié)合常數(shù)KA=4.345×107L·mol-1，n=1.618，在303 K時(shí)，CTC-PEP體系的結(jié)合常數(shù)KA=2.836×107L·mol-1，n=1.587，在308 K時(shí)，CTC-PEP體系的結(jié)合常數(shù)KA=1.734×107L·mol-1-n=1.555。可見(jiàn)，三個(gè)溫度時(shí)的CTC與PEP結(jié)合常數(shù)KA很大，且結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n都接近于1，其證明CTC 與PEP之間的結(jié)合作用較強(qiáng)，所得到的復(fù)合物也均為1∶1型。同時(shí)CTC與PEP的結(jié)合常數(shù)大小排列為：KA(298 K)>KA(303 K)>KA(308 K)，這顯示CTC與PEP的結(jié)合常數(shù)KA在一定溫度范圍內(nèi)與溫度呈負(fù)相關(guān)，這與猝滅常數(shù)KSV與溫度的關(guān)系具有一致性，進(jìn)一步表明CTC對(duì)PEP熒光猝滅模式為靜態(tài)猝滅。

2.4 CTC和PEP相互作用的熱力學(xué)參數(shù)和主要作用力

Ross理論中的論斷可判斷出結(jié)合反應(yīng)的實(shí)際作用力[9]：當(dāng)ΔH>0，ΔS>0時(shí)，作用力為疏水作用力；ΔH<0，ΔS<0時(shí)，作用力為氫鍵和范德華力；ΔH<0，ΔS>0時(shí)，作用為靜電作用力。

ln(K2/K1)=ΔH(1/T1-1/T2)/R

(3)

lnK=-ΔH/RT+ΔS/R

(4)

ΔG=ΔH-TΔS=-RTlnKA

(5)

運(yùn)用式(3)—式(5)，根據(jù)Van’t Hoff公式[10]，計(jì)算出298，303和308 K下熱力學(xué)參數(shù)焓變?chǔ)=-70.13 kJ·mol-1，熵變?chǔ)=-89 J·(mol·K)-1，吉布斯自由能ΔG=-43.57 kJ·mol-1(298 K)，-43.23 kJ·mol-1(303 K), -42.68 kJ·mol-1(308 K)?？芍?，ΔH<0，ΔS<0，可推測(cè)出CTC與PEP間主要作用力是范德華力和氫鍵，ΔG<0可說(shuō)明CTC對(duì)PEP的靜態(tài)猝滅為自發(fā)、 放熱(ΔH<0)的結(jié)合過(guò)程。

2.5 CTC- PEP體系的結(jié)合距離

根據(jù)F?rster’s[11]非輻射能量轉(zhuǎn)移理論，激發(fā)體和吸收體之間的能量遷移率E與兩者結(jié)合距離r及臨界能量遷移距離R0存在以下關(guān)系

(6)

(7)

J=∑FD(λ)εA(λ)λ4Δλ/∑FD(λ)Δλ

(8)

式(6)—式(8)中：r為CTC與PEP之間的結(jié)合距離；R0代表E=50%時(shí)的臨界能量轉(zhuǎn)移距離；k2是偶極空間取向因子，一般取平均值2/3；n為介質(zhì)中的光折射指數(shù)，通常取水和有機(jī)物的平均值1.36；φ為PEP的熒光量子產(chǎn)率，常取色氨酸殘基量子產(chǎn)率φ=0.15；J為PEP的發(fā)射光譜與CTC紫外吸收光譜的重疊積分；FD(λ)為PEP在各個(gè)波長(zhǎng)下的熒光強(qiáng)度；εA(λ)為CTC在各個(gè)波長(zhǎng)下的摩爾吸光系數(shù)，F(xiàn)D(λ)與εA(λ)計(jì)算所用波長(zhǎng)一致。

圖4為CTC與PEP的濃度比為1∶1時(shí)，CTC的紫外-可見(jiàn)吸收光譜曲線與PEP的發(fā)射光譜曲線的重疊圖，代入式(6)—式(8)積分求得兩光譜重疊積分J=3.409×10-14cm3· mol·L-1，E=42.96%,R0=3.091 nm，r=3.240 nm。0.5R0

圖4 PEP的熒光光譜曲線(a)與CTC的紫外吸收光譜曲線(b)重疊圖Fig.4 Overlapping of the fluorescence spectra of PEP (a) with the absorption spectra of CTC (b)a: c(PEP)=1.0×10-5 mol·L-1；b: c(CTC)=1.0×10-5 mol·L-1；T=298 K；pH 2.00

2.6 CTC對(duì)PEP二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

2.6.1 CTC對(duì)PEP作用的紫外可見(jiàn)吸收光譜分析

動(dòng)態(tài)猝滅的熒光物質(zhì)的吸光度一般不受其猝滅劑影響[12]，圖5中隨著CTC濃度增大，PEP的紫外吸收峰逐漸增大，證明兩者發(fā)生了相互作用，且進(jìn)一步證明靜態(tài)猝滅發(fā)生在CTC與PEP之間。發(fā)生紅移現(xiàn)象顯示嵌入的CTC藥物分子與PEP酶的堿基對(duì)π電子發(fā)生相互作用，使π→π*躍遷更易進(jìn)行，吸收的光波能量降低。上述現(xiàn)象，說(shuō)明CTC使PEP分子二級(jí)結(jié)構(gòu)的構(gòu)象發(fā)生了變化。

圖5 CTC與PEP的紫外可見(jiàn)吸收光譜圖Fig.5 UV-Visible absorption spectrum of CTC with PEPc(CTC)(1—10)；(0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5)×10-5 mol·L-1；c(PEP)= 5.0×10-5 mol·L-1；T=298 K；pH 2.00

2.6.2 CTC對(duì)PEP作用的同步熒光光譜分析

當(dāng)Δλ為15 nm時(shí)，同步熒光光譜可顯示PEP中酪氨酸(Tyr)殘基的熒光光譜特性；Δλ為60 nm時(shí)，可顯示PEP中色氨酸(Trp)殘基的熒光光譜特性[13]。

圖6(a)為在Δλ=15 nm時(shí)的CTC-PEP同步熒光光譜，圖6(b)為在Δλ=60 nm時(shí)CTC-PEP的同步熒光光譜。從圖6中可知，在PEP存在的環(huán)境中，酪氨酸(Tyr)殘基的熒光光波峰波長(zhǎng)并沒(méi)有受CTC濃度的影響，且熒光強(qiáng)度變化微弱，峰型基本不變；但色氨酸(Trp)殘基的發(fā)射峰隨著CTC濃度的增大熒光強(qiáng)度顯著減小，而且紅移了2.5 nm，證明CTC使PEP的色氨酸殘基微環(huán)境極性增加、 親水性增加和疏水性減弱，引起PEP二級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)象改變。

圖6 CTC與PEP的同步熒光光譜圖Fig.6 Synchronous flourescence spectra of CTC and PEP(a): Δλ=15 nm；(b): Δλ=60 nmc(PEP)=5.0×10-5 mol·L-1；c(CTC)(1—10): (0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5)×10-5 mol·L-1；T=298 K；pH 2.00

2.6.3 CTC與PEP的三維熒光光譜分析

圖7(a)和(b)為PEP和 CTC-PEP體系的三維熒光光譜圖及等高線圖。“山脊”狀的PEAK a和PEAK b是瑞利散射峰(λex=λem)；“駝峰”形狀的PEAK 1和PEAK 2是典型的熒光峰(2λex=λem)，PEAK 1顯示殘基Trp和殘基Tyr的熒光光譜特征[13]，PEAK 2主要與多肽骨架結(jié)構(gòu)有關(guān)，其強(qiáng)度與蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)相關(guān)。由表4可知，加入CTC后，峰1(PEAK 1)的熒光強(qiáng)度降低且最大發(fā)射波長(zhǎng)紅移了3.0 nm，峰2(PEAK 2)的熒光強(qiáng)度降低且最大發(fā)射波長(zhǎng)紅移了0.5 nm。熒光強(qiáng)度的降低顯示CTC對(duì)PEP發(fā)生了猝滅作用。紅移現(xiàn)象則證明CTC影響了PEP的周圍微環(huán)境，CTC使PEP周圍的微環(huán)境的極性增大、 親水性增強(qiáng)和疏水性降低，且CTC使PEP的肽鏈結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。綜合上述，CTC使PEP的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。

圖7 PEP與CTC相互作用前(a)后(b)的三維熒光光譜Fig.7 The three-dimensional fluorescence spectra of BSA and CTC before (a) and after (b)reaction(a)：c(PEP)=2.5×10-5 mol·L-1；(b)：c(PEP)=2.5×10-5 mol·L-1，c(CTC)=1.0×10-5 mol·L-1；T=298 K；pH 7.40

表2 PEP和CTC-PEP的三維激發(fā)發(fā)射熒光光譜特征參數(shù)Table 2 Three-dimensional fluorescence spectra characteristic of PEP and CTC-PEP

2.6.4 CTC對(duì)PEP作用的圓二色譜分析

為進(jìn)一步研究CTC對(duì)PEP 構(gòu)象的影響，掃描PEP與 CTC-PEP體系的圓二色譜。由圖8可知，PEP在200 nm處具有一個(gè)負(fù)峰，這個(gè)負(fù)峰是PEP的β-折疊特征峰，吸收峰的強(qiáng)度可以反映蛋白酶β-折疊(β-sheet)含量的變化。將圓二色譜值導(dǎo)入CDNN軟件，經(jīng)過(guò)計(jì)算得出CTC和CTC-PEP體系的各二級(jí)結(jié)構(gòu)占比。當(dāng)PEP與CTC的濃度比為c(PEP)∶c(CTC)=1∶8時(shí)，PEP的β-折疊(β-sheet)占比從47.3%(c(PEP)∶c(CTC)=1∶0)降到28.2%。同時(shí)，PEP的α-螺旋(α-Helix)占比從11.6%(c(PEP)∶c(CTC)=1∶0)增加到21.0%，β-轉(zhuǎn)角(β-Turn)占比從19.6%(c(PEP)∶c(CTC)=1∶0)增加到24.2%，無(wú)規(guī)則結(jié)構(gòu)(Random coil)占比從27.6%(c(PEP)∶c(CTC)=1∶0)增加到34.2%。上述結(jié)果均表明CTC對(duì)PEP發(fā)生了相互作用，改變了PEP周圍的微環(huán)境，導(dǎo)致PEP的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。

圖8 CTC與PEP相互作用的圓二色譜圖Fig.8 The circular dichroism spectra of PEP interacting with CTCa：c(PEP)=1.0×10-5 mol·L-1；b：c(PEP)=1.0×10-5 mol·L-1，c(CTC)= 8.0×10-5 mol·L-1；T=298 K；pH 2.00

2.7 CTC與PEP的分子對(duì)接模擬

為了判斷CTC對(duì)PEP相互作用形式，利用分子對(duì)接軟件進(jìn)行對(duì)接模擬來(lái)預(yù)測(cè)兩者作用力形式及特定距離，利用程序生成CTC對(duì)PEP的對(duì)接模擬見(jiàn)圖9。由圖9(a)和(b)可知，CTC分子進(jìn)入到PEP的表面活性中心凹槽處。為進(jìn)一步觀察CTC與PEP相互作用的微環(huán)境，作出CTC附近的氨基酸殘基2D/3D示意圖9(c)。

圖9(c)中，CTC與GLU13，GLY217，ASP32，ASP215和GLY76等氨基酸殘基形成氫鍵，其鍵長(zhǎng)分別為3.393，3.127和3.456，2.578，3.110，2.283 ?。其中，GLY217殘基與CTC形成2個(gè)碳?xì)滏I(Carbon Hydrogen Bond)。CTC與PEP的殘基VAL30，SER35，TYR189，THR74，THR77，GLY78和LEU112通過(guò)范德華力相互作用。CTC還與殘基TYR75之間存在疏水作用力，其作用形式為π-烷基(Pi-Alkyl)，鍵長(zhǎng)為4.851 ?。除了上述作用力，CTC還與殘基ILE120，ASP32，GLY34，TYR75，PHE111，LEU112和PHE117之間存在不利碰撞作用力(unfavorable bump)，鍵長(zhǎng)分別為3.631，3.643與4.589，2.091與3.451，3.240，4.080，4.391 ?。這一切均能說(shuō)明CTC通過(guò)各種作用力與PEP穩(wěn)定結(jié)合，CTC與PEP之間的作用力主要是氫鍵與范德華力，且說(shuō)明CTC使PEP二級(jí)結(jié)構(gòu)微環(huán)境變化。

圖9 CTC與PEP結(jié)合的分子對(duì)接結(jié)構(gòu)模型圖(a)：CTC與PEP的分子對(duì)接模擬圖；(b)：CTC與PEP的飄帶狀分子對(duì)接模擬圖；(c)CTC與PEP的氨基酸殘基2D，3D示意圖Fig.9 The docking result of CTC with PEP(a)：Molecular docking simulation of CTC and PEP；(b)：Streamer shape molecular docking model diagram of CTC and PEP；(c)：2D/3D diagram of amino acid residues of CTC and PEP

3 結(jié) 論

探究了PEP-CTC在298，303和308 K溫度下的熒光發(fā)射光譜，證明兩者發(fā)生相互作用，CTC使PEP熒光猝滅。Stern-Volmer方程計(jì)算得到三個(gè)溫度下的Kq≈1013L·(mol·s)-1，顯示CTC對(duì)PEP的熒光猝滅形式為靜態(tài)猝滅。靜態(tài)猝滅雙對(duì)數(shù)公式計(jì)算的三個(gè)溫度下的兩者的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)，證明CTC與PEP之間的結(jié)合較強(qiáng)且復(fù)合比為1∶1型，也進(jìn)一步證明CTC對(duì)PEP猝滅反應(yīng)為靜態(tài)猝滅。由Van’t Hoff公式結(jié)合Ross理論推斷出PEP-CTC的主要作用力形式為氫鍵和范德華力，其結(jié)合過(guò)程是自發(fā)、 放熱的反應(yīng)。利用F?rster’s偶極-偶極非輻射能量轉(zhuǎn)移理論，計(jì)算出結(jié)合距離r=3.240 nm，證明非輻射能量轉(zhuǎn)移出現(xiàn)在CTC與PEP之間并導(dǎo)致PEP熒光猝滅。經(jīng)過(guò)分子對(duì)接，由模擬結(jié)果可知CTC對(duì)PEP殘基的作用方式不僅具有氫鍵和范德華力，還存在疏水作用力，CTC通過(guò)各種作用力與PEP穩(wěn)定結(jié)合。通過(guò)CTC-PEP的紫外-可見(jiàn)吸收光譜分析，PEP的吸收峰發(fā)生一定的紅移，證明PEP的分子構(gòu)象發(fā)生改變，進(jìn)一步證明CTC與PEP之間發(fā)生了熒光靜態(tài)猝滅。利用波長(zhǎng)差分別為15和60 nm的同步熒光法觀察PEP中特定氨基酸，可知CTC的加入使色氨酸(Trp)殘基附近微環(huán)境極性變大，導(dǎo)致PEP的構(gòu)象變化。利用三維熒光光譜法對(duì)CTC-PEP體系分析可知，CTC對(duì)PEP的熒光強(qiáng)度產(chǎn)生猝滅，同時(shí)證明CTC降低熒光分子的微環(huán)境極性并改變其肽鏈結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步證實(shí)了PEP二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。通過(guò)圓二色譜法分析CTC-PEP體系，并利用CDNN軟件計(jì)算出各二級(jí)結(jié)構(gòu)含量值，二級(jí)結(jié)構(gòu)含量的明顯變化充分說(shuō)明CTC使PEP的結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。這些結(jié)果闡明了在分子結(jié)構(gòu)層面上CTC在胃中的作用機(jī)理，進(jìn)一步揭示金霉素(CTC)在人體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程及吸收特性，為新藥的研發(fā)和相關(guān)藥物的改性提供必要的信息。