Cy3標(biāo)記農(nóng)藥核酸適配體表面增強(qiáng)拉曼光譜法特異性檢測(cè)痕量啶蟲脒

滕淵潔，韋其真，劉文涵，劉江美，聶永惠，李 盼

浙江工業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，綠色化學(xué)合成技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，浙江 杭州 310032

引 言

農(nóng)藥及殘留主要有有機(jī)磷、 有機(jī)氯、 菊酯和氨基甲酸酯四大類，同類分子在結(jié)構(gòu)上具有一定的相似性，這給特定分析檢測(cè)帶來一定的困難。目前，國標(biāo)[1]規(guī)定的農(nóng)藥檢測(cè)方法主要有氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)等。在色質(zhì)聯(lián)用中，雖然QuEChERS法[2]可簡化前處理過程，30 min約可處理6個(gè)樣品，但色譜分離仍需較長時(shí)間，無法滿足現(xiàn)場大批量檢測(cè)需求。至于市場上農(nóng)藥殘留的快速檢測(cè)，雖然有酶標(biāo)儀、 顯色卡、 電化學(xué)速測(cè)儀等形式，但檢測(cè)原理均基于乙酰膽堿酯酶抑制法[3]，即利用農(nóng)藥對(duì)乙酰膽堿酯酶的活性抑制來間接判斷是否存在農(nóng)藥，但幾乎每種農(nóng)藥均對(duì)乙酰膽堿酯酶有抑制作用，因此存在專一性不高的問題。從而，有必要開發(fā)一種能夠?qū)崿F(xiàn)特異性的快速檢測(cè)農(nóng)藥殘留分子的方法。

適配體(Aptamer)[4]是指一類經(jīng)過篩選，能夠特異性結(jié)合靶向物質(zhì)的單鏈DNA或者RNA。目前，aptamer在分子檢測(cè)領(lǐng)域已經(jīng)發(fā)展形成了多種分析手段[5]，如比色法、 熒光法、 電化學(xué)法、 拉曼光譜法等，主要用于檢測(cè)蛋白、 微生物、 生物毒素、 有機(jī)污染物、 重金屬離子。近年來，陽性克隆篩選方法(SLECTIVE)及活性改造[6]越來越成熟，但利用aptamer方法進(jìn)行農(nóng)藥特效性檢測(cè)相對(duì)較少。目前，已報(bào)道具有aptamer特異性的農(nóng)藥分子有啶蟲脒[7]、 莠去津、 馬拉硫磷, 丙溴磷[8]及同時(shí)檢測(cè)甲拌磷、 丙溴磷、 水胺硫磷和氧(化)樂果的aptamer[9]等；但利用aptamer建立的特效性分析方法報(bào)道較少，僅見比色法[10-11]、 電化學(xué)阻抗法[12]、 表面增強(qiáng)拉曼光譜法(surface-enhanced Raman scattering，SERS)等。

選擇帶負(fù)電荷的聚丙烯酸鈉作為表面帶負(fù)電荷的銀溶膠的分散劑，制備了具有良好穩(wěn)定性和分散性的SERS基底材料。再通過選擇帶有正電荷的精胺分子先行中和含磷酸骨架的aptamer上的負(fù)電荷，三氫-吲哚菁類(Cy3)染料分子標(biāo)記的aptamer (Cy3-aptamer)更易吸附于帶負(fù)電荷的銀溶膠表面，而產(chǎn)生較強(qiáng)的SERS光譜。且Cy3-aptamer產(chǎn)生的拉曼強(qiáng)度的變化與啶蟲脒濃度存在一定的關(guān)系，從而實(shí)現(xiàn)了特異性檢測(cè)啶蟲脒分子的目的。同時(shí)為SERS法利用aptamer特異性快速檢測(cè)農(nóng)藥分子提供了強(qiáng)有力的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

LabRAM HR UV 800激光顯微拉曼光譜儀(法國HORIBA JOBIN YVON公司)，激發(fā)光源：632.81 nm He-Ne激光器；共焦孔徑300 μm，光柵線刻數(shù)為600 line·mm-1，物鏡：50倍長焦距鏡頭。

啶蟲脒(分析標(biāo)準(zhǔn)品，aladdin)；aptamer啶蟲脒：5’-TGTAATTTGTCTGCAGCGGTTCTTGATCGCTGACACCA-TATTATGAAGA-3’ (生工生物工程(上海)股份有限公司，平均分子量15 170.81)；Cy3-aptamer：5’-Cy3-TGTAATTTGTCTGCAGCGGTTCTTGATCGCTGACACCATA-TTATGAAGA-3’ (生工生物工程(上海)股份有限公司，平均分子量15 598.34)。聚丙烯酸鈉(平均分子量5 100)、 精胺(98%)、 AgNO3為化學(xué)純。HNO3、 NaCl、 Na3C6H5O7·2H2O、 KCl、 NaH2PO4·2H2O、 NaOH、 無水Na2SO4、 Na2HPO4·12H2O等均為分析純。HCl和H2SO4為優(yōu)級(jí)純。pH 7.4磷酸緩沖溶液(0.2 mol·L-1)由NaH2PO4·2H2O和Na2HPO4·12H2O混合配制而成，并含有0.1 mol·L-1的KCl。水為18.3 MΩ·cm超純水，由UP900型超純水器(韓國HUMAN公司)制得。

Aptamer啶蟲脒使用液的配制：移取 21 μL磷酸緩沖溶液，加入到含31.7 μg Aptamer啶蟲脒的試劑盒中，搖勻得0.1 mmol·L-1的Aptamer啶蟲脒儲(chǔ)備液，再將其逐級(jí)稀釋成1 μmol·L-1的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。同法配制Cy3-aptamer的使用液。

1.2 銀溶膠合成及保存

根據(jù)Lee和Meisel的方法[13]，稱取18 mg AgNO3，溶解于100 mL水中。加熱至沸，緩慢加入新配制的1%檸檬酸鈉3.0 mL。劇烈攪拌下繼續(xù)沸騰10 min，直到溶液顏色變?yōu)榛疑?。冷卻至室溫，取15 mL銀溶膠，分別加入0.3 mL不同濃度的聚丙烯酸鈉溶液，使合成的銀納米粒子分散在聚丙烯酸鈉中以進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn)選擇。聚丙烯酸鈉的濃度為0.05%保存效果最佳，裝入棕色瓶于4 ℃保存，至少可以保存60 d。

1.3 聚沉劑影響考察

取500 μL 0.01%聚丙烯酸鈉的銀溶膠，500 μL 80 mmol·L-1不同的聚沉劑(NaCl，KCl，NaOH，HNO3，H3PO4，H2SO4，HCl)和500 μL 4.886×10-4mol·L-1啶蟲脒溶液混合均勻，室溫下靜置10 min，比較不同聚沉劑條件下啶蟲脒的拉曼增強(qiáng)信號(hào)。

1.4 方法

Cy3-aptamer與精胺“顯色”反應(yīng)：取0.1 mol·L-1精胺5 μL，1 μmol·L-1Cy3-aptamer 100 μL，分別反應(yīng)5，10和15 min，再加100 μL銀溶膠和5 μL 0.16 mol·L-1聚沉劑，混勻后測(cè)定拉曼信號(hào)，選擇精胺與Cy3-aptamer反應(yīng)的最佳時(shí)間。

Cy3-aptamer檢測(cè)啶蟲脒并用精胺“顯色”反應(yīng)：取100 μL 1 μmol·L-1Cy3-aptamer，100 μL 0.5 mmol·L-1啶蟲脒溶液，分別反應(yīng)5，10，20和30 min，再加入0.1 mol·L-1精胺5 μL，反應(yīng)5 min，再加入100 μL銀溶膠、 5 μL 0.16 mol·L-1聚沉劑，混勻，分別測(cè)定其拉曼信號(hào)并比較，確定Cy3-aptamer和啶蟲脒反應(yīng)的最佳時(shí)間。

測(cè)定方法：取100 μL 1 μmol·L-1Cy3-aptamer，100 μL 0.25, 0.1, 0.075, 0.05, 0.01 μmol·L-1啶蟲脒溶液，反應(yīng)20 min，再加入0.1 mol·L-1精胺5 μL，反應(yīng)5 min，隨后加入100 μL銀溶膠、 5 μL 0.16 mol·L-1聚沉劑，混勻。樣品置于顯微激光拉曼光譜儀的物鏡視野下，調(diào)焦后進(jìn)行增強(qiáng)拉曼光譜測(cè)試，焦點(diǎn)聚焦于溶液表面。掃描范圍200～3 800 cm-1，光譜采集時(shí)間60 s，積分2次平均。

2 結(jié)果與討論

2.1 Cy3-aptamer-農(nóng)藥/精胺-銀溶膠SERS特異性檢測(cè)農(nóng)藥原理設(shè)計(jì)

利用aptamer對(duì)特定農(nóng)藥的特異性作用，以達(dá)到分離富集和特效選擇的目的。經(jīng)多次試驗(yàn)探索建立了測(cè)試方法：由于aptamer本身只有較弱的SERS信號(hào)，特將拉曼信號(hào)探針Cy3先與aptamer結(jié)合生成Cy3-aptamer，在精胺存在的情況下能在銀溶膠表面產(chǎn)生很好的SERS信號(hào)。當(dāng)測(cè)定農(nóng)藥時(shí)，先將Cy3-aptamer與測(cè)試液反應(yīng)，此時(shí)亦不能產(chǎn)生SERS信號(hào)，只有加入輔助劑精胺后才能測(cè)得較強(qiáng)的SERS信號(hào)；當(dāng)有特定農(nóng)藥存在時(shí)，SERS信號(hào)會(huì)發(fā)生減弱。可以利用不同的aptamer制備不同的Cy3-aptamer，同時(shí)利用不同的農(nóng)藥具有不同的拉曼譜峰可以達(dá)到進(jìn)一步選擇性測(cè)定的目的；采用不同的aptamer可以達(dá)到有針對(duì)性的測(cè)定特定的農(nóng)藥，最終達(dá)到針對(duì)性強(qiáng)的農(nóng)藥測(cè)定方法。

采用對(duì)農(nóng)藥啶蟲脒具有一定特異性的aptamer，并通過特殊制備將Cy3標(biāo)記進(jìn)入aptamer，其SERS檢測(cè)原理如圖1。

圖1 Cy3-aptamer用于SERS檢測(cè)農(nóng)藥啶蟲脒示意圖Fig.1 Schematic diagram of Cy3-aptamer applied in the specific SERS detection of acetamiprid

Cy3-aptamer與精胺分子作用，并吸附于銀溶膠表面產(chǎn)生較大的SERS信號(hào)；當(dāng)溶液中存在啶蟲脒時(shí)，Cy3-aptamer先與啶蟲脒反應(yīng)，再加入精胺形成SERS的“顯色”反應(yīng)，探針分子Cy3-aptamer與精胺結(jié)合的分子吸附于銀溶膠表面，由于部分探針分子Cy3-aptamer與啶蟲脒結(jié)合而使得SERS信號(hào)減弱。

2.2 銀溶膠穩(wěn)定性的改善

作為SERS的基底材料銀溶膠的穩(wěn)定性至關(guān)重要，為了提高銀溶膠的長期穩(wěn)定做了一些探索和改善。Lee法制備的銀溶膠表面因?yàn)镹a3C6H5O7·2H2O/檸檬酸過量，受其酸根包覆而帶負(fù)電荷?？紤]到膠體的穩(wěn)定和聚凝作用原理，在體系中加入帶負(fù)電的物質(zhì)可以使膠體穩(wěn)定。經(jīng)多次試驗(yàn)，加入聚丙烯酸鈉作為銀溶膠的分散劑，可以有效的保持所合成的銀納米粒子均勻分散在溶液中，并保持銀溶膠的穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)表明：制備的銀溶膠液中加入聚丙烯酸鈉濃度為0.05%時(shí)，于4 ℃棕色瓶中可以穩(wěn)定保存至少60 d。

2.3 不同聚沉劑對(duì)銀溶膠表面增強(qiáng)拉曼光譜的影響

測(cè)試時(shí)銀溶膠中加入電解質(zhì)，可使納米溶膠表面的電荷平衡改變而發(fā)生團(tuán)聚，局部表面等離子體共振發(fā)生疊加，從而形成SERS活性熱點(diǎn)，引起拉曼增強(qiáng)。不同類型的電解質(zhì)，對(duì)SERS信號(hào)有不同的影響。為了考察不同聚沉劑對(duì)銀溶膠SERS的影響，以SERS信號(hào)較弱的啶蟲脒分子為探針，對(duì)其在不同聚沉劑條件下的SERS進(jìn)行了測(cè)試，結(jié)果如圖2。

圖2 不同聚沉劑對(duì)SERS光譜的影響a: NaOH；b: NaCl；c：KCl；d: HCl；e: H2SO4；f: HNO3；g: H3PO4；聚沉劑濃度均為80 mmol·L-1；啶蟲脒濃度5×10-4 mol·L-1Fig.2 Effect of different aggregates on SERS spectraa: NaOH；b: NaCl；c：KCl；d: HCl；e: H2SO4；f: HNO3；g: H3PO4；the concentration of aggregates: 80 mmol·L-1；the concentration of acetamiprid：5×10-4 mol·L-1

2.4 不同聚沉劑對(duì)銀溶膠紫外-可見光譜的影響及表征

為了進(jìn)一步研究聚沉劑對(duì)銀溶膠的聚沉作用和影響，考察了加入160 mmol·L-1不同的聚沉劑11 min后對(duì)銀溶膠的紫外可見吸收光譜的變化[圖3(a)]。由圖3(a)可知，銀溶膠空白溶液(本底含0.01%聚丙烯酸鈉)[圖3(a)，a]的吸收峰位置在421.10 nm，加入聚沉劑后，聚沉劑都會(huì)使銀溶膠的吸光度減小。NaCl[圖3(a),b]，HCl[圖3(a),c]和KCl[圖3(a),d]的最大吸收峰分別在420.78，420.78和417.32 nm處，產(chǎn)生略微藍(lán)移。而加入堿和酸均會(huì)使吸收峰產(chǎn)生略微紅移。NaOH[圖3(a),h]移至421.65 nm。H3PO4[圖3(a),e]，HNO3[圖3(a),f]，H2SO4[圖3(a),g]分別移至421.65，421.65和422.51 nm。說明Cl離子加入，可能與表面附著的Ag離子結(jié)合，產(chǎn)生氯化銀，增大了電子的躍遷能級(jí)。而H+，OH-離子作用于銀溶膠表面，由于電荷效應(yīng)，使電子的躍遷能級(jí)減小。

圖3(a) 不同聚沉劑對(duì)銀溶膠紫外-可見吸收光譜的影響a: 空白；b: NaCl；c: HCl；d: KCl；e: H3PO4；f: HNO3；g: H2SO4；h: NaOH；本底為0.01%聚丙烯酸鈉Fig.3(a) UV-Vis spectra of sliver colloid affected by different aggregatesa: Blank；b: NaCl；c: HCl；d: KCl；e: H3PO4；f: HNO3；g: H2SO4；h: NaOH；blank is 0.01% sodium polyacrylate

圖3(b)為銀溶膠吸光度隨時(shí)間的變化圖，實(shí)驗(yàn)表明加入NaCl[圖3(a)，b], HCl[圖3(a)，c]，KCl[圖3(a)，d]對(duì)銀溶膠的吸光度的變化值影響相對(duì)較小，而加入H3PO4[圖3(a)，e]，HNO3[圖3(a)，f]和H2SO4[圖3(a)，g]具有類似的吸光度變化，而NaOH[圖3(a),h]吸光度變化最大。結(jié)果說明，聚沉速度在一定程度上影響了SERS檢測(cè)信號(hào)，但NaOH和H3PO4，HNO3和H2SO4的吸光度變化速度相似，SERS信號(hào)差異明顯，說明表面電荷性質(zhì)對(duì)SERS的增強(qiáng)信號(hào)起決定作用。因此，可以通過加入聚沉劑來改善銀溶膠表面的電荷狀況和提高表面增強(qiáng)拉曼光譜的信號(hào)，以達(dá)到高靈敏分析檢測(cè)分子的目的。

圖3(b) 不同聚沉劑加入時(shí)間對(duì)銀溶膠紫外-可見吸收光譜的影響a: NaCl；b：HCl；c：KCl；d：H3PO4；e：HNO3；f：H2SO4；g：NaOHFig.3(b) UV-Vis spectra of sliver colloid affected by the adding time of different aggregatesa: NaCl；b：HCl；c：KCl；d：H3PO4；e：HNO3；f：H2SO4；g：NaOH

2.5 Cy3-aptamer與精胺反應(yīng)時(shí)間的SERS最佳條件選擇

由于Cy3-aptamer磷酸骨架上帶有較多負(fù)電荷，經(jīng)試驗(yàn)加入帶有正電荷的輔助“顯色劑”精胺使其產(chǎn)生較強(qiáng)的SERS信號(hào)，并考察了反應(yīng)時(shí)間為5, 10, 15 min時(shí)的SERS圖(圖4)。在未加精胺的1 μmol·L-1Cy3-aptamer SERS圖4d中，可以看出Cy3指紋信息較少。推測(cè)主要是由于DNA骨架上的磷酸基團(tuán)所帶的負(fù)電荷強(qiáng)于其堿基上所帶的正電荷，而呈現(xiàn)酸性，即Cy3-aptamer帶負(fù)電，而聚丙烯酸鈉分散銀溶膠體系也帶負(fù)電，以致于Cy3-aptamer不能很好的吸附到銀溶膠表面。在加入帶正電荷的精胺(圖4a,b,c)后，可以觀察到明顯的Cy3指紋信息。表明，帶正電荷的精胺分子與DNA作用后，改變了DNA骨架上的帶電狀態(tài)，使其與銀溶膠能夠產(chǎn)生更好的結(jié)合，同時(shí)產(chǎn)生SERS效應(yīng)，并檢測(cè)出Cy3-aptamer的信號(hào)[14]。考察圖4精胺與aptamer的SERS信號(hào)與反應(yīng)時(shí)間關(guān)系，反應(yīng)時(shí)間對(duì)SERS影響不大，為了縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間選擇5 min為宜。

圖4 精胺和Cy3-aptamer不同反應(yīng)時(shí)間的SERS譜圖a: 5 min; b: 10 min; c: 15 min;d: 未加精胺1 μmol·L-1 Cy3-aptamer本底Fig.4 SERS spectra of different reaction time of spermine with Cy3-aptamera: 5 min; b: 10 min; c: 15 min; d: Background of 1 μmol·L-1 Cy3-aptamer without spermine

2.6 Cy3-aptamer與農(nóng)藥啶蟲脒反應(yīng)SERS最佳條件選擇

由于啶蟲脒與其aptamer有較強(qiáng)的親和作用，會(huì)與精胺在aptamer上形成競爭反應(yīng)，影響“顯色劑”精胺對(duì)Cy3的“顯色效應(yīng)”?？疾炝薈y3-aptamer與啶蟲脒不同反應(yīng)時(shí)間(5, 10, 20, 30 min)后，進(jìn)一步加入輔助“顯色劑”精胺反應(yīng)5 min時(shí)Cy3在銀溶膠表面產(chǎn)生SERS光譜的影響(圖5)。實(shí)驗(yàn)表明, 啶蟲脒與其aptamer反應(yīng)20 min時(shí)Cy3的SERS信號(hào)最大，推測(cè)啶蟲脒、 Cy3-aptamer及其配合物Cy3-aptamer-啶蟲脒存在一定的平衡解離關(guān)系，且在銀溶膠表面的吸附速率不同。由于啶蟲脒的濃度過量，小分子啶蟲脒首先占據(jù)銀表面，Cy3信號(hào)較弱，隨著時(shí)間推移，帶有精胺的Cy3-aptamer逐漸靠近銀表面，使得Cy3信號(hào)增強(qiáng)。超過20 min 信號(hào)下降，推測(cè)主要是由于分子在銀表面的堆積，使得光散射信號(hào)傳遞受阻，因此選擇20 min為最佳反應(yīng)時(shí)間。

圖5 Cy3-aptamer和啶蟲脒不同反應(yīng)時(shí)間的SERS光譜圖a：5 min；b：10 min；c：20 min；d：30 minFig.5 SERS spectra of different reaction time of Cy3-aptamer with acetamiprida：5 min；b：10 min；c：20 min；d：30 min

2.7 農(nóng)藥啶蟲脒與拉曼峰面積比值的關(guān)系

在所選條件下，測(cè)定了不同濃度的啶蟲脒溶液(0.25，0.1, 0.075, 0.05, 0.01 μmol·L-1)在Cy3-aptamer捕獲下的SERS圖[圖6(a)]。由圖6(a)可知隨著啶蟲脒濃度的增加，信標(biāo)分子Cy3 的SERS峰強(qiáng)度隨之下降。為了提高測(cè)定的可靠性，選擇了本底水分子作為內(nèi)標(biāo)[15]組成相對(duì)強(qiáng)度。以1 392 cm-1處特征峰的拉曼峰面積與3 000～3 700 cm-1處水的OH伸縮振動(dòng)峰的面積的比值與啶蟲脒濃度對(duì)數(shù)作關(guān)系圖[圖6(b)]。經(jīng)測(cè)定，銀溶膠Cy3-aptamer方法檢測(cè)啶蟲脒的濃度線性范圍為1×10-8～2.5×10-7mol·L-1，線性回歸方程為Acy3/Awater=-0.306 5LogC-1.876，相關(guān)系數(shù)r=0.971 6。

圖6 不同濃度的啶蟲脒對(duì)SERS光譜的影響及相對(duì)強(qiáng)度的關(guān)系圖條件：啶蟲脒濃度 0.25, 0.1, 0.075, 0.05, 0.01 μmol·L-1Fig.6 SERS spectra of acetamiprid, 0.25, 0.1, 0.075, 0.05, 0.01 μmol·L-1, insert: linearship between logarithm of concentrations and the ratio of acetamiprid (1 392 cm-1) and water, A: area

2.8 實(shí)際樣品檢測(cè)

用采樣器采集杭州市上塘河水樣，在測(cè)試之前，樣品先用0.45 μm微濾膜過濾，以去除顆粒性懸浮物。實(shí)際水樣經(jīng)本法檢測(cè)未檢出。將1.0×10-7mol·L-1的啶蟲脒標(biāo)準(zhǔn)樣品加入到水樣中，重復(fù)測(cè)量三次，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=9.99%, 回收率為97.4%，97.5%，99.4%。

3 結(jié) 論

采用農(nóng)藥啶蟲脒aptamer并標(biāo)記拉曼光譜信號(hào)分子Cy3制備的Cy3-aptamer探針分子，能夠很好的與精胺作用在銀溶膠表面吸附而產(chǎn)生基準(zhǔn)SERS光譜信號(hào)。啶蟲脒與Cy3-aptamer探針分子能夠形成特異性反應(yīng)，減少了Cy3-aptamer與精胺的作用，而減弱了SERS的信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)了特異性分析測(cè)定農(nóng)藥啶蟲脒分子的目的。利用此方法可以實(shí)現(xiàn)其他農(nóng)藥或其他化合物的特異性分析檢測(cè)，具有一定的應(yīng)用前景和研究意義。