轉(zhuǎn)基因棉生長前期不同葉位葉片對甜菜夜蛾種群增長的影響

楊旸，謝修慶，蘇宏華，楊益眾*

（1.揚州大學(xué)園藝與植物保護學(xué)院，江蘇 揚州225009；2. 江蘇省連云港市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，江蘇 連云港222023）

甜菜夜蛾（Spodoptera exiguaHübner），又名貪夜蛾、玉米葉夜蛾，屬鱗翅目、夜蛾科，是一種長距離遷飛、雜食性農(nóng)業(yè)害蟲[1-2]。 它起源于南亞，后廣泛分布于北緯57°至南緯40°之間的地區(qū)，能危害170 多種作物[3-4]，除甜菜和多種十字花科蔬菜外，還危害棉花、玉米、大豆、苜蓿等，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失[5-6]。20 世紀(jì)80 年代以前，該害蟲僅在我國的局部地區(qū)零星發(fā)生，且以危害蔬菜作物為主。 但自20 世紀(jì)80 年代中期特別是進入90 年代以后， 隨著設(shè)施農(nóng)業(yè)的興起和蔬菜大棚面積的不斷擴大，棉花成為甜菜夜蛾的重要寄主之一[7-8]。

根據(jù)國際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用咨詢服務(wù)中心（ISAAA）統(tǒng)計，2018 年中國轉(zhuǎn)基因作物種植面積位居全球第七， 其中， 轉(zhuǎn)基因棉花應(yīng)用率達到95%，包括轉(zhuǎn)基因抗蟲棉。中國自20 世紀(jì)90 年代初開始研究抗蟲基因以來， 通過遺傳轉(zhuǎn)化的方法，得到3 類使棉花獲得抗蟲功能的基因，其中來源于蘇云金芽孢桿菌 （Bacillus thuringiensis,Bt）的殺蟲蛋白基因應(yīng)用最為廣泛。 當(dāng)前，大規(guī)模投入生產(chǎn)的國產(chǎn)轉(zhuǎn)基因抗蟲棉主要為單價抗蟲棉和雙價抗蟲棉， 其遺傳轉(zhuǎn)化的抗蟲基因為Bt殺蟲基因cry1A和豇豆胰蛋白酶抑制劑基因Cp-TI[9]。 隨著這些轉(zhuǎn)基因棉的推廣，其對甜菜夜蛾影響的研究報道不斷增加。周秋霞[10]以抗Bt（cry1Ac）甜菜夜蛾品系為研究對象，初步闡明了該蟲對溫濕度等非生物因子和寄主植物等生物因子的適應(yīng)性變化。 亦有學(xué)者系統(tǒng)研究了轉(zhuǎn)cry1Ac/1Ab基因、 轉(zhuǎn)cry1Ac＋cry2Ab基因棉花對甜菜夜蛾存活、生長發(fā)育、營養(yǎng)指標(biāo)及中腸酶活性的影響[11-12]。 雖然有研究報道轉(zhuǎn)基因棉不同組織器官對甜菜夜蛾種群具有抗性[13]，但關(guān)于不同轉(zhuǎn)基因抗蟲棉不同葉位葉片對甜菜夜蛾種群的影響研究鮮見。 因此，研究甜菜夜蛾在不同轉(zhuǎn)基因棉花品種及葉位上的發(fā)生為害，分析并探討其在棉花等作物上的發(fā)展態(tài)勢， 對該害蟲的預(yù)警和防范，以及轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的持續(xù)推廣均具有重要的現(xiàn)實意義。 鑒于甜菜夜蛾是長江中下游植棉區(qū)棉田生長前中期的重要食葉性害蟲，且以取食棉花中上部葉片為主，本研究將通過研究轉(zhuǎn)基因棉不同葉位葉片對甜菜夜蛾的影響，并以實驗種群生命表的形式加以描述，來確定不同品種轉(zhuǎn)基因棉對甜菜夜蛾的抗性， 為甜菜夜蛾的有效防治提供參考。

甜菜夜蛾卵塊由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所提供，飼養(yǎng)甜菜夜蛾用的人工飼料參照李騰武等[14]的方法進行配制。

主要飼養(yǎng)條件：溫度（27±1）℃；相對濕度70%±10%；光周期（光暗比）14 h∶10 h。

供試棉花品種： 轉(zhuǎn)cry1A基因棉國抗12（GK12），親本（常規(guī)對照，下同）為泗棉3 號；轉(zhuǎn)cry1Ac基 因 棉 新 棉33B， 親 本 為DP5415；轉(zhuǎn)cry1A＋CpTI基因棉SGK321，親本為石遠321。

6 個棉花品種均在4 月中旬播種育苗，5 月下旬移栽于揚州大學(xué)實驗農(nóng)牧場試驗田內(nèi)，每個品種種植200 m2。 供試棉葉采自棉花苗期至現(xiàn)蕾期的植株。

在室內(nèi)將甜菜夜蛾剛孵化的幼蟲接入培養(yǎng)皿中（直徑15 cm），每皿25 頭，分別用GK12、泗棉3 號、SGK321、石遠321、新棉33B 和DP5415的倒三葉、倒六葉、倒九葉飼養(yǎng)，葉柄以脫脂棉保濕，并以一層保鮮膜加白紙為皿蓋，以防幼蟲逃逸。1 齡集中飼喂，2 齡后放入指形管（直徑2 cm，高8 cm）單頭飼喂，每天定時觀察并記載幼蟲的蛻皮和存活情況，適時更換新鮮葉片，清理排泄物。 幼蟲化蛹當(dāng)天用萬分之一電子天平稱量蛹質(zhì)量，并作好標(biāo)記，每天觀察成蟲的羽化情況。 將當(dāng)天羽化的雌雄成蟲配對后接入罐頭瓶 （直徑8 cm，高度12 cm），1 瓶1 對，瓶內(nèi)放入蠟紙供其產(chǎn)卵，同時將蘸取體積分?jǐn)?shù)10%蜂蜜水后的棉花球放入，以供成蟲補充營養(yǎng)，瓶口扎上紗布；每天更換蠟紙并統(tǒng)計產(chǎn)卵量及成蟲死亡情況，至成蟲全部死亡止。 雌成蟲產(chǎn)卵后，將蠟紙取出，剪下卵塊。 在整個研究過程中，持續(xù)觀察并統(tǒng)計幼蟲死亡率、發(fā)育歷期、化蛹率、蛹質(zhì)量、蛹歷期、羽化率、產(chǎn)卵量、成蟲壽命等生物學(xué)參數(shù)[15-16]。 每個試驗處理均重復(fù)3 次。

在產(chǎn)卵盛期， 挑選大小適中的初產(chǎn)卵塊，接入放有6 種棉葉的培養(yǎng)皿（直徑15 cm）中，每皿300 粒左右，重復(fù)3 次，孵化期間每天檢查2 次，除去未受精卵，統(tǒng)計孵化率。 幼蟲期用原處理中孵化的幼蟲100 頭，飼養(yǎng)幼蟲方法與條件同上。

參照張小麗等[16]、吳坤君等[17]、韓蘭芝等[18]的方法，并借助Morris-Watt 種群趨勢指數(shù)模型I＝S1·S2·S3……Sn·F·PF·P♀[19-20]編制甜菜夜蛾實驗種群生命表。 式中，I為種群趨勢指數(shù)，S1，S2，S3……Sn為生命表中各期致死因子作用后的平均存活率，P♀為雌性概率，F(xiàn)指標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)卵量，PF為達標(biāo)卵量概率。

相關(guān)數(shù)據(jù)的平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)誤采用SPSS 25.0軟件進行計算。 取食轉(zhuǎn)基因棉品種不同葉位葉片對甜菜夜蛾生長發(fā)育及繁殖的影響與親本間的差異顯著性檢驗采用獨立樣本t檢驗[21]。 在進行甜菜夜蛾取食同一棉花品種不同葉位葉片對其生長發(fā)育及繁殖影響的方差分析時，使用單因素方差分析（ANOVA），并選擇Tukey’s HSD 法進一步檢驗。

表1 取食轉(zhuǎn)基因棉不同葉位葉片甜菜夜蛾幼蟲和蛹的死亡率及其與親本的差異比較Table 1 Comparison of the mortality of larvae and pupae of Spodoptera exigua fed on different leaves of transgenic cotton and their differences with their parents

進一步分析品種間的差異， 發(fā)現(xiàn)取食新棉33B 倒九葉的蛹質(zhì)量顯著高于其對照材料DP5415，取食新棉33B 倒六葉和取食SGK321 倒三葉的蛹質(zhì)量與其相應(yīng)對照材料（DP5415、石遠321）差異不顯著，而其他均表現(xiàn)為取食常規(guī)棉對照的蛹質(zhì)量顯著高于對應(yīng)的轉(zhuǎn)基因棉品種（表2）。

表2 取食轉(zhuǎn)基因棉不同葉位葉片甜菜夜蛾的蛹質(zhì)量及其與親本的差異比較Table 2 Comparison of the pupae weight of Spodoptera exigua fed on different leaves of transgenic cotton and their differences with their parents

由表3 結(jié)果可見，在轉(zhuǎn)基因棉與常規(guī)對照棉之間，僅取食轉(zhuǎn)基因棉品種GK12 倒三葉、新棉33B 倒六葉和SGK321 倒三葉、倒九葉的甜菜夜蛾單雌產(chǎn)卵量與其親本相比差異顯著。 比較甜菜夜蛾取食同一品種不同葉位間的單雌產(chǎn)卵量后發(fā)現(xiàn)：只有取食新棉33B 倒九葉的甜菜夜蛾產(chǎn)卵量顯著高于倒三葉和倒六葉，其他2 個轉(zhuǎn)基因棉品種不同葉位間其產(chǎn)卵量均沒有顯著差異；取食親本泗棉3 號倒三葉、DP5415 倒六葉和石遠321倒九葉的單雌產(chǎn)卵量均高于同品種的其他葉位（表3）。

甜菜夜蛾實驗種群生命表組建的結(jié)果（表4）表明，取食3 種轉(zhuǎn)基因棉及其親本不同葉位葉片的種群趨勢指數(shù)（I）遠大于1，說明取食不同棉花品種的甜菜夜蛾種群均處于增長態(tài)勢。 分析發(fā)現(xiàn)，除取食GK12 倒三葉、倒九葉的甜菜夜蛾種群趨勢指數(shù)略高于親本泗棉3 號的相同葉位外，其他均表現(xiàn)為取食常規(guī)對照棉的甜菜夜蛾種群趨勢指數(shù)高于對應(yīng)的轉(zhuǎn)基因棉品種，且一些取食轉(zhuǎn)基因棉品種的甜菜夜蛾種群趨勢指數(shù)只有對照的60%～70%。 另外，隨葉位下移，取食GK12的甜菜夜蛾種群趨勢指數(shù)總體呈現(xiàn)下降趨勢，取食新棉33B 的甜菜夜蛾種群趨勢指數(shù)呈先增后減的趨勢，取食SGK321 的甜菜夜蛾種群趨勢指數(shù)呈先減后增的趨勢，但取食轉(zhuǎn)基因棉花品種的甜菜夜蛾種群均呈增長狀態(tài)（I＞1）。

棉花是甜菜夜蛾的重要寄主之一[7-8]，隨著轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的推廣，分析并探討其在不同轉(zhuǎn)基因棉品種上的發(fā)展態(tài)勢，對該害蟲的預(yù)警和防范有重要的現(xiàn)實意義。

表3 取食轉(zhuǎn)基因棉不同葉位葉片甜菜夜蛾的單雌產(chǎn)卵量及其與親本的差異比較Table 3 Comparison of the fecundity per female of Spodoptera exigua fed on different leaves of transgenic cotton and their differences with their parents

比對后發(fā)現(xiàn)： 甜菜夜蛾取食GK12 倒三葉、倒九葉的幼蟲和蛹累計死亡率與親本間差異顯著，這與長江中下游大面積推廣種植的國產(chǎn)單價轉(zhuǎn)基因抗蟲棉遭遇甜菜夜蛾嚴(yán)重危害的情形相一致[9,22]。取食SGK321 不同葉位葉片的甜菜夜蛾累計死亡率均顯著高于親本，這表明復(fù)合性狀的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉對毒殺甜菜夜蛾有一定的效果[23]。在今后的研究工作中，一方面要系統(tǒng)測定棉花全生育期不同葉位葉片體內(nèi)的毒蛋白表達量，另一方面要系統(tǒng)探討甜菜夜蛾在棉花不同生育時期的種群增長動態(tài)。 考慮到毒蛋白對甜菜夜蛾幼蟲的影響也許存在后效應(yīng)，本研究中關(guān)于甜菜夜蛾的存活率沒有將幼蟲與蛹分開計算，這在以后的研究中需要進一步優(yōu)化。

取食GK12 倒三葉、 新棉33B 倒六葉和SGK321 倒三葉、 倒九葉的甜菜夜蛾單雌產(chǎn)卵量與其親本相比差異顯著。 毒蛋白的影響可能在后續(xù)蟲態(tài)中還有所表現(xiàn)。 但由于本研究沒有關(guān)注存活甜菜夜蛾成蟲的雌雄比和雌蟲壽命等生物學(xué)參數(shù)，因此不能推斷是因為死亡率上升而導(dǎo)致雌蟲數(shù)量減少所引起的產(chǎn)卵量下降、還是由于毒性的后效應(yīng)導(dǎo)致雌蟲產(chǎn)卵量減少，這在以后的研究中值得深入研究。

甜菜夜蛾取食同一棉花品種不同葉位后的分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，幼蟲至蛹階段的死亡率在同一轉(zhuǎn)基因棉品種不同葉位之間存在差異： 取食GK12倒三葉的死亡率顯著低于倒六葉， 取食SGK321倒九葉的死亡率顯著低于倒三葉、倒六葉。 蛹質(zhì)量及產(chǎn)卵量的結(jié)果顯示： 除取食親本材料DP5415 和泗棉3 號外， 甜菜夜蛾取食其他棉花品種的葉位越低， 其蛹質(zhì)量越高； 除取食GK12及其親本泗棉3 號外，甜菜夜蛾取食其他品種棉花的葉位越低，整體上產(chǎn)卵量較高。 上述結(jié)果反映甜菜夜蛾取食的棉花葉位越低，越利于該種群的發(fā)展。 至于取食棉花葉位影響甜菜夜蛾蛹質(zhì)量與產(chǎn)卵量的機理，還需要進一步闡明。

種群增長趨勢指數(shù)是由各期存活率和成蟲生殖力構(gòu)成的[24]。 實驗種群生命表的分析結(jié)果顯

示，與常規(guī)棉對照相比，轉(zhuǎn)基因棉GK12 不能抑制甜菜夜蛾種群的增長，新棉33B、SGK321 對甜菜夜蛾種群的增長有一定的抑制作用，取食個別葉位后甜菜夜蛾的種群趨勢指數(shù)比對照常規(guī)棉品種降低了30%～40%，與這些品種的各蟲態(tài)累積存活率下降、成蟲達標(biāo)卵量概率（PF值）下降有關(guān) （比如倒三葉的新棉33B 與DP5415 之間、倒九葉的SGK321 與親本石遠321 之間）。 但本研究認(rèn)為，雖然取食轉(zhuǎn)基因棉花品種對甜菜夜蛾的種群有一定的抑制作用，但這種抑制不影響甜菜夜蛾的種群增長（I＞＞1）。

表4 取食不同葉位葉片的甜菜夜蛾實驗種群生命表Table 4 The experimental population life table of S. exigua feeding on leaves of different leaf positions

進入21 世紀(jì)以來， 甜菜夜蛾已逐步成長江中下游植棉區(qū)棉花上的重要食葉性害蟲，在棉花生長的前中期對棉花上中部葉片的為害越來越明顯。 本研究中，甜菜夜蛾取食棉花現(xiàn)蕾期前后的上部葉片后，其種群趨勢指數(shù)均大于1。表明棉花上中部葉片均是甜菜夜蛾的嗜食部位。 肖留斌等測定了8 種轉(zhuǎn)基因抗蟲棉葉片中Bt毒蛋白的含量，結(jié)果表明8 個轉(zhuǎn)基因棉品種不同部位葉片的毒蛋白含量呈現(xiàn)頂葉最高、功能葉次之、老葉含量最低的趨勢[25]。 也有研究者測試了轉(zhuǎn)基因抗蟲棉Bt毒蛋白含量的時空變化，指出轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉根、莖和葉片等組織器官殺蟲蛋白表達量在棉花不同生育時期有顯著差異， 順序為葉＞鈴、花蕊、花萼、蕾＞花瓣＞苞葉[26]。邢朝柱等采用酶鏈免疫法測定了轉(zhuǎn)基因棉花鈴期不同器官的Bt蛋白含量， 結(jié)果同樣表明轉(zhuǎn)基因棉體內(nèi)的Bt蛋白含量表現(xiàn)為功能葉＞幼鈴＞苞葉、老葉[27]。雖然有大量轉(zhuǎn)基因棉Bt毒蛋白含量時空動態(tài)的研究報道，但各品種棉花不同生育時期、不同葉位葉片中毒蛋白含量變化的研究不多，這有待結(jié)合甜菜夜蛾種群的增長動態(tài)探討。 同時，取食轉(zhuǎn)基因棉花品種為什么會影響甜菜夜蛾蛹的存活率和成蟲的達標(biāo)卵量概率，其機理是什么，以及這種毒性的后效應(yīng)對甜菜夜蛾種群衰減的貢獻有多大，需要在今后深入闡釋。

實驗種群生命表的分析結(jié)果還表明，盡管取食轉(zhuǎn)基因棉的甜菜夜蛾種群趨勢指數(shù)總體低于相應(yīng)的親本，但種群趨勢指數(shù)遠大于1，表明該害蟲種群在轉(zhuǎn)基因棉花種植區(qū)仍將呈快速增長態(tài)勢[24]，需要密切關(guān)注。雖然在長江中下游棉區(qū)甜菜夜蛾種群的暴發(fā)與該害蟲的遷飛擴散有關(guān)，也與一個地區(qū)棉花和大棚蔬菜面積的配比有關(guān)，但甜菜夜蛾在棉田的發(fā)生動向值得警覺。 有研究發(fā)現(xiàn)， 隨著甜菜夜蛾在棉花上持續(xù)危害時間的延長，其種群增長的差異在常規(guī)棉與轉(zhuǎn)基因棉花間有縮小的趨勢[16]。

取食本研究所選取的3 類轉(zhuǎn)基因棉花品種的不同葉位葉片后， 甜菜夜蛾幼蟲和蛹死亡率、蛹質(zhì)量及產(chǎn)卵量雖受一定的影響，但葉位間不存在明顯的變化趨勢。 雖取食轉(zhuǎn)基因棉GK12 和SGK321 葉片對甜菜夜蛾種群增長有一定的抑制作用，但其種群趨勢指數(shù)均大于1，表明其種群仍呈增長趨勢；因此，生產(chǎn)上應(yīng)進一步加強棉田甜菜夜蛾種群動態(tài)的監(jiān)測，并逐步建立起防范甜菜夜蛾種群暴發(fā)的應(yīng)急機制。