大乳頭水螅增殖細(xì)胞核抗原基因的克隆及再生進(jìn)程中的表達(dá)分析

吳香恒 程秀珍 王茹夢(mèng) 段麗麗 潘紅春

(安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,重要生物資源保護(hù)與利用研究安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,生物環(huán)境與生態(tài)安全安徽省高校省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,蕪湖 241000)

再生是生物的基本特性和本能,生物體的一部分因自然損傷或人為切割丟失后其自身能進(jìn)行一定程度的形態(tài)和功能的重建[1]。動(dòng)物的再生能力可分為3個(gè)層次,最基礎(chǔ)的為組織層次的再生,如皮膚組織的創(chuàng)傷愈合;其次為器官層次的再生,如兩棲綱有尾類幼體或成體的附肢或尾部被切斷后可再生出失去的部分;最強(qiáng)的為整體層次的再生[2],如1個(gè)水螅個(gè)體被橫切為兩段,這兩部分可分別再生成為兩個(gè)個(gè)體。再生現(xiàn)象在進(jìn)化地位不同的動(dòng)物中均普遍存在,但不同動(dòng)物類群之間再生能力的差別較大[3]。進(jìn)化地位較高等的動(dòng)物類群已喪失器官及整體層次再生能力,尚保留一定程度的組織再生能力;而進(jìn)化地位較低等的動(dòng)物再生能力比較強(qiáng),其中一部分類群如海綿、水螅和渦蟲(chóng)等具備整體層次的再生能力。淡水水螅具有在實(shí)驗(yàn)室易大規(guī)模培養(yǎng)、無(wú)性繁殖速度快等優(yōu)點(diǎn),已成為動(dòng)物再生的細(xì)胞和分子機(jī)制研究的模式生物[4]。

水螅強(qiáng)再生能力的主要物質(zhì)基礎(chǔ)是其體內(nèi)存在的大量可塑性強(qiáng)的細(xì)胞[5],但這些細(xì)胞是通過(guò)去分化,還是通過(guò)有絲分裂產(chǎn)生新生細(xì)胞參與再生進(jìn)程,目前未有定論[1,6]。細(xì)胞去分化進(jìn)程的檢測(cè)目前在技術(shù)上較為困難[7],因此追蹤和檢測(cè)水螅再生進(jìn)程中細(xì)胞分裂及DNA復(fù)制相關(guān)指標(biāo)來(lái)反映細(xì)胞增殖活動(dòng)是可行的切入點(diǎn)[8]。增殖細(xì)胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen,PCNA)是與DNA復(fù)制直接相關(guān)的DNA聚合酶δ的一種輔助蛋白質(zhì)[9]。PCNA蛋白只在增殖細(xì)胞中表達(dá),因此,PCNA蛋白被廣泛用作腫瘤細(xì)胞等活躍增殖細(xì)胞的監(jiān)測(cè)標(biāo)記物[10]?；诖?本研究首先克隆了大乳頭水螅(Hydra magnipapillata)PCNA基因的cDNA序列,再利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了PCNA重組蛋白;以該重組蛋白為抗原制備了PCNA多克隆抗體,并采用實(shí)時(shí)定量PCR (quantitative Real-time PCR,qPCR)及免疫印跡分析(Western blotting assay,WB)方法檢測(cè)了水螅頭部再生進(jìn)程中PCNA表達(dá)動(dòng)態(tài)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

大乳頭水螅(H. magnipapillata)原種采集于重慶市郊區(qū)濕地,挑取單只水?；铙w標(biāo)本通過(guò)無(wú)性繁殖建立大乳頭水螅單克隆無(wú)性繁殖系[11]。

1.2 大乳頭水螅SMART RACE cDNA文庫(kù)的建立、5′RACE及3′RACE

首先使用Clustal 2.0軟件[12]比對(duì)3種刺胞動(dòng)物(GenBank登錄號(hào)分別為: HAAD01005160、KT452624和LSMT01000220)PCNA基因cDNA序列,再根據(jù)比對(duì)后篩選出的保守序列設(shè)計(jì)用于RACE反應(yīng)的引物5′PCNA及3′PCNA(表1)。從上述大乳頭水螅單克隆無(wú)性繁殖系中取50只水螅個(gè)體,饑餓處理2d后先提取其總RNA,再?gòu)闹蟹蛛x和純化mRNA[11]。RACE cDNA文庫(kù)制備、5′RACE及3′RACE相關(guān)實(shí)驗(yàn)操作均按SMART RACE cDNA Amplification Kit(Clontech,美國(guó))說(shuō)明書(shū)進(jìn)行[11]。

1.3 PCNA基因全長(zhǎng)cDNA序列的克隆

為擴(kuò)增大乳頭水螅PCNA基因全長(zhǎng)cDNA序列,基于5′RACE和3′RACE產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)一對(duì)引物PCNA-F及PCNA-R(表1)。PCR產(chǎn)物采用TA克隆試劑盒(TaKaRa,日本)進(jìn)行分子克隆,陽(yáng)性克隆經(jīng)測(cè)序鑒定后擴(kuò)大培養(yǎng),進(jìn)一步提取重組質(zhì)粒pMD18-T-PCNA備用。

1.4 生物信息學(xué)分析

參考Pan等[11]的方法進(jìn)行大乳頭水螅PCNA氨基酸序列預(yù)測(cè)、PCNA蛋白二級(jí)及三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)。另外,為獲得同源蛋白質(zhì)氨基酸序列,進(jìn)行BLAST分析(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)[11];再通過(guò)Clustal 2.0軟件將大乳頭水螅PCNA氨基酸序列與其同源蛋白質(zhì)氨基酸序列數(shù)據(jù)一起進(jìn)行比對(duì)[11]?；赑CNA氨基酸序列數(shù)據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生分析時(shí),外群為2個(gè)植物界的同源序列,內(nèi)群為動(dòng)物界的29個(gè)同源序列。采用Modeltest 3.7篩選建樹(shù)參數(shù)模型后[13],再分別使用PAUP 4.0b10及MrBayes 3.2.3軟件重建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)[14—16]。

表 1 本文所用引物序列Tab.1 Primers used in the study

1.5 PCNA基因的原核表達(dá)及重組蛋白的純化、濃縮與鑒定

首先基于PCNA蛋白二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)進(jìn)行其抗原表位分析[17],再參考抗原表位分析結(jié)果把大乳頭水螅PCNA基因編碼區(qū)cDNA序列第67至第657位點(diǎn)的片段確定為原核表達(dá)的靶基因。根據(jù)原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28b(+)酶切位點(diǎn)及靶基因序列特征設(shè)計(jì)及合成引物PE-PCNA-F(含BamH Ⅰ酶切位點(diǎn))及PE-PCNAR(含Hind Ⅲ酶切位點(diǎn),表1),繼而通過(guò)由質(zhì)粒pET-28b(+)和E. coliBL21(DE3)組成的原核表達(dá)系統(tǒng)[18]制備重組PCNA蛋白。重組蛋白通過(guò)親和層析Ni柱試劑盒(Qiagen,德國(guó))純化,進(jìn)而通過(guò)離心方法濃縮重組蛋白,再參照Pan等[18]的方法測(cè)定重組蛋白N末端15個(gè)氨基酸殘基的序列以鑒定該重組蛋白。

1.6 多克隆抗體制備

用于免疫的新西蘭兔(約5 kg)分為免疫組(2只)與對(duì)照組(1只),參照張行等[19]的方法用重組PCNA蛋白免疫實(shí)驗(yàn)兔,采用ELISA試劑盒(默沙克生物,中國(guó))檢測(cè)抗血清效價(jià),最后參照Koolivand等[20]的方法從抗血清中分離PCNA多克隆抗體。

1.7 大乳頭水螅頭部再生進(jìn)程中PCNA表達(dá)分析

大乳頭水螅的切割手術(shù)及頭部再生實(shí)驗(yàn)選取饑餓48h無(wú)芽體的水螅個(gè)體進(jìn)行再生實(shí)驗(yàn),用手術(shù)刀在每只水螅個(gè)體靠近垂唇占水螅體長(zhǎng)(垂唇與基盤(pán)之間的總長(zhǎng)度)1/5處切斷,身體前段丟棄,身體后段用于頭部再生實(shí)驗(yàn)(圖1)。第一批總共270只水螅進(jìn)行切割手術(shù),把得到的水螅身體后段轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)液,并放進(jìn)黑暗的培養(yǎng)箱[溫度(25±0.5)℃]進(jìn)行再生實(shí)驗(yàn)。為準(zhǔn)備qPCR的實(shí)驗(yàn)材料,在切割手術(shù)后0、8h、16h、24h、32h、40h、48h、56h及64h時(shí)間段分別取30只再生體放入Trizol溶液(生工生物,中國(guó))保存(分裝在3個(gè)1.5 mL離心管,每管放0.5 mL Trizol溶液和10只水螅再生體)。此外,第二批總共540只水螅進(jìn)行切割手術(shù),把得到的水螅身體后段轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)液,并放進(jìn)黑暗的培養(yǎng)箱[溫度(25±0.5)℃]進(jìn)行再生實(shí)驗(yàn)。為準(zhǔn)備Western blotting的實(shí)驗(yàn)材料,在切割手術(shù)后0、8h、16h、24h、32h、40h、48h、56h及64h時(shí)間段分別取60只再生體放入液氮中保存(分裝在3個(gè)1.5 mL凍存管,每管放20只水螅再生體)。

qPCR分析首先基于大乳頭水螅PCNA基因編碼區(qū)序列設(shè)計(jì)用于qPCR的一對(duì)引物(表1),第一鏈cDNA通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(生工生物,中國(guó))合成,再通過(guò)CFX96-qPCR系統(tǒng)(Bio-Rad,美國(guó))和SYBR?Premix ExTaq? Kit(TaKaRa,日本)進(jìn)行qPCR反應(yīng)[21]。每個(gè)qPCR反應(yīng)設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù),以大乳頭水螅Actin基因作為內(nèi)參(表1)。2-ΔΔCt法進(jìn)行原始數(shù)據(jù)處理[22],運(yùn)用SSPS 22.0進(jìn)行單因素方差分析,P＜0.05設(shè)定為差異顯著。

Western blotting分析通過(guò)Western Blotting試劑盒(百奧萊博,中國(guó))進(jìn)行Western Blotting檢測(cè)[19,23],使用ECL試劑盒(碧云天,中國(guó))進(jìn)行顯色反應(yīng)。以Actin為內(nèi)參蛋白,所用大乳頭水螅Actin多克隆抗體為本實(shí)驗(yàn)室自備。所有Western Blotting實(shí)驗(yàn)均設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù),運(yùn)用SSPS 22.0進(jìn)行單因素方差分析,P＜0.05設(shè)定為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 大乳頭水螅PCNA基因cDNA及編碼蛋白氨基酸序列分析

本研究首先進(jìn)行了3′RACE及5′RACE,再根據(jù)RACE產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)特異性引物通過(guò)分子克隆方法獲得了總長(zhǎng)為1240 bp的大乳頭水螅PCNA基因cDNA序列(GenBank登錄號(hào): MK123983),其中包括101 bp的5′非編碼區(qū),302 bp的3′非編碼區(qū)及837 bp的編碼區(qū),編碼的蛋白質(zhì)預(yù)測(cè)分子量為

30.93 kD。

與人類PCNA氨基酸序列比對(duì)結(jié)果表明,二者間完全保守位點(diǎn)為156個(gè),氨基酸序列保守性占比約56%。另外,基于分子系統(tǒng)發(fā)生分析的結(jié)果表明,以植物界2個(gè)物種PCNA序列為外群,動(dòng)物界框架中拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基本符合基于形態(tài)學(xué)的各種動(dòng)物類群間系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系,其中大乳頭水螅PCNA所在的刺胞動(dòng)物支系與扁形動(dòng)物支系聚合成一單系群,該單系群位于系統(tǒng)樹(shù)的基部(圖2)。

蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示大乳頭水螅PCNA包含36.20%的α-螺旋、24.73%的β-折疊、5.38%的β-轉(zhuǎn)角及33.69%的無(wú)規(guī)則卷曲線。SWISS-MODEL同源建模結(jié)果顯示該蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)整體形似啞鈴,其中α-螺旋和β-折疊分別位于啞鈴狀結(jié)構(gòu)縱軸方向的兩側(cè)。

圖1 切割手術(shù)前及切割手術(shù)后水螅的形態(tài)Fig.1 The morphology of H.magnipapillata before and after operation

2.2 大乳頭水螅PCNA基因的原核表達(dá)及多克隆抗體制備

根據(jù)抗原表位預(yù)測(cè)結(jié)果(圖3A),再結(jié)合相關(guān)區(qū)域cDNA序列特征,選擇了大乳頭水螅PCNA基因編碼區(qū)cDNA序列第67位點(diǎn)至657位點(diǎn)的片段為原核表達(dá)的靶區(qū)域。DNA測(cè)序及雙酶切的結(jié)果均證實(shí)本研究成功制備了原核表達(dá)重組質(zhì)粒pET-28b(+)-PCNA(圖3B),細(xì)胞內(nèi)含有pET-28b(+)-PCNA的E.coliBL21(DE3)菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后成功表達(dá)重組PCNA蛋白(圖3C),其分子量與預(yù)期大小(26.84 kD)接近。經(jīng)優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件后發(fā)現(xiàn)在誘導(dǎo)溫度27℃時(shí)該重組蛋白主要以可溶性形式表達(dá)(圖3C第5—6泳道)。親和層析Ni柱純化重組蛋白(圖3C第7泳道),進(jìn)一步濃縮后其濃度約為350 μg/mL。N末端氨基酸殘基序列測(cè)定結(jié)果(MGSSHHHHHHS SGLV)也直接證明了本研究成功表達(dá)了重組PCNA蛋白。另外,ELISA檢測(cè)結(jié)果表明以上述濃縮后的重組PCNA蛋白為抗原對(duì)實(shí)驗(yàn)兔進(jìn)行免疫后得到的抗血清效價(jià)為1:364500(圖3D)。

圖2 基于PCNA氨基酸序列數(shù)據(jù)重建的ML樹(shù)及BI樹(shù)Fig.2 Maximum likelihood tree and Bayesian inference tree based on amino acid sequences of PCNA

2.3 大乳頭水螅頭部再生進(jìn)程中PCNA表達(dá)分析

qPCR結(jié)果表明,切割手術(shù)后0、8h及16h時(shí)水螅再生體PCNA基因轉(zhuǎn)錄水平較為平穩(wěn),而切割手術(shù)24h后再生體PCNA基因轉(zhuǎn)錄水平逐漸升高,56h后開(kāi)始降低,64h時(shí)降至與切割手術(shù)后0、8h及16h相類似的表達(dá)水平(圖4A)。WB檢測(cè)結(jié)果表明切割手術(shù)后32h、40h及48h時(shí)水螅再生體PCNA蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)(圖4B、4C)。

3 討論

從水螅身體上分離的片段(至少包含數(shù)百個(gè)細(xì)胞,觸手和基盤(pán)部位除外)可以再生成獨(dú)立的小水螅[24];甚至將完整的水螅個(gè)體通過(guò)特殊的物理和化學(xué)方法“打散”成獨(dú)立的單細(xì)胞,再把含有這些水螅單細(xì)胞的溶液用離心機(jī)離心,待離心完成后離心管底部的沉淀即為這些細(xì)胞的聚集體,2—3d后該細(xì)胞聚集體將重建成一條完整的水螅[25]。水螅這種強(qiáng)大再生能力的物質(zhì)基礎(chǔ)可能源于以下兩個(gè)方面:(1)相對(duì)簡(jiǎn)單的身體結(jié)構(gòu)。一只水螅個(gè)體是由體壁圍成的中空柱狀結(jié)構(gòu),柱狀結(jié)構(gòu)中間空腔為原腸腔,柱狀結(jié)構(gòu)的一端是其頭部(主要由口、垂唇和觸手組成),另一端為起固著作用的基盤(pán)。其體壁由外胚層、中膠層和內(nèi)胚層構(gòu)成[26];(2)水螅體內(nèi)富含干細(xì)胞性質(zhì)的細(xì)胞。體壁的中膠層無(wú)細(xì)胞分布,而外胚層和內(nèi)胚層主要由上皮肌肉細(xì)胞(Epitheliomuscular cell,簡(jiǎn)稱皮肌細(xì)胞)組成,皮肌細(xì)胞是一種特殊的上皮細(xì)胞,其通過(guò)細(xì)胞分裂只能形成新的皮肌細(xì)胞、而不能形成其他類型細(xì)胞[27];除此之外,水螅還具備一種干細(xì)胞,即相對(duì)于皮肌細(xì)胞而言體積較小的間質(zhì)干細(xì)胞(Interstitial stem cell),該細(xì)胞主要分布在外胚層。間質(zhì)干細(xì)胞是一種多能干細(xì)胞,能分化成其他功能終端細(xì)胞(不具備干細(xì)胞性質(zhì),主要包括刺細(xì)胞(Stinging cell)、腺細(xì)胞(Gland cell)、感覺(jué)細(xì)胞(Sensory cell)和神經(jīng)細(xì)胞(Nerve cell))[28],以及在環(huán)境條件劇烈改變(如水溫驟降或食物缺乏)時(shí)分化為性細(xì)胞以形成臨時(shí)性的生殖腺[29]。

圖3 PCNA抗原表達(dá)及抗體制備Fig.3 PCNA antigen expression and antibody preparation

圖4 大乳頭水螅頭部再生進(jìn)程中PCNA的表達(dá)動(dòng)態(tài)Fig.4 Dynamic expression of PCNA during the process of head regeneration of H. magnipapillata

干細(xì)胞有兩個(gè)重要特性,即具備轉(zhuǎn)分化能力和分裂增殖形成新生細(xì)胞的能力[30]。水螅再生進(jìn)程中其體內(nèi)的干細(xì)胞是通過(guò)轉(zhuǎn)分化的形式(Morphallaxis,或稱為“變形再生”,指的是在沒(méi)有細(xì)胞增殖的情況下發(fā)生的再生類型,涉及將現(xiàn)有身體部位或組織轉(zhuǎn)化為新組織的結(jié)構(gòu))、還是通過(guò)分裂增殖的形式(Epimorphosis,或稱為“新建再生”,通過(guò)細(xì)胞增殖在傷口部位產(chǎn)生新組織)參與再生過(guò)程? 這個(gè)問(wèn)題目前頗有爭(zhēng)議[1,6]。為了探討該問(wèn)題,基于增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)蛋白的表達(dá)水平與細(xì)胞分裂增殖水平直接相關(guān)[10],本研究克隆了大乳頭水螅的PCNA基因,并在重組PCNA蛋白的基礎(chǔ)上制備了多克隆抗體,進(jìn)而運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR(qPCR)及免疫印跡(WB)方法分析PCNA基因及編碼蛋白在水螅頭部再生進(jìn)程中表達(dá)水平的動(dòng)態(tài)變化。qPCR結(jié)果顯示,水螅頭部再生進(jìn)程的早期(切割手術(shù)后0、8h及16h)再生體PCNA基因轉(zhuǎn)錄水平波動(dòng)較小,而切割手術(shù)后24h后再生體PCNA基因轉(zhuǎn)錄水平逐漸升高,56h后開(kāi)始降低,致64h時(shí)降至與再生進(jìn)程早期類似的轉(zhuǎn)錄水平(圖4A)。WB檢測(cè)結(jié)果表明切割手術(shù)后32h、40h及48h時(shí)水螅再生體PCNA表達(dá)水平明顯上調(diào)(圖4B、4C)。從形態(tài)發(fā)育結(jié)構(gòu)特點(diǎn)看(圖4B),水螅頭部再生進(jìn)程的早期主要是手術(shù)傷口的愈合,這個(gè)時(shí)期PCNA表達(dá)水平較低,反映了這個(gè)階段可能是外胚層和內(nèi)胚層中的原有舊皮肌細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)分化參與傷口的愈合;而再生進(jìn)程的中后期(切割手術(shù)后32h、40h及48h)PCNA表達(dá)水平明顯上調(diào),這個(gè)時(shí)期主要涉及水螅垂唇和觸手等頭部重要結(jié)構(gòu)重建,特別是切割手術(shù)后40h時(shí)垂唇和觸手開(kāi)始萌芽,至48h時(shí)垂唇和觸手結(jié)構(gòu)已基本形成。垂唇和觸手的主體結(jié)構(gòu)也是由外胚層和內(nèi)胚層中的皮肌細(xì)胞構(gòu)成[31],這些部位的皮肌細(xì)胞仍然可能來(lái)自傷口附近原有舊皮肌細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化;但為了輔助捕食,水螅頭部結(jié)構(gòu)的表面(外胚層),特別是在觸手外胚層的皮肌細(xì)胞之間通常分布有大量刺細(xì)胞[32],觸手再生時(shí)勢(shì)必要及時(shí)補(bǔ)充外胚層中的刺細(xì)胞。而刺細(xì)胞與腺細(xì)胞、感覺(jué)細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞等其他功能終端細(xì)胞一樣,不能通過(guò)轉(zhuǎn)分化途徑獲得,只能由外胚層中的間質(zhì)干細(xì)胞自身先分裂增殖,再由獲得的新生細(xì)胞分化而來(lái)[33]。所以本研究發(fā)現(xiàn)在水螅再生進(jìn)程的中后期PCNA表達(dá)水平上調(diào)的現(xiàn)象實(shí)際上可能反映了間質(zhì)干細(xì)胞在這個(gè)時(shí)期啟動(dòng)了分裂增殖,以此及時(shí)補(bǔ)充再生體中刺細(xì)胞等功能終端細(xì)胞。到再生進(jìn)程晚期(切割手術(shù)后64h)口、垂唇和觸手等頭部主要結(jié)構(gòu)全部再生完成,其PCNA表達(dá)水平降至與再生進(jìn)程早期類似的基礎(chǔ)水平(圖4A—C)。

綜上所述,本研究揭示的大乳頭水螅頭部再生進(jìn)程中PCNA基因及其編碼蛋白的表達(dá)水平動(dòng)態(tài)特點(diǎn)的解釋都是基于以下兩個(gè)推測(cè): (1)再生組織兩個(gè)胚層中的皮肌細(xì)胞是由傷口附近區(qū)域舊的皮肌細(xì)胞轉(zhuǎn)分化而來(lái);(2)再生組織中的功能終端細(xì)胞是由間質(zhì)干細(xì)胞增殖形成的新生細(xì)胞分化而來(lái)。這兩個(gè)推測(cè)根據(jù)何在? 首先,水螅身體結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單僅具兩個(gè)胚層,沒(méi)有像許多三胚層動(dòng)物具備的專門(mén)儲(chǔ)存營(yíng)養(yǎng)的結(jié)構(gòu)[34]。如連續(xù)給水螅喂食,水螅身體無(wú)法儲(chǔ)存過(guò)多的營(yíng)養(yǎng),但這些獲得的營(yíng)養(yǎng)能直接刺激水螅體內(nèi)皮肌細(xì)胞及間質(zhì)干細(xì)胞連續(xù)分裂,結(jié)果就是在水螅身體出芽區(qū)(Budding region)產(chǎn)生許多芽體(Bud),芽體不斷長(zhǎng)大直至自身發(fā)育完全后脫離母體[35]。在高頻率喂食水螅的情況下,水螅體就是靠干細(xì)胞不斷分裂形成芽體的方式排除過(guò)多的營(yíng)養(yǎng);而在低頻率喂食水螅的條件下(如3d喂一次水螅),水螅獲得的營(yíng)養(yǎng)可能剛滿足其基本生命活動(dòng)的需要,水螅體不產(chǎn)生芽體,水螅身體也不縮小;但停止喂食水螅后,水螅不但不產(chǎn)生芽體,反而身體逐漸縮小,這是因?yàn)樗ｐ囸I后無(wú)法從體外獲得營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),但水螅體自身一部分細(xì)胞以細(xì)胞自噬或細(xì)胞凋亡的形式被分解和吸收以保持其基本生命活動(dòng)需要[36],所以水螅個(gè)體越來(lái)越小。以上的事實(shí)說(shuō)明了由于水螅無(wú)儲(chǔ)存營(yíng)養(yǎng)的結(jié)構(gòu)導(dǎo)致必須通過(guò)喂食讓水螅臨時(shí)獲得營(yíng)養(yǎng)使其體內(nèi)干細(xì)胞啟動(dòng)分裂增殖;反過(guò)來(lái)說(shuō)就是水螅體內(nèi)干細(xì)胞分裂增殖的先決條件是通過(guò)喂食獲得臨時(shí)性的營(yíng)養(yǎng)積累,沒(méi)有臨時(shí)的營(yíng)養(yǎng)積累水螅干細(xì)胞不會(huì)啟動(dòng)分裂增殖。水螅切割手術(shù)后其頭部再生過(guò)程類似于正常水螅體饑餓狀態(tài)時(shí)的情況,因?yàn)轭^部再生完成前水螅無(wú)法進(jìn)食,繼而無(wú)法獲得外部營(yíng)養(yǎng),所以再生組織中構(gòu)成水螅身體結(jié)構(gòu)主體的新生皮肌細(xì)胞最有可能由傷口附近區(qū)域舊皮肌細(xì)胞轉(zhuǎn)分化而來(lái)(變形再生);其次,水螅身體中的刺細(xì)胞、腺細(xì)胞、感覺(jué)細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞等功能終端細(xì)胞不具備干細(xì)胞性質(zhì),無(wú)轉(zhuǎn)分化能力,因此再生組織中的這些功能終端細(xì)胞的來(lái)源只有一個(gè),即由間質(zhì)干細(xì)胞分裂后獲得的新生細(xì)胞分化而來(lái)[5,32,37]。而間質(zhì)干細(xì)胞分裂增殖的營(yíng)養(yǎng)和能量從何而來(lái)? 有報(bào)道認(rèn)為是來(lái)源于部分皮肌細(xì)胞的自噬

或凋亡[36,38]。總之,本研究初步揭示了水螅頭部再生進(jìn)程的中后期階段水螅PCNA表達(dá)量呈現(xiàn)一定程度的上調(diào),這個(gè)結(jié)果暗示水螅頭部再生進(jìn)程的中后期階段其傷口及附近區(qū)域可能存在細(xì)胞分裂增殖活動(dòng),其中涉及的細(xì)胞和分子機(jī)理值得深入研究。