圓口銅魚親本與子代肝臟轉(zhuǎn)錄組特征及對比分析

李學(xué)梅 吳興兵 龔進(jìn)鈴 朱永久 楊德國

(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水生物多樣性保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,武漢 430223)

圓口銅魚(Coreius guichenoti)隸屬于鯉形目(Cypriniformes)、亞科 (Gobioninae)、銅魚屬(Coreius),主要分布于金沙江中下游、長江上游干流等水域,曾是長江上游地區(qū)特有的經(jīng)濟(jì)魚類和主要捕撈對象[1]。近年來,由于金沙江中下游梯級電站的大力開發(fā)、長期的過度捕撈和環(huán)境污染等問題,圓口銅魚產(chǎn)卵場遭到破壞,洄游通道被阻斷,其種群資源呈現(xiàn)急劇下降趨勢,嚴(yán)重威脅到該物種的生存與延續(xù)[2]。因此,加強(qiáng)圓口銅魚種群資源的保護(hù)和恢復(fù)工作已顯得極為迫切。目前,增殖放流被認(rèn)為是水生生物資源養(yǎng)護(hù)和水域生態(tài)保護(hù)的主要途徑,也是保護(hù)珍稀瀕危魚類的有效措施之一[3,4],而增殖放流的前提是馴養(yǎng)足夠的親魚,進(jìn)行人工繁殖[5]。然而,由于圓口銅魚應(yīng)激反應(yīng)激烈,人工養(yǎng)殖時(shí)極易感染小瓜蟲,死亡率較高,人工馴養(yǎng)親魚難度較大且目前圓口銅魚的應(yīng)激機(jī)制尚未可知。

轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)是伴隨著后基因組學(xué)發(fā)展起來的新興科學(xué)[6],是利用高通量測序?qū)μ囟ńM織或細(xì)胞中所有RNA反轉(zhuǎn)錄而成的cDNA文庫進(jìn)行測序,查找物種特異性狀的潛在主效基因和差異基因物種特異性狀的潛在主效基因和差異基因、研究基因表達(dá)調(diào)控[7]。該技術(shù)已經(jīng)成為研究生物生長發(fā)育、應(yīng)激機(jī)理、免疫防御等機(jī)制的主要工具[8]。肝臟是魚類最大的消化腺,也是最重要的代謝器官之一,物質(zhì)代謝能力旺盛,在機(jī)體中具有免疫防御、解毒、激素分泌和合成等功能[9]。應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組技術(shù)已對大西洋鮭(Salmo salar)[10]、烏鱧(Channa argus)和斑鱧(Channa maculata)[11]、白鰱(Hypophthalmichthys molitrix)[12]、花鱸(Lateolabrax maculatus)[13]等多種魚類肝臟免疫反應(yīng)進(jìn)行研究。

本研究對圓口銅魚親本和子代肝臟的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測序,分析其轉(zhuǎn)錄組特征和差異表達(dá)基因并探討其功能,在豐富圓口銅魚基因組數(shù)據(jù)的同時(shí),為圓口銅魚應(yīng)激反應(yīng)的分子機(jī)制研究以及分子標(biāo)記的開發(fā)和利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對象

試驗(yàn)用魚來自中國水產(chǎn)科學(xué)院長江水產(chǎn)研究所循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng),2017年9月在養(yǎng)殖桶里隨機(jī)撈取3 尾圓口銅魚親本(簡稱圓親YQ)和3尾圓口銅魚子代(簡稱圓子YZ),體長、體重見表1。圓口銅魚親本在養(yǎng)殖系統(tǒng)養(yǎng)殖超過4年且多次感染小瓜蟲并治愈,而子代為2016年6月人工繁殖獲得,截止到采樣日期未感染小瓜蟲。將魚麻醉后,在低溫條件下解剖取肝臟組織,經(jīng)液氮冷凍后,保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

表 1 親本與子代圓口銅魚體長體重 (平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)Tab.1 The body length and body weight of Coreius guichenoti in different groups (Mean±SD)

1.2 RNA 提取、文庫構(gòu)建

將肝臟組織置于液氮預(yù)冷的研缽中,研磨至粉末狀,之后使用RNA Purification Reagent(Invitrogen)試劑盒對肝臟組織總RNA進(jìn)行抽提,然后通過TruseqTMRNA sample prep Kit(Illumina)試劑盒建庫。轉(zhuǎn)錄組的測序工作由上海凌恩生物科技有限公司完成。

1.3 轉(zhuǎn)錄組組裝

原始數(shù)據(jù)需經(jīng)過過濾來控制序列的質(zhì)量,過濾原則主要包括: (1) 去除reads中的接頭序列,去除因接頭自連導(dǎo)致沒有插入片段的reads;(2) 將序列末端(3′端)質(zhì)量值小于20的堿基修剪掉,如果剩余序列中仍存在質(zhì)量值小于10的堿基,則將整條序列剔除;(3) 將含N比率超過10%的reads去除;(4) 舍棄去adapter及質(zhì)量修剪后長度小于70 bp的序列。同時(shí)計(jì)算 Q20、Q30含量和重復(fù)序列水平,后續(xù)分析均在清潔數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上進(jìn)行。所獲得的數(shù)據(jù)利用 Trinity 軟件進(jìn)行拼接。

1.4 基因功能注釋

對拼接得到的unigene序列進(jìn)行注釋,并與Nr、string、gene數(shù)據(jù)庫比對,通過比對,將得到的序列與 NCBI數(shù)據(jù)庫(Nr)、GO(Gene Ontology)數(shù)據(jù)庫、COG(Clusters of Orthologous Groups of proteins)數(shù)據(jù)庫、KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較,對提交比對的序列進(jìn)行功能注釋。

1.5 差異基因分析

在序列比對完成后,參考基因組的注釋文件,統(tǒng)計(jì)每個(gè)轉(zhuǎn)錄本在樣本中的RPKM (Reads Per Kilobase of exon per Million fragments mapped)值,以該值作為該轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)量。轉(zhuǎn)錄本豐度越高,則基因表達(dá)水平越高,通過對每個(gè)轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)量進(jìn)行樣本間差異顯著性分析,獲得差異表達(dá)基因。以FDR≤0.05和Fold Change≥2為評判差異基因的顯著性。所有的差異表達(dá)基因通過KEGG 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行通路富集分析,并采用路徑網(wǎng)絡(luò)分析法,根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫路徑間的關(guān)系,利用顯著改變路徑的代謝通路(P＜0.05)構(gòu)建共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)[14]。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及組裝

圓口銅魚親本和子代肝臟 cDNA樣本經(jīng) Illumina HiseqTM2000平臺測序后,每個(gè)樣本獲得了超過 6.00G的數(shù)據(jù)量,獲得clean reads 共273204836條,占總reads的91.11%。去除接頭序列、低質(zhì)量序列后,堿基質(zhì)量及組成分析顯示,各樣品Q30的堿基質(zhì)量值比例均不小于94.55%,GC含量區(qū)間為45.83%—48.13% (表2)。序列經(jīng)拼接和組裝后,共獲得80688個(gè)Unigene,長度主要分布在401—600 bp,占總Unigene的43.56%,Unigene 的 N50為683,表明組裝完整性較高(表3)。

表 2 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評估Tab.2 Quality evaluation of sequencing data

表 3 測序數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)匯總Tab.3 Summary statistic of the sequencing data

2.2 轉(zhuǎn)錄組功能注釋

在拼接獲得 genes 后,與公共數(shù)據(jù)庫比對后進(jìn)行功能注釋,其中26494個(gè)unigene通過 Nr 數(shù)據(jù)庫比對注釋,比例最高為32.8%,9131個(gè) unigene 通過 GO數(shù)據(jù)庫進(jìn)行功能注釋,比例最低為11.3%(表4)。17175個(gè)unigene被注釋到 25個(gè) COG 功能家族,其中一般功能和一些未知功能數(shù)量較多,其次為翻譯后修飾、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化、蛋白伴侶、細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸、分泌和水泡運(yùn)輸?shù)裙δ芑?圖1)。

2.3 親本與子代差異表達(dá)基因聚類分析

分析結(jié)果顯示,圓口銅魚親本與子代共獲得2701個(gè)差異基因,其中子代顯著上調(diào)基因有1240個(gè),顯著下調(diào)基因1461個(gè)。進(jìn)一步對差異表達(dá)基因進(jìn)行聚類熱圖分析(圖2),結(jié)果顯示,圓口銅魚親本和子代高低表達(dá)的基因分別聚在一起,同一樣本不同重復(fù)基因表達(dá)相似。

表 4 基因注釋結(jié)果統(tǒng)計(jì)Tab.4 Statistics results of the gene annotation

圖1 Unigenes 的 COG 分類Fig.1 Clusters of orthologous groups classification of Unigenes

圖2 親本和子代差異基因表達(dá)模式聚類熱圖Fig.2 Cluster heatmap of differentially expressed genes of YQ and YZ

2.4 親本與子代差異表達(dá)基因KEGG通路富集與路徑網(wǎng)絡(luò)分析

將差異基因所反映的代謝通路進(jìn)行KEGG富集分析,結(jié)果顯示,圓口銅魚親本與子代在代謝通路上最顯著富集的有脂肪酸的代謝通路(Fatty acid metabolism)、脂肪酸生物合成通路(Fatty acid biosynthesis)、胰腺分泌通路(Pancreatic secretion)等(圖3)。

對KEGG中37個(gè)顯著富集的代謝通路(P＜0.05)構(gòu)建其基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò),其中丙酸鹽代謝(Propanoate metabolism)、丙酮酸代謝(Pyruvate metabolism)、原核生物固碳途徑(Carbon fixation pathways in prokaryotes)、乙醛和二羧酸代謝(Glyoxylate and dicarboxylate metabolism)、脂肪酸代謝、萜類骨架生物合成(Terpenoid backbone biosynthesis)是KEGG差異表達(dá)基因的核心代謝途徑,與其他途徑具有較復(fù)雜的相關(guān)性,且這些基因在圓口銅魚子代中表達(dá)量均顯示上調(diào)(圖4)。

圖3 差異基因代謝通路KEGG顯著富集結(jié)果Fig.3 The significantly enriched pathways and corresponding DEGs number of each pathway

3 討論

轉(zhuǎn)錄組學(xué)是通過研究RNA 在組織或細(xì)胞內(nèi)的生物過程和功能,從整體水平出發(fā)來表示特定生物學(xué)過程中的分子作用機(jī)理[15]。該技術(shù)可在不預(yù)先設(shè)計(jì)探針的情況下對不同物種進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序,相關(guān)數(shù)據(jù)在反映細(xì)胞內(nèi)生物過程時(shí),也比蛋白組的數(shù)據(jù)更全面[16]。截至目前,未看到有關(guān)圓口銅魚轉(zhuǎn)錄組測序的報(bào)道,本研究在沒有參照基因組對照的情況下,對所測得的序列從頭拼接,獲得了80688條Unigene,平均長度分別達(dá)到694.7 bp,通過抽樣與GenBank中的序列比對,發(fā)現(xiàn)拼接質(zhì)量較好,表明針對圓口銅魚的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)可靠、有效。

與 NCBI Nr數(shù)據(jù)庫比對結(jié)果顯示,圓口銅魚轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與已知基因可以比對到26494條,占總數(shù)的 32.8%,說明仍有約70% 的基因未能比對到NR數(shù)據(jù)庫中。另外,通過在公共數(shù)據(jù)庫GO、COG和 KEGG 中功能注釋顯示,本試驗(yàn)中只有15%左右的Unigene序列被注釋到,說明銅魚屬魚類的基因序列在國際公共數(shù)據(jù)庫中收錄的較少。盡管這樣,本研究獲得的Unigene可大大豐富現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫中銅魚屬基因資源。另外可通過功能注釋,了解一些特定基因的功能、參與的生物過程以及相關(guān)代謝通路等,為進(jìn)一步圓口銅魚的功能基因挖掘等提供數(shù)據(jù)支撐。

圖4 KEGG顯著富集通路相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig.4 Network of significantly enriched pathways in KEGG

本研究對圓口銅魚親本和子代肝臟轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行比較分析,獲得了親本和子代間差異表達(dá)的基因2701個(gè),通過KEGG pathway富集分析,發(fā)現(xiàn)差異性的代謝通路集中在脂肪酸的代謝、吸收和合成、胰腺分泌等。進(jìn)一步構(gòu)建了KEGG中顯著富集的代謝通路(P＜0.05)中基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò),其中核心代謝途徑主要包括丙酸鹽、丙酮酸、脂肪酸、原核生物固碳途徑、萜類骨架生物合成等,且與這些通路相關(guān)的基因在子代圓口銅魚中顯著上調(diào)。一方面可能由于子代處于快速生長階段,其生長速率和代謝水平與性成熟的親本圓口銅魚不同而至。已有研究指出,魚類生長的一般規(guī)律為幼魚時(shí)期生長速率較快,隨年齡的增加逐漸趨平緩甚至下降[17]。另一方面可能與子代免疫反應(yīng)活性相關(guān)。應(yīng)正宙和王志偉[10]指出魚類免疫反應(yīng)活性與肝臟代謝水平直接相關(guān)。丙酸鹽代謝產(chǎn)物和丙酮酸的代謝產(chǎn)物是典型的短鏈脂肪酸,對機(jī)體具有重要的生理功能如能量代謝、體液平衡等[18]。肝臟是丙酸鹽代謝的主要器官,在反芻動物中能夠調(diào)節(jié)其血糖平衡、緩解炎癥、增強(qiáng)免疫力,維持機(jī)體健康[19]。有研究指出,丙酸能降低奶牛血液中β-羥丁酸(β-hydroxybutyrate,BHBA) 濃度,減少尿酮的產(chǎn)生,升高血糖濃度,調(diào)節(jié)胰島素分泌,維持血糖平衡,同時(shí)也可以控制甘油三酯,若甘油三酯的合成量,預(yù)防脂肪肝形成[20]。另外,丙酸鹽也被指出能夠改善里海白魚Rutilus frisii kutum[21]、斑馬魚Danio rerio[22]等魚類的黏膜和非特異性免疫反應(yīng),提高魚類的免疫力和生長性能。因此,根據(jù)本研究中丙酸鹽、丙酮酸等核心代謝途徑在子代肝臟中顯著上升的結(jié)果,推測圓口銅魚子代免疫反應(yīng)活性要高于親本,從分子水平上解釋了在同一循環(huán)水系統(tǒng)中圓口銅魚親本易患小瓜蟲病,而子代確未發(fā)現(xiàn)患病的現(xiàn)象。相關(guān)實(shí)驗(yàn)室的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)將在下一步開展。

近年來,針對圓口銅魚開展的研究主要集中在生殖與發(fā)育[23]、生理生化[24]、遺傳多樣性[25]、馴養(yǎng)[26]、應(yīng)激緩解[27]等方向,但在魚類應(yīng)激反應(yīng)的分子機(jī)制方面,由于基礎(chǔ)數(shù)據(jù)的缺乏,尚未開展更深入的研究。本試驗(yàn)通過轉(zhuǎn)錄組測序獲得的圓口銅魚轉(zhuǎn)錄組序列和基因注釋結(jié)果,將有助于圓口銅魚應(yīng)激反應(yīng)的分子機(jī)制研究,加快圓口銅魚功能基因挖掘和利用。