殼寡糖對(duì)雜交黃顙魚“黃優(yōu)1號(hào)”(黃顙魚♀×瓦氏黃顙魚♂)生長(zhǎng)性能與免疫機(jī)能的影響

李明波 沈 凡 崔慶奎 齊飄飄 王銀海 張海龍 丁運(yùn)敏 沈志剛

(1.潛江市水產(chǎn)技術(shù)推廣中心,潛江 433100;2.潛江市玉欣水產(chǎn)養(yǎng)殖專業(yè)合作社,潛江 433100;3.北京昕大洋科技發(fā)展有限公司,北京 100081;4.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院,農(nóng)業(yè)部淡水生物繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,池塘健康養(yǎng)殖湖北省工程實(shí)驗(yàn)室,武漢 430070;5.武漢市武湖農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司,武漢 430331)

幾丁質(zhì)存在于節(jié)肢動(dòng)物外骨骼及一些真菌細(xì)胞壁中,高溫下經(jīng)強(qiáng)堿溶液處理,實(shí)現(xiàn)脫乙酰化,形成殼聚糖(chitosan)[1]。殼聚糖經(jīng)酸解、物理降解或酶解,形成殼寡糖(chitosan oligosaccharide,COS),聚合度≤20,平均分子量＜3900 Da[2]。殼寡糖又稱幾丁寡糖、低聚殼聚糖、寡聚β-(1→4)-2-氨基-2-脫氧-D-葡萄糖,是目前所知唯一的正電荷堿性氨基葡萄糖低聚糖[3],因分子量低,水溶性高,其生物功能活性高于殼聚糖[4]。殼寡糖能被動(dòng)物小腸吸收,不僅具益生元功能,還能經(jīng)血液循環(huán)到達(dá)肝、腎、脾、心、胸腺等靶器官,起組織保護(hù)作用,亦能結(jié)合巨噬細(xì)胞表面受體,起調(diào)節(jié)免疫、抗炎、抗氧化作用[4,5]。同時(shí),殼寡糖安全性極高,小鼠口服半致死濃度高于蔗糖(＞16 g/kg),因此適用于養(yǎng)殖動(dòng)物保健,甚至可能成為抗生素替代品之一[6]。食品安全問題現(xiàn)已成為養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要制約因素,2010年起農(nóng)業(yè)部陸續(xù)發(fā)布1435、1759、2292號(hào)公告,禁止水產(chǎn)用獸藥34種(計(jì)規(guī)格共57個(gè)),其中抗菌、消毒類24種(計(jì)規(guī)格共41個(gè))。近幾年來,政府、學(xué)者、消費(fèi)者對(duì)水產(chǎn)“無抗時(shí)代”的呼聲越來越高,期待越來越強(qiáng)烈,抗菌獸藥減用方案及替代品亟待探索。

黃顙魚(Yellow catfish,Tachysurus fulvidraco)屬鲇形目(Siluriformes)、鲿科(Bagridae)、擬鲿屬(Tachysurus),是近年來增長(zhǎng)速度最快、受關(guān)注度最高的淡水名特養(yǎng)殖魚類之一,產(chǎn)量從2014年的33.4×107kg增至2018年的51.0×107kg,在我國淡水養(yǎng)殖魚類產(chǎn)量中排第9位[7]。黃顙魚生長(zhǎng)存在明顯雌、雄二態(tài)特征,在相同飼養(yǎng)條件下,雄性規(guī)格可高達(dá)雌性的3倍[8]。針對(duì)黃顙魚養(yǎng)殖過程中出現(xiàn)的規(guī)格差異,我國科研人員已培育出兩個(gè)黃顙魚新品種: 以“超雄黃顙魚”(YY)為父本生產(chǎn)“全雄黃顙魚”;以普通黃顙魚為母本、瓦氏黃顙魚(Tachysurus vachelli)為父本生產(chǎn)的雜交黃顙魚“黃優(yōu)1號(hào)”(黃顙魚♀×瓦氏黃顙魚♂,下同)。目前,雜交黃顙魚“黃優(yōu)1號(hào)”(2019年全國水產(chǎn)原種和良種審定委員會(huì)審定新品種)因規(guī)格相對(duì)整齊、生長(zhǎng)快、存活率高、耐低氧、耐運(yùn)輸?shù)葍?yōu)勢(shì)[9—11],養(yǎng)殖需求逐年增長(zhǎng)。

近年來,黃顙魚上市規(guī)格要求提高,養(yǎng)殖成本上漲,價(jià)格存在較大波動(dòng),因此,養(yǎng)殖者對(duì)該品種生長(zhǎng)速度、飼料利用、存活與抗病力的要求日趨嚴(yán)苛。

已有研究顯示,殼聚糖對(duì)黃顙魚生長(zhǎng)、免疫具一定積極作用[12,13]。但殼寡糖對(duì)黃顙魚或雜交黃顙魚的影響及劑量效應(yīng),尚未見研究報(bào)道。此外,現(xiàn)有殼寡糖對(duì)魚類免疫機(jī)能影響的研究,主要關(guān)注非特異性免疫,其對(duì)魚類特異性免疫,尤其特異性細(xì)胞免疫的影響鮮有報(bào)道。本研究旨在評(píng)價(jià)飼料添加不同劑量殼寡糖對(duì)“黃優(yōu)1號(hào)”生長(zhǎng)性能、飼料利用、特異及非特異性免疫的影響,以期為黃顙魚功能性添加劑的選擇提供理論基礎(chǔ),并為魚類免疫學(xué)研究提供數(shù)據(jù)資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)魚初始群體為1200尾9月齡秋繁雜交黃顙魚,獲自湖北黃優(yōu)源漁業(yè)發(fā)展有限公司(湖北省武漢市江夏區(qū))。從中隨機(jī)篩選體重33—40 g的健康個(gè)體420尾作為試驗(yàn)魚。不人為干預(yù)雌、雄初始規(guī)格差異,但保證各組性比差異不顯著,且與試驗(yàn)魚來源群體(捕自池塘的1200尾)性比接近。將試驗(yàn)魚飼養(yǎng)于12個(gè)容積為1 m3的網(wǎng)箱,每網(wǎng)箱35尾,將12個(gè)網(wǎng)箱隨機(jī)分配至4個(gè)試驗(yàn)組,每組3個(gè)重復(fù)。試驗(yàn)魚從池塘轉(zhuǎn)入網(wǎng)箱暫養(yǎng)7d(暫養(yǎng)期間投基礎(chǔ)飼料)。試驗(yàn)開始前測(cè)定所有個(gè)體體長(zhǎng)和體重,并根據(jù)雄性具生殖突的特性記錄性比,初始體重(36.46±0.59) g,體長(zhǎng)(12.99±0.10) cm,性比1.04(♂: ♀),體重變異系數(shù)(21.21±3.02)%,各組間差異不顯著。

1.2 試驗(yàn)飼料

試驗(yàn)飼料由北京科澳協(xié)力飼料有限公司訂制加工。基礎(chǔ)飼料配方見表1。殼寡糖(COS,含量為10%)通過噴涂工藝添加,水溶組分的噴涂設(shè)置于烘干后,油脂噴涂前。

1.3 試驗(yàn)分組

試驗(yàn)設(shè)4組,殼寡糖(10%)添加量分別為0 (C組,對(duì)照組)、400 mg/kg(T1組,有效劑量40 mg/kg)、800 mg/kg(T2組,有效劑量80 mg/kg)、1200 mg/kg(T3組,有效劑量120 mg/kg)。每組3個(gè)網(wǎng)箱,規(guī)格、密度同1.1所述。試驗(yàn)為期56d。

殼寡糖(純度為10%)獲自中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所,脫乙酰度≥95%,聚合度2—8,分子量≤2000 Da,載體為麥芽糊精。

表 1 試驗(yàn)基礎(chǔ)配方及營養(yǎng)成分(風(fēng)干物質(zhì)基礎(chǔ))Tab.1 Ingredients and chemical analysis of the basal diets (airdried basis)

1.4 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)于湖北黃優(yōu)源漁業(yè)發(fā)展有限公司開展。網(wǎng)箱架設(shè)于黃顙魚育成土池塘中,位于池塘自動(dòng)投餌機(jī)的另一側(cè),網(wǎng)孔1 cm。池深2.2 m,池總面積13340 m2(20畝),葉輪式增氧機(jī)配置0.9 W/ m2(0.6 kW/畝)。NH3-N、H2S每7 天測(cè)1次,DO及水溫每日監(jiān)測(cè),自然光照。期間水溫26—32℃,NH3-N≤0.3 mg/L,NO≤0.05 mg/L,H2S＜0.02 mg/L,pH 7.6—8.8,DO＞3.8 mg/L。每日2次投喂,06:30及18:30,投餌機(jī)開啟,吸引池中魚群聚集于靠近投餌機(jī)側(cè)后,開始對(duì)網(wǎng)箱投喂,以防試驗(yàn)料吸引池塘中黃顙魚。每次投喂至表觀飽食。稱差重計(jì)每日采食量。

試驗(yàn)結(jié)束前5d,每平行取5尾(用于淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率檢測(cè)),用150 mg/L MS-222溶液麻醉,胸鰭下注射植物血凝素(PHA-P)(合肥博美生物科技有限公司第一分公司)。PHA-P用Jeager’s液溶解至2.4 μg/mL,劑量為8 μg/g魚體重,注射后用紅線捆背鰭硬棘標(biāo)記,放回原網(wǎng)箱。3d后按原劑量第2次注射。

1.5 樣品采集

在56d飼養(yǎng)結(jié)束后,禁食24h,MS-222溶液(100 mg/L)麻醉,測(cè)所有未標(biāo)記試驗(yàn)魚體長(zhǎng)(BL)、體重(BW),判斷性別,記終末尾數(shù),并計(jì)算如下參數(shù):

特定生長(zhǎng)率(Specific growth rate,SGR,%/d)=100×(lnWt-lnW0)/t;

體重變異系數(shù)(Coefficient of variation,CV,%)=100×(SDW/Wt)

蛋白質(zhì)效率(Protein efficiency rate,PER)=(∑Wt-∑W0)/WP

餌料系數(shù)(Feed conversion ratio,FCR)=Wf/(∑Wt-∑W0)

肥滿度(Condition factor,CF,g/m3)=100×Wt/L3

存活率(Survival rate,SR,%)=100×Nt/N0

式中,W0為初始魚體重(g),Wt為終末魚體重(g),Wf為攝入飼料總量(g),∑Wt為終末魚體總重(g),∑W0為初始魚體總重(g),WP為攝入的飼料蛋白質(zhì)總量(g),L為終末魚體長(zhǎng)(cm),t為試驗(yàn)天數(shù)(d);N0為初始尾數(shù),Nt為終末尾數(shù);SDw為平行內(nèi)體重標(biāo)準(zhǔn)差。

注射PHA-P并標(biāo)記5尾,于尾柄脊柱下動(dòng)(靜)脈取抗凝血(1 mL注射器,以肝素鈉浸潤),用于淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率測(cè)定。

每平行隨機(jī)取10尾(未標(biāo)記魚),于尾柄脊柱下動(dòng)(靜)脈取抗凝血(1 mL注射器,以肝素鈉浸潤)。0.2 mL全血用于白細(xì)胞吞噬活性測(cè)定,其他用于制血漿,測(cè)定生化指標(biāo)?？鼓诒兄谐两?h,4℃下1500 r/min離心40min,取上清得血漿,于-20℃冰箱暫存。

1.6 檢測(cè)項(xiàng)目

淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率參照文獻(xiàn)[14]的方法,血涂片觀察。推血制片,甲醇固定,瑞氏-吉姆薩混合染色,油鏡下計(jì)數(shù)200個(gè)淋巴細(xì)胞。轉(zhuǎn)化為母細(xì)胞的淋巴細(xì)胞呈阿米巴或圓形,胞相對(duì)疏松,胞漿較休止期豐富,直徑增大,胞質(zhì)藍(lán)色。休止形淋巴細(xì)胞直徑相對(duì)小,核致密,深藍(lán)紫色,胞漿極少,核與細(xì)胞膜常相切。過度形特征間于母細(xì)胞形和休止形之間。

轉(zhuǎn)化率(%)=100×(過度形+母細(xì)胞形)/淋巴細(xì)胞總量

白細(xì)胞吞噬活性白細(xì)胞吞噬活性用血涂片觀察,取0.2 mL抗凝全血與金黃色葡萄球菌(南京進(jìn)優(yōu)生物技術(shù)有限公司)液0.1 mL混合,28℃水浴1h,推血制片,甲醇固定10min,晾干,瑞氏染色30s,吉姆薩染色10min,蒸餾水洗,晾干。

吞噬百分率(%)=100×(N個(gè)白細(xì)胞中參與吞噬的細(xì)胞數(shù)/N)

吞噬指數(shù)=N個(gè)白細(xì)胞中被吞噬的細(xì)菌數(shù)/N

溶菌酶活性溶菌酶活性,購買溶壁微球菌(南京建成生物工程有限公司),與待測(cè)血漿混合,570 nm處測(cè)吸光度A0,37℃水浴30min,測(cè)吸光度A。

補(bǔ)體含量補(bǔ)體C3(g/L)、C4(g/L)含量用酶聯(lián)免疫試劑盒測(cè)定(上海晶抗生物工程有限公司)。

免疫球蛋白含量IgM(μg/L)含量用酶聯(lián)免疫試劑盒測(cè)定(上海晶抗生物工程有限公司)。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

以平均值(Mean) ±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示,不同組間終末數(shù)據(jù)進(jìn)行Shapiro-wilk法正態(tài)性檢驗(yàn)及Levene法方差同質(zhì)性檢驗(yàn),方差齊(Sig＞0.05),進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)及最小顯著差異法(LSD)法多重比較。以不同性別初始體重變異系數(shù)為協(xié)變量,做協(xié)方差分析(Covariance analysis),若對(duì)終末數(shù)據(jù)存在顯著影響,則求校正結(jié)果。將試驗(yàn)魚分雌、雄統(tǒng)計(jì)生長(zhǎng)性能,做雙因素方差分析(Twoway ANOVA),以性別為一自變量,劑量為另一自變量,LSD法多重比較。統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 19.0,顯著性水平設(shè)為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 生長(zhǎng)性能

在試驗(yàn)結(jié)束時(shí),殼寡糖有效劑量120 mg/kg組體重顯著高于0和40 mg/kg組(P=0.003;P=0.042),0、40和80 mg/kg三組間差異不顯著(P＞0.05)。有效劑量120 mg/kg組特定生長(zhǎng)率顯著高于0組(P=0.003)、40 mg/kg組(P=0.048),0、40和80 mg/kg三組間差異不顯著(P＞0.05)。120 mg/kg組飼料系數(shù)顯著低于0組(P=0.003),與40和80 mg/kg組差異不顯著(P＞0.05),0、40和80 mg/kg三組間差異不顯著(P＞0.05)。有效劑量120 mg/kg組蛋白質(zhì)效率顯著高于0組(P=0.006),0、40和80 mg/kg三組間差異不顯著(P＞0.05,表2)。存活率于各組間無顯著差異(P=0.944,表2)。

雙因素方差分析顯示,殼寡糖劑量與性別兩因素,對(duì)試驗(yàn)魚特定生長(zhǎng)率、終末體重均有顯著影響(P＜0.05),兩因素間無交互作用(P＞0.05,表3)。

殼寡糖有效劑量120和80 mg/kg兩組雄性特定生長(zhǎng)率顯著高于0組雄性(P＜0.001,P=0.015)。四組雌性生長(zhǎng)性能無顯著差異(P＞0.05,表3)。

表 2 殼寡糖(10%)對(duì)雜交黃顙魚生長(zhǎng)性能的影響Tab.2 Effects of dietary chitosan oligosaccharide (10% purity) levels on growth performance of hybrid yellow catfish “Huangyou No.1”Tachysurus fulvidraco ♀× Tachysurus vachelli ♂

表 3 殼寡糖(10%)用量對(duì)不同性別雜交黃顙魚生長(zhǎng)性能的影響Tab.3 Effects of dietary chitosan oligosaccharide (10%) supplemental levels and gander on the final body weight,final condition factor,final coefficient of variation and specific growth rate of hybrid yellow catfish

協(xié)方差分析顯示,雌性初始體重變異系數(shù)顯著影響雌性(P=0.006)及完整群體特定生長(zhǎng)率(P=0.030,表4)。

校正去除協(xié)變量(雌性初始體重變異系數(shù))的影響后,雌性特定生長(zhǎng)率受殼寡糖顯著影響(P=0.011)。同時(shí),完整群體特定生長(zhǎng)率于不同劑量殼寡糖下的差異顯著程度,比不校正時(shí)提升,0 組完整群體特定生長(zhǎng)率顯著低于有效劑量80 mg/kg組(P=0.003)和120 mg/kg組(P=0.002,表5)。

2.2 免疫機(jī)能

飼料添加殼寡糖(10%)對(duì)試驗(yàn)魚白細(xì)胞計(jì)數(shù)無顯著影響(P＞0.05,圖1)。

表 4 初始體重變異系數(shù)對(duì)雜交黃顙魚特定生長(zhǎng)率影響的協(xié)方差分析Tab.4 Covariance analysis of effects of initial intact CV,initial ♂CV,initial ♀CV on SGR of hybrid yellow catfish

表 5 校正協(xié)變量(雌性初始體重變異系數(shù))后殼寡糖(10%)劑量對(duì)特定生長(zhǎng)率的影響Tab.5 Effects of dietary chitosan oligosaccharide (10%)supplemental levels on SGR of hybrid yellow catfish with covariate(Initial ♀ CV) adjusted

細(xì)胞免疫殼寡糖(10%)顯著影響白細(xì)胞吞噬指數(shù)(P=0.004),有效劑量40 mg/kg組顯著高于0組(P=0.002),3個(gè)添加殼寡糖的組間差異不顯著(P＞0.05)。白細(xì)胞吞噬百分比于各組間無顯著差異(P＞0.05,圖1)。

殼寡糖(10%)對(duì)試驗(yàn)魚淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率影響顯著(P=0.001),有效劑量40 mg/kg組顯著高于0組(P=0.009),有效劑量升至80 mg/kg,淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率進(jìn)一步顯著提升(P=0.047),有效劑量120 mg/kg組與80 mg/kg組無顯著差異(P＞0.05,圖1)。

圖1 殼寡糖(10%)對(duì)雜交黃顙魚細(xì)胞免疫的影響Fig.1 Effects of dietary chitosan oligosaccharide (10%)supplemental levels on white blood cell phagocytic percent,Phagocytic index,lymphocyte transformation rate and white blood cell count of hybrid yellow catfish

試驗(yàn)魚白細(xì)胞鑒別見圖2,形態(tài)描述如下:

紅細(xì)胞: 成熟紅細(xì)胞卵圓形,表面光滑,細(xì)胞核居中,瑞氏-吉姆薩染色紫紅;幼稚紅細(xì)胞核較大,紫色,胞質(zhì)瑞士-吉姆薩染色下灰藍(lán)色。

血栓細(xì)胞: 胞體小,紡錘形、卵圓形、圓形,細(xì)胞核W-G染色紫紅,胞質(zhì)灰白或不著色,部分裸核。

淋巴細(xì)胞: 核質(zhì)比最大的細(xì)胞,W-G染色核紫紅,胞質(zhì)藍(lán)色。休止淋巴細(xì)胞核與膜常向切,母型淋巴細(xì)胞胞漿豐富,常呈圓形,直徑增大,過度型間于二者之間。

中性粒細(xì)胞: 細(xì)胞核W-G染色紫紅,與胞膜相切,細(xì)漿豐富,內(nèi)含小顆粒,核質(zhì)比小于單核細(xì)胞。

單核細(xì)胞: 白細(xì)胞中個(gè)體最大,細(xì)胞核圓形或不規(guī)則,核質(zhì)比大于中性粒細(xì)胞,小于淋巴細(xì)胞,常見巨大偽足。

體液免疫殼寡糖(10%)添加可顯著提高試驗(yàn)魚外周血溶菌酶活力(P=0.022)。有效劑量80 mg/kg時(shí),顯著高于0 (P=0.032)及40 mg/kg(P=0.035),與120 mg/kg時(shí)差異不顯著(P＞0.05,圖3)。

殼寡糖對(duì)外周血補(bǔ)體C3、C4含量無顯著影響(P＞0.05,圖3)。

隨殼寡糖有效劑量增加,外周血IgM含量的變化趨勢(shì)與溶菌酶類似,80及120 mg/kg組顯著高于0和40 mg/kg(P＜0.05,圖3)。

圖2 雜交黃顙魚血細(xì)胞形態(tài)示例Fig.2 Microstructure of peripheral blood cells of hybrid yellow catfish

3 討論

3.1 殼寡糖對(duì)雜交黃顙魚生長(zhǎng)性能的影響

殼寡糖(COS)對(duì)魚類生長(zhǎng)性能具積極作用已多見報(bào)道,其促生長(zhǎng)機(jī)理通常被歸結(jié)為以下3點(diǎn): (1)保護(hù)腸黏膜,改善上皮組織結(jié)構(gòu)[15—17];(2)促進(jìn)礦物質(zhì)吸收,這與消化道pH調(diào)節(jié)及殼寡糖自身的(-NH2)、(-OH)兩個(gè)官能團(tuán)有關(guān)[16,18,19] ;(3)提高消化酶活力,但未確認(rèn)內(nèi)源性(試驗(yàn)對(duì)象消化腺分泌)或外源性(消化道內(nèi)微生物分泌)[20,21]。在殼寡糖促進(jìn)陸生動(dòng)物生長(zhǎng)性能的報(bào)道中,則有更豐富的機(jī)理闡述。對(duì)于畜、禽,炎癥反應(yīng)會(huì)通過以下4個(gè)途徑抑制生長(zhǎng):(1)影響神經(jīng)體液調(diào)節(jié);(2)造成線粒體功能紊亂;(3)干擾三大營養(yǎng)代謝;(4)增大能量支出[22—24]。殼寡糖能結(jié)合巨噬細(xì)胞表面位點(diǎn),抑制多種蛋白激酶磷酸化,阻斷信號(hào)通路,實(shí)現(xiàn)炎癥抑制,故有利于生長(zhǎng)[25,26]。對(duì)魚類,殼寡糖亦能抑制腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素1β(IL-1β)等炎癥因子,提升抗炎因子白介素10(IL-10)的表達(dá)水平,以減弱炎癥反應(yīng)[27,28]。可以推測(cè),炎癥抑制作用,也是殼寡糖促進(jìn)魚類生長(zhǎng)的原因之一。魚類炎癥反應(yīng)對(duì)生長(zhǎng)性能的影響方式,有待進(jìn)一步研究。

由表6可知,殼寡糖對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物生長(zhǎng)速度、飼料利用的有效改善劑量在0.1—10 g/kg。如此巨大的差異顯然不能用試驗(yàn)動(dòng)物品種不同解釋(同品種相似規(guī)格的不同報(bào)道間仍有巨大差異),更可能是由試驗(yàn)所用殼寡糖自身特性導(dǎo)致。有學(xué)者定義聚合度≤20,平均分子量＜3900 Da的殼聚糖水解產(chǎn)物為殼寡糖[2],但未形成標(biāo)準(zhǔn),目前不同來源的殼寡糖聚合度、分子量有較大差異。而聚合度、分子量對(duì)殼寡糖在小腸中的可吸收性存在巨大影響[29]。在能明確聚合度或分子量的已有報(bào)道中(分子量≤5600 Da),促水產(chǎn)動(dòng)物生長(zhǎng)有效劑量在0.1—1 g/kg,而僅于市場(chǎng)采購殼寡糖商品,未明確聚合度或分子量的試驗(yàn)中,促生長(zhǎng)有效劑量高達(dá)2—10 g/kg(表6)?？梢?脫離聚合度或分子量開展殼寡糖應(yīng)用研究,將在一定程度上失去可比較性。本試驗(yàn)所用殼寡糖聚合度2—8,分子量2000 Da,應(yīng)用120 mg/kg時(shí)(以殼寡糖純品計(jì))對(duì)雜交黃顙魚生長(zhǎng)速度及飼料利用產(chǎn)生了顯著影響,與能明確所用殼寡糖分子量≤5600 Da的報(bào)道中所述劑量接近[17,18,20,21,30]。

雙因素方差分析顯示,在本試驗(yàn)條件下,雜交黃顙魚仍表現(xiàn)出一定程度雌、雄生長(zhǎng)差異。但直至試驗(yàn)結(jié)束,雄性平均規(guī)格＞90 g,雌性平均僅比雄性小約7 g,差異微弱,推測(cè)生產(chǎn)中對(duì)成品魚捕撈及售出不會(huì)形成明顯影響。

圖3 飼料殼寡糖(10%)水平對(duì)雜交黃顙魚體液免疫的影響Fig.3 Effects of different dietary chitosan oligosaccharide (10%)levels on the humoral immunity of hybrid yellow catfish

表 6 已有報(bào)道中殼寡糖的有效劑量(以殼寡糖純品計(jì))Tab.6 Effective doses of chitosan oligosaccharide reported in literatures

在本試驗(yàn)中,殼寡糖對(duì)雜交黃顙魚完整群體生長(zhǎng)速度的有效促進(jìn)劑量為120 mg/kg,但雙因素方差分析顯示,對(duì)雄性僅80 mg/kg。與雄性相比,完整群體對(duì)殼寡糖添加量的不敏感歸因于: 本試驗(yàn)中雌性生長(zhǎng)性能,似乎與殼寡糖劑量不相關(guān)。雌性的這一表現(xiàn)令人費(fèi)解。推測(cè)成因,可能是雌性中的小規(guī)格個(gè)體,作為群體的最弱小者,受“社會(huì)性干擾”效應(yīng)的影響,生長(zhǎng)緩慢[33]。當(dāng)雌性規(guī)格差異較大,“社會(huì)性干擾”效應(yīng)更加突顯,致使殼寡糖有限的促生長(zhǎng)作用不能體現(xiàn)。在本試驗(yàn)中,以各平行初始雌性體重變異系數(shù)為協(xié)變量做協(xié)方差分析,發(fā)現(xiàn)該變量確對(duì)生長(zhǎng)有顯著影響,校正(通過回歸模型的協(xié)方差分析將協(xié)變量在19.4661%處統(tǒng)一估計(jì))后發(fā)現(xiàn),雌性生長(zhǎng)速度亦受殼寡糖劑量的顯著影響,印證了上述推測(cè)。

3.2 殼寡糖對(duì)雜交黃顙魚免疫機(jī)能的影響

在本試驗(yàn)中,不同劑量殼寡糖未能顯著改變雜交黃顙魚外周血白細(xì)胞數(shù)。事實(shí)上,外周血白細(xì)胞數(shù)未必能準(zhǔn)確反映動(dòng)物免疫力,當(dāng)動(dòng)物處于炎癥反應(yīng)或某些脅迫中,白細(xì)胞數(shù)很可能顯著提升,但不表示免疫力強(qiáng)。如在低溶氧條件下飼養(yǎng)黃顙魚,外周血白細(xì)胞數(shù)顯著高于飽和溶氧條件下,但其他指標(biāo)及攻毒結(jié)果均證明低氧導(dǎo)致黃顙魚免疫力顯著低下[34]。白細(xì)胞吞噬活性則更具參考價(jià)值。本研究結(jié)果顯示,殼寡糖顯著促進(jìn)雜交黃顙魚白細(xì)胞吞噬活性,該促進(jìn)作用主要體現(xiàn)在白細(xì)胞平均吞入細(xì)菌個(gè)數(shù)增多,而非使參與吞噬的白細(xì)胞數(shù)量升高。對(duì)巴丁魚(Pangasianodon hypophthalmus)的研究呈類似結(jié)果[30]。但有文獻(xiàn)報(bào)道不同結(jié)果,即殼寡糖能增加參與吞噬的白細(xì)胞數(shù)量[16]。同一品種(虹鱒Oncorhynchus mykiss),相近初始規(guī)格(50 g/尾和60 g/尾),周期基本一致(50d和49d)的不同報(bào)道,在殼寡糖能否增加參與吞噬的白細(xì)胞數(shù)方面,仍存在不同結(jié)果[18,35]。這可能與劑量有關(guān),即低劑量時(shí)僅影響吞噬指數(shù),高劑量時(shí)吞噬百分比也受顯著影響。

植物血凝素(PHA)為有絲分裂原,在離體時(shí)均可與淋巴T細(xì)胞膜受體結(jié)合,激活腺苷酸環(huán)化酶,升高cAMP水平,促進(jìn)DNA合成,故能刺激淋巴細(xì)胞由休止型向母型轉(zhuǎn)化。該轉(zhuǎn)化率體現(xiàn)動(dòng)物特異性細(xì)胞免疫能力,但血涂片光鏡觀察時(shí),T、B細(xì)胞難以區(qū)分,故計(jì)算總淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率[14,34]。本試驗(yàn)結(jié)果表明,殼寡糖對(duì)雜交黃顙魚特異性細(xì)胞免疫增進(jìn)作用顯著,用量0—80 mg/kg(以殼寡糖計(jì))內(nèi)作用強(qiáng)度遞增,后趨于穩(wěn)定。殼寡糖對(duì)魚類淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的影響以往未見報(bào)道。但有報(bào)道顯示,殼寡糖顯著提高了青魚(Mylopharyngodon piceus) IL-2 mRNA表達(dá)量,IL-2是T細(xì)胞生長(zhǎng)因子,能促進(jìn)T細(xì)胞活化[28],該報(bào)道從另一角度說明了殼寡糖對(duì)特異性細(xì)胞免疫有促進(jìn)作用。

溶菌酶活力是殼寡糖對(duì)魚類免疫系統(tǒng)影響的報(bào)道中最常被觀測(cè)的指標(biāo)之一,普遍發(fā)現(xiàn)殼寡糖對(duì)其有顯著促進(jìn)作用。殼寡糖對(duì)巴丁魚外周血溶菌酶活力的顯著促進(jìn)劑量為50 mg/kg[30],對(duì)虹鱒[18]、紅鰭東方鲀(Takifugu rubripes)[36]的報(bào)道中劑量較高。在本試驗(yàn)中添加80 mg/kg顯著改變?nèi)芫副然盍?與巴丁魚結(jié)果接近。

在試驗(yàn)結(jié)束時(shí),各組血清補(bǔ)體C3、C4含量未見顯著差異。這一靜態(tài)結(jié)果未必能充分反應(yīng)殼寡糖對(duì)試驗(yàn)魚補(bǔ)體系統(tǒng)的作用。原因在于: (1)外周血補(bǔ)體含量相同的情況下,免疫細(xì)胞補(bǔ)體受體的親和力可能不同;(2)已有報(bào)道顯示,飼料添加不同劑量殼聚糖投喂黃顙魚,30d時(shí)不同組間C3含量差異顯著,但投喂至60d,組間差異不再顯著[12]。本試驗(yàn)飼養(yǎng)56d,一次性取樣,可能錯(cuò)過了試驗(yàn)因素對(duì)補(bǔ)體含量影響顯著的時(shí)間點(diǎn)。

隨殼寡糖添加量增加,免疫球蛋白IgM含量的變化趨勢(shì)與溶菌酶類似,表明試驗(yàn)魚特異性體液免疫能力被提升。本試驗(yàn)場(chǎng)地為養(yǎng)殖企業(yè)生產(chǎn)基地,不便安排攻毒。殼寡糖對(duì)黃顙魚在不同病原攻毒下的保護(hù)率有待研究報(bào)道。

4 結(jié)論

在本試驗(yàn)條件下,飼料中添加殼寡糖120 mg/kg(以純品計(jì)),能顯著提高雜交黃顙魚“黃優(yōu)1號(hào)”生長(zhǎng)速度;添加40—80 mg/kg(以純品計(jì)),能顯著提高“黃優(yōu)1號(hào)”特異及非特異性免疫能力,表現(xiàn)為白細(xì)胞吞噬指數(shù)、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率、溶菌酶活力、免疫球蛋白含量的顯著提升;殼寡糖的應(yīng)用研究,應(yīng)明確聚合度或分子量,否則無法比較分析。