重組雞干擾素α 生物學(xué)活性測(cè)定方法的研究及其驗(yàn)證

高應(yīng)瑞，劉珂飛，孟鐵健，徐 鑫

（天津生機(jī)集團(tuán)股份有限公司 300384）

干擾素(IFN)是一類(lèi)具有抗病毒，影響細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和調(diào)節(jié)免疫功能等活性的蛋白質(zhì)。 根據(jù)干擾素的氨基酸結(jié)構(gòu)、抗原性和細(xì)胞來(lái)源，可將其分為三類(lèi)：IFN-a、IFN-β 和IFN-γ。據(jù)資料報(bào)道，實(shí)驗(yàn)證明，重組的雞α 干擾素在抵抗水泡性口炎病毒、勞斯肉瘤病毒、新城疫病毒、傳染性法氏囊病病毒、傳染性支氣管炎病毒、馬立克病毒、禽流感病毒等，都有明顯的效果，能顯著抑制病毒的生長(zhǎng)[1-4]。

2014 年,程福亮等人在重組雞α-干擾素的表達(dá)及其生物活性的初步研究中，應(yīng)用在CEF/VSV 細(xì)胞系上測(cè)定了重組雞α-干擾素的抗病毒效價(jià)為1.5×210 U/mg 左右[5]；2018 年，趙澤在雞、羊λ3-干擾素在家蠶中的表達(dá)及其抗病毒活性檢測(cè)中，采用微量細(xì)胞病變抑制法在VSV-GFP 系統(tǒng)上檢測(cè)所表達(dá)的重組干擾素抗病毒活性,根據(jù)Reed-Muench 法計(jì)算效價(jià)[6]。 范逸文在雞INFγ-C3d 在畢赤酵母中的表達(dá)及抗病毒活性測(cè)定中將真核表達(dá)的重組蛋白chIFN-γ 和chIFN-γ-C3d 以及實(shí)驗(yàn)室保存的原核表達(dá)的重組蛋白chIFN-γ 和chIFN-γ-C3d 進(jìn)行雞胚內(nèi)和雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)抗病毒活性比較[7]；王朋在對(duì)鴨α、γ、λ 干擾素在家蠶中的表達(dá)及其抗病毒活性檢測(cè)研究中， 同樣采用的細(xì)胞病變抑制法來(lái)測(cè)定器干擾素的生物活性， 采用的病毒體系為VSV 病毒[8]。 鄒歡在對(duì)鴨α-干擾素的真核與原核表達(dá)及生物活性的比較研究中，同樣適用了VSV 病毒體系來(lái)測(cè)定干擾素生物活性[9]。

目前我國(guó)尚無(wú)重組雞干擾素α 生物學(xué)活性測(cè)定方法國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部主編的《中華人民共和國(guó)獸用生物制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(2001 版)豬白細(xì)胞干擾素[10]、《中國(guó)藥典》“注射用重組人干擾素α1b”、“重組人干擾素α1b 注射液”都是采用細(xì)胞病變抑制法測(cè)定生物學(xué)活性[11]。 本研究參照采用目前公認(rèn)的“微量細(xì)胞病變抑制法”(簡(jiǎn)稱CPE 抑制法)，采用雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)/水皰性口炎病毒(VSV) 系統(tǒng)以及雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)/新城疫病毒(NDV)系統(tǒng)測(cè)定了同批次的8 組不同濃度的rChIFN-α 樣品生物學(xué)活性，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞和病毒

雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)參照《中國(guó)獸藥典》中“細(xì)胞單層制備法”中“雞胚成纖維（CEF）單層的制備” 方法[12]，由SPF 雞胚提取傳代而來(lái)，SPF 雞胚購(gòu)買(mǎi)于北京梅里亞維通動(dòng)物有限公司， 水泡性口炎病毒(VSV)購(gòu)買(mǎi)于中國(guó)食品藥品檢定研究院、新城疫病毒(NDV F18)由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院贈(zèng)予。

1.1.2 試劑

DMEM 培養(yǎng)基、胰蛋白酶購(gòu)自GIBCO 公司，小牛血清購(gòu)自浙江天杭生物科技股份有限公司， 其他試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 重組雞干擾素α 樣品

本實(shí)驗(yàn)測(cè)定用的重組雞干擾素α 由本公司生產(chǎn)制備， 批號(hào)為20180501，效價(jià)標(biāo)識(shí)為1.0×109IU/瓶，使用前采用生理鹽水稀釋成8 個(gè)不同濃度樣本。

1.1.4 標(biāo)準(zhǔn)品

購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院， 重組人干擾素α2b 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品，批號(hào)：270004-201301，效價(jià)為4.27×105IU/支，下稱標(biāo)化干擾素。

1.2 方法

1.2.1 CEF 細(xì)胞的原代、傳代培養(yǎng)

1.2.1.1 原代培養(yǎng)

（1）將選好的9～10 日齡的發(fā)育良好的SPF 胚用5%的碘棉消毒蛋殼氣室部位，再用酒精棉脫碘。

（2）無(wú)菌取出雞胚，放入滅菌的玻璃皿內(nèi)，用pH7.2 的PBS沖洗一次，去頭，四肢和內(nèi)臟。

（3）再用pH7.2 的PBS 沖洗兩次。

（4）用鑷子捏成小塊（2～3mm3）, 用pH7.2 的PBS 沖洗兩次。

（5） 雞胚約加4mL0.25%胰酶溶液，38℃消化30min， 期間15min 輕搖一次。

（6）消化結(jié)束，棄掉胰酶消化液，用pH7.2 的PBS 沖洗兩次，再用細(xì)胞生長(zhǎng)液沖洗一次。

（7）加入適量的細(xì)胞生長(zhǎng)液，用刻度吸管反復(fù)吹打（使細(xì)胞充分分散）。

（8）將細(xì)胞分散液倒入帶6～8 層紗布的100mL 燒杯中（過(guò)濾之前先用少許細(xì)胞培養(yǎng)液潤(rùn)濕紗布），加入適量培養(yǎng)液（40mL/胚），過(guò)濾。

（9）重復(fù)步驟⑨的操作重慮一遍。

（10）計(jì)數(shù)，要求每1mL 濾液中約含活細(xì)胞100 萬(wàn)～150 萬(wàn)個(gè)。

（11）分裝置個(gè)培養(yǎng)瓶中（5～8ml/瓶），置37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2.1.2 傳代培養(yǎng)

在顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況， 當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至鋪滿單層后，進(jìn)行細(xì)胞傳代，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS 液沖洗3 次，再加入0.25%的胰蛋白酶消化液消化3～5min，棄去消化液，加入適量的含10%小牛血清DMEM 培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)液， 用吸管充分吹打，使之從瓶?jī)?nèi)壁脫落形成細(xì)胞懸液， 吸取一半細(xì)胞懸液移至另一細(xì)胞瓶?jī)?nèi)，置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 VSV/NDV 病毒滴度測(cè)定(TCID50 法)

1.2.2.1 單層細(xì)胞制備

將CEF 細(xì)胞消化后加入適量的營(yíng)養(yǎng)液制成5×105/mL 的單細(xì)胞懸液， 用微量移液管將其加入96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板的微孔中，每孔100μl，37℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，形成單層，做病毒滴定用。

1.2.2.2 接種病毒

將長(zhǎng)好單層細(xì)胞的培養(yǎng)板各孔細(xì)胞液傾棄，用吸管把各稀釋度的VSV 病毒（或NDV 病毒）從低濃度開(kāi)始依次加入各孔中，每孔100μl，細(xì)胞對(duì)照孔不加病毒液，只加維持液。 置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育。

1.2.2.3 結(jié)果觀察

于孵育后每隔12h 在倒置顯微鏡下觀察CPE，直至病變不再變化為止，終止培養(yǎng)，然后棄去細(xì)胞培養(yǎng)板中的上清液，每孔加入染色液50μl，室溫放置30min 后，用流水小心沖去染色液，并吸干殘留水分，每孔加入脫色液100μl，室溫放置3～5min,混用后，用酶標(biāo)儀以630nm 為參比波長(zhǎng)，在波長(zhǎng)570nm 處測(cè)定習(xí)慣度，記錄測(cè)定結(jié)果。 以Reed-Muench 法[13]計(jì)算rChIFN-α 工作單位，并經(jīng)重組人干擾素α2b 校正后得到國(guó)際單位的抗病毒活性。對(duì)所測(cè)樣品進(jìn)行重復(fù)測(cè)定，方法同上，重復(fù)4 次，并對(duì)所得結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.3 微量細(xì)胞病變抑制法滴定rChIFN-α 效價(jià)

1.2.3.1 供試品溶液的制備

將供試品溶液用測(cè)定培養(yǎng)液稀釋至蛋白含量約0.1mg/mL，然后在96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，從1∶100 開(kāi)始依次做4 倍梯度稀釋，每個(gè)稀釋度做復(fù)孔，共做10 個(gè)稀釋度(1～10 孔)。

1.2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

取重組人干擾索α2b 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品，按說(shuō)明書(shū)復(fù)溶后，用營(yíng)養(yǎng)液稀釋至每lmL 含10000 單位， 在96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中， 做4倍梯度稀釋，每個(gè)稀釋度做復(fù)孔，共做10 個(gè)稀釋度（1～10 孔）。

1.2.3.3 測(cè)定法

取孵育10 日齡發(fā)育良好的SPF 雞胚。 參照《中國(guó)獸藥典》中“細(xì)胞單層制備法”中“雞胚成纖維（CEF）單層的制備”方法進(jìn)行制備雞胚成纖維細(xì)胞， 用完全培養(yǎng)液配制成每1mL 含5.0×105～6.0×105個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液。

CEF 細(xì)胞在培養(yǎng)條件下呈貼壁生長(zhǎng)狀態(tài)。 常規(guī)下細(xì)胞按1∶2～1∶4 傳代，每周2～3 次，于營(yíng)養(yǎng)液中生長(zhǎng)。 具體操作簡(jiǎn)述為：將長(zhǎng)滿單層細(xì)胞瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液棄去， 用PBS 洗2 次后消化和收集細(xì)胞，將5.0×105～6.0×105個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100μl。 于37℃、5%二氧化碳條件下培養(yǎng)18～24h。 將配制完成的供試品溶液移入接種CEF 細(xì)胞的培養(yǎng)板中， 每孔加入100μl。于37℃、5%二氧化碳條件下培養(yǎng)18～24h。棄去細(xì)胞培養(yǎng)板中的上清液。 將保存的水泡口炎病毒或雞新城疫病毒（NDV，-70℃保存） 用攻毒培養(yǎng)液稀釋至約100TCID50， 每孔100μl。 于37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)24h 第11 號(hào)孔為病毒對(duì)照，不加干擾素保護(hù)，加病毒攻擊；第12 號(hào)孔為細(xì)胞對(duì)照，不加干擾素保護(hù)，也不加病毒攻擊。

1.2.3.4 結(jié)果觀察

每隔24h 培養(yǎng)物置倒置顯微鏡下觀察。 首先觀察“細(xì)胞對(duì)照孔”和“病毒對(duì)照孔”，鏡檢病毒對(duì)照孔可見(jiàn)細(xì)胞圓縮脫落而細(xì)胞對(duì)照孔正常。 然后棄去細(xì)胞培養(yǎng)板中的上清液，每孔加入染色液50μl，室溫放置30min 后，用流水小心沖去染色液，并吸干殘留水分，每孔加入脫色液100μl[14]，室溫放置3～5min。 混勻后，用酶標(biāo)儀以630nm 為參比波長(zhǎng)， 在波長(zhǎng)570nm 處測(cè)定吸光度，記錄測(cè)定結(jié)果。

用Reed-Muench 法計(jì)算rChIFN-α 生物活性單位。 對(duì)所測(cè)樣品進(jìn)行重復(fù)測(cè)定，方法同上，重復(fù)4 次，并對(duì)所得結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析，并對(duì)兩株病毒所測(cè)得的抗病毒活性及細(xì)胞與待測(cè)樣品的不同加入方法所得結(jié)果進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 VSV / NDV TCID5050 測(cè)定結(jié)果

分別將VSV / NDV 病毒進(jìn)行TCID50 測(cè)定， 結(jié)果顯示CEF細(xì)胞上VSV 病毒TCID50 為5.0×105/0.1mL，NDVTCID50 為1.0×106/0.1mL。

2.2 兩株病毒檢測(cè)rChIFN-α 生物學(xué)活性相關(guān)性結(jié)果

用結(jié)晶紫染色法分別在兩種病毒株上(CEF/VSV 和CEF/NDV)對(duì)不同濃度干擾素樣品測(cè)定了16 組數(shù)據(jù)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，2株病毒所測(cè)rChIFN-α 抗病毒活性具有很好的相關(guān)性，r=0.9999；經(jīng)配對(duì)t 檢驗(yàn)分析，2 組數(shù)據(jù)差異無(wú)顯著意義(P=0.993726>0.05)，見(jiàn)圖1。

2.3 兩株病毒測(cè)rChIFN-α 生物學(xué)活性重復(fù)性檢測(cè)結(jié)果

圖1 兩株病毒株測(cè)定rChIFN-α 效價(jià)的相關(guān)性結(jié)果

用微量細(xì)胞病變抑制法，分別在兩種病毒株上(CEF/VSV 和CEF/NDV)對(duì)不同濃度干擾素樣品進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)，檢測(cè)4 次結(jié)果，兩種病毒株重復(fù)性均較好，CV 值均＜10%，但CEF/VSV 系統(tǒng)測(cè)定的rChIFN-α 生物學(xué)活性結(jié)果cv 值要低于CEF/NDV 系統(tǒng)，詳細(xì)結(jié)果分別見(jiàn)表1 和表2。

3 結(jié)論與討論

表1 CEF/ NDV 系統(tǒng)測(cè)定rChIFN-α 生物學(xué)活性重復(fù)性檢測(cè)結(jié)果

表2 CEF/ VSV 系統(tǒng)測(cè)定rChIFN-α 生物學(xué)活性重復(fù)性檢測(cè)結(jié)果

目前我國(guó)尚無(wú)重組雞干擾素α 生物學(xué)活性測(cè)定方法國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，干擾素的效價(jià)取決于檢測(cè)所用的細(xì)胞、病毒系統(tǒng)以及被測(cè)樣品的類(lèi)型。 而細(xì)胞病變抑制法無(wú)疑使測(cè)定干擾素小效價(jià)的唯一方法。

目前在已經(jīng)報(bào)道的重組雞干擾素α 生物學(xué)活性測(cè)定研究中，均采用的是細(xì)胞病變抑制法，主要是兩類(lèi)，一類(lèi)是以NDV 病毒作為細(xì)胞病變的攻毒毒株， 如岳敏杰在對(duì)雞干擾素α 在枯草芽孢桿菌中的表達(dá)及活性檢測(cè)中，用的攻毒病毒為NDV 病毒[15]，魏雙施也在其對(duì)重組雞α 干擾素的高效表達(dá)、 復(fù)性純化和抗病毒研究中采用了CEF/NDV 檢測(cè)系統(tǒng)[16]；另外一類(lèi)是以VSV 病毒作為病變系統(tǒng)的攻毒毒株， 如李皓洋在雞干擾素α 和γ 在家蠶中的表達(dá)及其抗病毒活性檢測(cè)中采用的CEF/VSV 系統(tǒng)等[17]。

本研究針對(duì)兩個(gè)病毒體系進(jìn)行了比較研究，表明，rChIFNα 在CEF/VSV 和CEF/NDV 兩個(gè)系統(tǒng)中所測(cè)的效價(jià)基本一致，測(cè)定rChIFN-α 樣品效價(jià)的重復(fù)性較好。 以上結(jié)果說(shuō)明了rChIFNα 的測(cè)定中CEF/VSV 系統(tǒng)測(cè)定結(jié)果的CV 值要低于CEF/NDV系統(tǒng)，且用VSV 作為攻毒株作為病變毒株更符合干擾素測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)，因此更適用于實(shí)驗(yàn)室對(duì)rChIFN-α 的生物學(xué)活性檢測(cè)。