蒙藥藍刺頭對去卵巢大鼠骨密度、脫氫表雄酮、腎上腺中芳香化酶P450的作用

趙軍 謝靜華 李昕 師建平 常虹

女性卵巢功能在其絕經(jīng)后減退致雌激素不足是公認(rèn)的絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)病因，替代雌激素療法(hstrogen replacement therapy，HRT)是治療PMOP的首選療法，其作用機制與強化骨密度(bone mineral density，BMD)和全身骨礦量有關(guān)[1-2]。鑒于女性長期服用傳統(tǒng)雌激素藥物所引起的嚴(yán)重不良反應(yīng)，因此尋找一種平穩(wěn)、安全、有效的治療方法來替代雌激素藥物對防治PMOP意義重大?；谡n題組的前期研究，本實驗通過觀察藍刺頭對去卵巢大鼠BMD、血清DHEA、腎上腺CYP450的作用，研究蒙藥藍刺頭通過調(diào)節(jié)雌激素轉(zhuǎn)化酶、前體物質(zhì)，經(jīng)ER介導(dǎo)非經(jīng)典途徑防治PMOP的作用機制，為深入探討蒙醫(yī)“補暖補精—清鎮(zhèn)赫依—固骨質(zhì)壯骨”理論，以及PMOP的有效防治提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

5月齡Wistar雌性大鼠56只，體重(280±30)g，購于內(nèi)蒙古大學(xué)實驗動物中心，合格證號：SCXK(蒙)2002-0001，飼養(yǎng)條件一致，大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7天后，開始復(fù)制去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松動物模型。

1.2 實驗藥品及試劑

蒙藥藍刺頭制劑由廣州中醫(yī)藥大學(xué)科技產(chǎn)業(yè)園有限公司提供；強骨膠囊由北京岐黃制藥有限公司提供(規(guī)格：0.25 g/粒，30粒/瓶，批號：131204)；己烯雌酚片由合肥久聯(lián)制藥有限公司提供(規(guī)格：0.5 mg/片，批號：20181020)。

DHEA試劑盒購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司(批號：201806213)；CYP450試劑盒購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司(批號：201807584)；DAB顯色試劑盒購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司(批號：1350345)；PBS緩沖液購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司(批號：1346150607)。

1.3 實驗分組及動物模型

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7天后，將56只Wistar大鼠隨機分為強骨膠囊組、蒙藥藍刺頭低、中、高劑量組、假手術(shù)組、己烯雌酚組、模型組，共7組，每組8只。制備PMOP大鼠模型，10%水合氯醛溶液350 mg/kg腹腔注射麻醉，仰臥位固定于鼠板；下腹部備皮-常規(guī)消毒-正中線2 cm開腹。腹腔底部找到宮頸-兩側(cè)子宮末端找到卵巢(注意子宮呈倒立“人”字形)-完全切除-回納腹腔內(nèi)容物-止血逐層縫合-消毒。假手術(shù)組術(shù)前準(zhǔn)備同上，開腹后僅將卵巢從腹腔提出而不切除(僅切除卵巢周圍少量脂肪組織)[3]。

1.4 造模成功的判定標(biāo)準(zhǔn)

依據(jù)文獻[4-5]觀察大鼠陰道涂片，確定造模是否成功，動物摘除卵巢后 5天，逐只進行陰道上皮角化實驗檢查，1 次/天，連續(xù)觀察動情周期 5天，陰道涂片染色后顯微鏡下觀察，均表現(xiàn)為動情間期(大量白細胞及少量上皮細胞) ，表示動物造模成功。56只PMOP動物模型全部造模成功。

1.5 藥物制備及給藥方法

造模成功大鼠飼養(yǎng)90天后開始給藥灌胃。因大鼠體重均大于200 g，故蒙藥藍刺頭低、中、高劑量組據(jù)人鼠體重比、人鼠代謝速率比計算后分別以27.500 mg/mL、13.750 mg/mL、6.875 mg/mL劑量灌胃給藥，臨床等效劑量以低劑量組為準(zhǔn)，低、中、高劑量比為1∶2∶4；己烯雌酚灌胃劑量為0.0313 mg/mL，強骨膠囊灌胃劑量為23.4375 mg/mL，均是按成人有效劑量給藥；假手術(shù)組、模型組灌胃等體積的生理鹽水，為配藥方便，按每日大鼠每1 g體重灌胃0.02 mL進行計算(因大鼠胃容積有限，因此每日灌胃在限定液體體積的情況下，考慮每日灌胃藥量)。灌胃連續(xù)90天。

1.6 檢測指標(biāo)

(1)采用顯微CT(Micro-CT)對所有大鼠右側(cè)股骨近端干骺端BMD計量學(xué)指標(biāo)進行分析；(2)大鼠血清脫氫表雄酮(dehydroepiandrosterone，DHEA)采用酶聯(lián)免疫反應(yīng)法測定；(3)行免疫組化染色法觀察大鼠腎上腺CYP450的表達，每組大鼠取5張切片(n0)，每張切片隨機選擇5個視野(n1)，在光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠的染色情況(此實驗由內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)分子生物學(xué)實驗中心協(xié)助完成)。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 右側(cè)股骨骨密度(BMD)計量學(xué)變化

模型組與假手術(shù)組相比差異顯著(P<0.01)；蒙藥藍刺頭中劑量組、假手術(shù)組、強骨膠囊組、己烯雌酚組與模型組相比差別明顯(P<0.05)；蒙藥藍刺頭高、低劑量組與模型組相比相比差別不明顯(P>0.05)；蒙藥藍刺頭中劑量組、強骨膠囊組、己烯雌酚組、假手術(shù)組與蒙藥藍刺頭高劑量組相比區(qū)別顯著(P<0.05)；蒙藥藍刺頭中劑量組、強骨膠囊組、己烯雌酚組、假手術(shù)組組間比較無統(tǒng)計學(xué)差別(P>0.05)。見表1。

表1 各組去卵巢大鼠右側(cè)股骨近端干骺端骨密度計量學(xué)結(jié)果比較

2.2 血清DHEA變化的比較

與假手術(shù)組相比，模型組血清DHEA水平顯著降低(P<0.01)。同模型組比，用藥以后藍刺頭中、高劑量組、己烯雌酚組、強骨膠囊組的血清DHEA水平均顯著升高(P<0.01)；蒙藥藍刺頭低劑量組血清DHEA水平增加，但無明顯差異(P>0.05)。與己烯雌酚組比，藍刺頭中、高劑量組血清DHEA水平升高，但差別均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與強骨膠囊組比，藍刺頭中劑量組血清DHEA水平升高，藍刺頭低、高劑量組血清DHEA水平降低，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。血清DHEA水平藍刺頭低、中、高劑量的組間比較均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。己烯雌酚組與強骨膠囊組相比，無顯著性差異(P>0.05)。見表2。

表2 各組去卵巢大鼠血清DHEA變化比較

2.3 腎上腺CYP450變化

由圖1、表3可得出，與假手術(shù)組相比，模型組腎上腺CYP450的表達明顯降低(P<0.01)。與模型組相比，蒙藥藍刺頭中、高劑量組、己烯雌酚組、強骨膠囊組腎上腺CYP450的表達均明顯增多(P<0.01)；與模型組比，藍刺頭低劑量組腎上腺CYP450的表達明顯增多(P<0.05)。與己烯雌酚組相比，強骨膠囊組、藍刺頭中劑量組腎上腺CYP450表達升高，藍刺頭低、高劑量組表達降低，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與強骨膠囊組相比，藍刺頭中劑量組腎上腺CYP450表達升高，己烯雌酚組、藍刺頭低、 高劑量組表達降低， 差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。蒙藥藍刺頭中劑量組腎上腺CYP450的表達均高于藍刺頭低、高劑量組，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，低、高劑量組間比較，差異不明顯(P>0.05)。己烯雌酚組腎上腺CYP450表達比強骨膠囊組高，但差異不顯著(P>0.05)。

注：A藍刺頭高劑量；B藍刺頭中劑量組；C藍刺頭低劑量組；D強骨膠囊組；E己烯雌酚組；F模型組；G 假手術(shù)組。

圖1 各組去卵巢大鼠光鏡下腎上腺CYP450結(jié)果觀察(免疫組化×400)

表3 各組去卵巢大鼠腎上腺CYP450表達的情況比較

3 討論

婦女圍絕經(jīng)期綜合征免疫功能低下是因為免疫活性細胞獲得不了雌激素生理劑量刺激，雌激素下降會導(dǎo)致體內(nèi)DHEA濃度明顯下降，引起神經(jīng)—內(nèi)分泌—免疫網(wǎng)絡(luò)失調(diào)[6]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，發(fā)生本病根本病機在于腎虛，尤其腎精虧虛，病位在腎、脾、肺。DHEA屬雌雄激素的前體物質(zhì)，是一種多功能的緩沖激素，對人體各個系統(tǒng)作用廣泛[7-9]。CYP450主要作用將雄烯二酮和睪酮轉(zhuǎn)化為雌酮、雌二醇(E2)[10-11]。正常骨代謝呈平衡動態(tài)，由成骨細胞介導(dǎo)骨形成與破骨細胞介導(dǎo)骨吸收相互偶聯(lián)。絕經(jīng)后婦女雌激素水平下降并逐步打破骨吸收與成骨的平衡，這是PMOP發(fā)病的主要原因[12]。蒙藥藍刺頭作為常用接骨藥之一，臨床實踐已證明，藍刺頭有壯骨、接骨愈傷的功效。蒙醫(yī)在治療骨折時慣用內(nèi)服蒙藥藍刺頭復(fù)方制劑、煎劑，療效明顯。植物雌激素(phytoestrogen，PE)活性物質(zhì)具有弱雌激素樣作用，可補充女性部分雌激素以減少絕經(jīng)后骨量丟失，可作為替代傳統(tǒng)雌激素的療法，為PMOP的防治提供一種較有效、安全的新方法。蒙藥藍刺頭可通過調(diào)節(jié)雌激素樣作用，促進骨形成，調(diào)節(jié)成骨、骨吸收偶聯(lián)，減少骨轉(zhuǎn)換率，從而達到防治PMOP的目的[5，13-15]。

實驗結(jié)果顯示：與假手術(shù)組相比，模型組腎上腺CYP450的表達明顯降低(P<0.01)。與模型組相比，蒙藥藍刺頭中、低、高劑量組、己烯雌酚組、強骨膠囊組腎上腺CYP450的表達均明顯增多(P<0.05)。與己烯雌酚組相比，強骨膠囊組、藍刺頭中劑量組腎上腺CYP450表達升高，藍刺頭低、高劑量組表達降低，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。得出結(jié)論，藍刺頭與西藥、對照藥作用相同，都可加強CYP450在腎上腺的表達；蒙藥藍刺頭適當(dāng)濃度具有增強CYP450腎上腺的表達作用；本研究從大鼠腎上腺角度說明蒙藥藍刺頭具類雌激素樣作用，對防治PMOP具有一定優(yōu)勢。

綜上所述，在前期課題研究基礎(chǔ)上，本研究通過觀察蒙藥藍刺頭對PMOP大鼠血清DHEA、BMD、腎上腺CYP450表達的作用，表明蒙藥藍刺頭具有調(diào)節(jié)促進雌激素轉(zhuǎn)化酶、前體物質(zhì)高效表達作用，對PMOP大鼠OP治療作用顯著；防治PMOP通過調(diào)節(jié)雌激素介導(dǎo)非經(jīng)典途徑；同時，雌激素可促成骨細胞形成，進而防治PMOP。芳香化酶為雌激素形成的限速酶，其可減少局部組織的活性，并降低該組織雌激素水平，進而引起OP的發(fā)生，而人工干預(yù)芳香化酶表達依賴于深入研究其基因機制，從而有利于通過干預(yù)芳香化酶防治OP。當(dāng)前需要對其機制進行進一步深入研究，以揭開其分子機制，為深入探討中醫(yī)“腎主骨”理論、防治PMOP提供一定的實驗依據(jù)，并進一步指導(dǎo)臨床。