實(shí)時熒光定量PCR在高危型HPV感染檢測中的應(yīng)用價值

樊曉陽

(新野縣人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科，河南 南陽 473500)

人乳頭瘤病毒(human papilloma virus，HPV)為乳多空病毒科A亞群內(nèi)的一組DNA病毒，HPV感染較常見。據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，60%～70%女性感染過HPV，99.8%宮頸癌患者HPV檢測呈陽性[1-2]。大量研究結(jié)果表明，HPV感染在女性宮頸疾病發(fā)生發(fā)展中具有關(guān)鍵作用，而高危型HPV感染為癌前病變、宮頸癌發(fā)生的必要條件，及早檢測診斷是疾病防治的關(guān)鍵[3-4]。第二代雜交捕獲試驗(yàn)(hybrid capture-Ⅱ，HC-Ⅱ)為近年來臨床常用診斷技術(shù)，相對于第一代雜交捕獲試驗(yàn)，HC-Ⅱ檢測工作效率更高，成本更低，適用于高危HPV感染篩查，并具有一定診斷效果，但在鑒別病變類型等方面整體效果欠佳。隨著分子醫(yī)學(xué)的發(fā)展，PCR檢驗(yàn)技術(shù)在臨床得到廣泛關(guān)注，實(shí)時熒光定量PCR作為新型核酸定量檢測方法，將普通PCR高靈敏性、DNA雜交高特異性、光譜技術(shù)高精確性進(jìn)行有機(jī)結(jié)合，克服了傳統(tǒng)PCR的不足，檢測差異性較小，檢測結(jié)果具有良好相關(guān)性。基于此，本研究對198例高危型HPV感染患者的臨床資料進(jìn)行回顧性分析，探討實(shí)時熒光定量PCR檢驗(yàn)的診斷價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2018年2月至2019年12月新野縣人民醫(yī)院收治的198例高危型HPV感染患者，年齡27～69歲，平均(36.75±4.52)歲，體質(zhì)量指數(shù)17～25 kg·m-2，平均(22.16±1.05)kg·m-2，67例患者存在不同程度宮頸病變，其中宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN) Ⅰ級36例，CIN Ⅱ級21例，CIN Ⅲ級10例，64例為鱗狀上皮病變和慢性宮頸炎。

1.2 選取標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1納入標(biāo)準(zhǔn) (1)已婚或有性生活史女性；(2)一般資料完整；(3)依從性良好，可配合檢查；(4)無溝通交流障礙；(5)同時接受實(shí)時熒光定量PCR檢驗(yàn)、HC-Ⅱ檢測。

1.2.2排除標(biāo)準(zhǔn) (1)合并其他生殖系統(tǒng)疾?。?2)存在認(rèn)知障礙或既往有嚴(yán)重精神疾??；(3)合并生殖系統(tǒng)或其他系統(tǒng)傳染性疾病。

1.3 檢測方法

1.3.1實(shí)時熒光定量PCR檢驗(yàn) 使用擴(kuò)陰器充分暴露宮頸口，使用棉拭子擦拭干凈分泌物，將宮頸刷緩慢送至宮頸口，逆時針轉(zhuǎn)動4～5圈，后將宮頸刷置入含有保存液的洗脫管中，做好標(biāo)記，管蓋旋緊，折斷宮頸刷，使刷頭留置在管中。將收集的宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本置入微量離心管(1.5 mL)，離心(13 000 r·min-1，10 min)處理，棄上清液，加入50 μg裂解液懸浮沉淀，100 ℃環(huán)境下加熱10 min，離心(13 000 r·min-1，10 min)處理，保留上清液，待用。PCR擴(kuò)張，50 ℃ 15 min，90 ℃ 10 min，40個55～95 ℃循環(huán)，使模板DNA加熱到95 ℃，雙鏈DNA解離為單鏈。將PCR產(chǎn)物加入雜交緩沖液，沸水浴變性10 min，51 ℃環(huán)境下，雜交1 h，洗脫15 min。POD孵育洗滌，顯色。循環(huán)閾值(cycle threshold，Ct值)<37為陽性，反之為陰性。

1.3.2HC-Ⅱ檢測 使用Digene公司的HPV DNA檢測試劑盒，行細(xì)胞標(biāo)本雙鏈解鏈操作，采用RNA探針行雜交處理，后生成雜交體與特異性抗體結(jié)合，結(jié)合發(fā)光強(qiáng)度、大小定量測定，計(jì)算負(fù)荷量。HPV負(fù)荷量≥1.0 μg·L-1即為陽性，反之為陰性。

1.4 觀察指標(biāo)(1)實(shí)時熒光定量PCR檢驗(yàn)、HC-Ⅱ檢測HPV陽性檢出率和符合率。(2)實(shí)時熒光定量PCR檢驗(yàn)、HC-Ⅱ檢測不同病變類型檢出情況。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料(陽性檢出率、符合率、不同病變類型檢出率)以率(%)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，采用Kappa指數(shù)進(jìn)行一致性檢驗(yàn)，其中Kappa指數(shù)>0.75表示一致性極好，Kappa指數(shù)0.4～0.75表示一致性較好，Kappa指數(shù)<0.4表示一致性差。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 陽性檢出率和符合率實(shí)時熒光定量PCR檢驗(yàn)HPV陽性檢出率(75.25%)較HC-Ⅱ檢測(62.63%)高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；實(shí)時熒光定量PCR檢驗(yàn)、HC-Ⅱ檢測符合率為83.33%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 陽性檢出率和符合率

2.2 不同病變類型檢出情況實(shí)時熒光定量PCR檢驗(yàn)和HC-Ⅱ檢測CIN Ⅰ級、CIN Ⅱ級、CIN Ⅲ級宮頸病變檢出率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)；實(shí)時熒光定量PCR檢驗(yàn)鱗狀上皮病變和慢性宮頸炎檢出率較HC-Ⅱ檢測高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見表2。

表2 不同病變類型檢出情況[n(%)]

3 討論

宮頸癌為婦科常見惡性腫瘤，在女性生殖器官惡性腫瘤中占50%以上，在女性相關(guān)癌癥中致死率僅次于乳腺癌，HPV在宮頸癌患者中多呈陽性，且病變程度越高，HPV檢出率越高[5-6]。高危型HPV感染和宮頸癌關(guān)系密切，但宮頸癌癌前病變期較長，癌前病變過程中采用有效醫(yī)學(xué)干預(yù)是逆轉(zhuǎn)病變的關(guān)鍵。早期進(jìn)行HPV檢測，針對個體不同癌前病變階段給予阻斷性治療，治愈率高達(dá)98%，但若在癌前病變可逆轉(zhuǎn)階段未給予干預(yù)措施，發(fā)展為癌癥或擴(kuò)散至其他器官，5 a存活率僅為20%，故針對高危型HPV感染早期進(jìn)行臨床診斷對預(yù)防宮頸癌及臨床治療有積極意義[7]。

鑒于HPV無法進(jìn)行體外培養(yǎng)，且無合適實(shí)驗(yàn)動物，臨床對高危HPV檢測多采用形態(tài)學(xué)方法、分子生物學(xué)技術(shù)。HC-Ⅱ檢測可通過抗體捕獲信號、化學(xué)發(fā)光信號檢測HPV感染，但因采樣不正確或病毒感染水平低等因素影響，易出現(xiàn)假陰性，影響臨床診斷結(jié)果。且HC-Ⅱ檢測無法有效區(qū)分鑒別HPV具體類型，而HC-Ⅱ所存在的交叉雜交問題，易與不在混合探針中其他HPV型發(fā)生交叉反應(yīng)，產(chǎn)生假陽性結(jié)果，在指導(dǎo)臨床診斷治療中整體效果欠佳。實(shí)時熒光定量PCR檢驗(yàn)將熒光標(biāo)志技術(shù)、PCR技術(shù)相結(jié)合，以基因擴(kuò)增為檢測的基礎(chǔ)，檢測結(jié)果不受病毒感染水平影響，對低水平病毒感染患者同樣具有良好診斷效果，可提高陽性檢出率，避免漏診[8]。陳麗等[9]探討實(shí)時熒光定量PCR檢測HPV的應(yīng)用價值，通過應(yīng)用實(shí)時熒光定量PCR和HC-Ⅱ?qū)m頸組織標(biāo)本進(jìn)行HPV DNA檢測，結(jié)果顯示203例患者實(shí)熒光定量PCR檢出率高于HC-Ⅱ檢驗(yàn)。時秀云等[10]對224例高危型HPV感染患者分別進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR檢驗(yàn)和HC-Ⅱ檢驗(yàn)，結(jié)果顯示實(shí)時熒光定量PCR檢測鱗狀上皮病變和慢性宮頸炎患者檢出率高于HC-Ⅱ檢驗(yàn)。本研究針對高危型HPV感染患者采用實(shí)時熒光定量PCR檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，實(shí)時熒光定量PCR檢驗(yàn)HPV陽性檢出率較HC-Ⅱ檢測高，與上述研究結(jié)果一致。同時，本研究中實(shí)時熒光定量PCR檢驗(yàn)、HC-Ⅱ檢測符合率為83.33%，可見熒光定量PCR檢驗(yàn)、HC-Ⅱ檢測診斷一致性較好，但與HC-Ⅱ檢測相比，實(shí)時熒光定量PCR檢驗(yàn)陽性檢出率高。同時，實(shí)時熒光定量PCR檢驗(yàn)應(yīng)用全自動熒光定量擴(kuò)增分析儀擴(kuò)增，可減少人為擴(kuò)增工作量，提高工作效率，并能避免人為因素影響檢測結(jié)果準(zhǔn)確性，可準(zhǔn)確檢測出不同亞型HPV DNA水平，準(zhǔn)確判斷患者感染狀況，彌補(bǔ)HC-Ⅱ檢測在病變類型鑒別中的不足，為臨床提供更多疾病信息，指導(dǎo)臨床診治[10]。本研究數(shù)據(jù)還表明，實(shí)時熒光定量PCR檢驗(yàn)鱗狀上皮病變和慢性宮頸炎檢出率較HC-Ⅱ檢測高，表明實(shí)時熒光定量PCR可提高病變類型檢出效果。

綜上所述，實(shí)時熒光定量PCR、HC-Ⅱ檢測應(yīng)用于高危型HPV感染患者中一致性較好，但實(shí)時熒光定量PCR陽性檢出率、鱗狀上皮病變和慢性宮頸炎檢出率較高，對臨床制定針對治療方案、改善患者預(yù)后有積極意義。